CC BY
33
Известия ТСХА, выпуск 1, 2007 год
УДК: 573.6:631.527.8:635.345
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ К КИЛЕ (PLASMODIOPHORA BRASSICAE WORJ В СЕЛЕКЦИИ КАПУСТЫ ПЕКИНСКОЙ (BRASSICA RAPA L.)
С.Г. МОНАХОС , А.Н. ИГНАТОВ * (Селекционная станция имени Н.Н. Тимофеева)
На основе RAPD маркера одного из генов устойчивости к киле (RA12-75A) у Brassica тара L. разработан ко-доминантный маркер SCARp91F-SCARp636R, пригодный для дифференциации устойчивых и восприимчивых генотипов в популяциях, полученных от скрещивания линий европейской репы и капусты пекинской. Вместе с тем выявлена неэффективность как RAPD маркера RA12-75A, так и созданного на его основе ко-доминантного маркера SCARp91F-SCARp636R при идентификации устойчивых растений в популяциях, полученных от скрещивания устойчивой и восприимчивой к киле репы.
Кила крестоцветных (возбудитель — Plasmod.io'phora brassicae Wor.) — одно из наиболее вредоносных заболеваний всех видов семейства Капустные, включая Brassica тара L. [3]. Патоген поражает корневую систему растений, вызывая разрастание паренхимной ткани корней и образование «желваков» [9]. Пораженные корни не справляются с поглощением воды и питательных веществ из почвы, что приводит к увяданию, задержке роста и в конечном итоге к гибели растения [1].
Агротехнические приемы: внесение в почву кальция, бора и известкование, способствующие увеличению pH, снижают заболеваемость, но их все равно недостаточно для получения полноценного урожая [14]. Борьба с килой с помощью многопольных севооборотов неэффективна из-за длительного сохранения в почве спор, а также увеличения их числа вследствие размножения на крестоцветных сорняках. Применение пестицидов ограничено из-за отсутствия экономически доступного и экологически безвредного фунгицида для внесения в почву [7]. Наиболее
* Центр «Биоинженерия» РАН.
целесообразным способом борьбы с килой крестоцветных является выведение и возделывание устойчивых сортов и гибридов.
В селекции капусты пекинской на устойчивость к киле крестоцветных, как правило, используют европейские кормовые репы (European fodder turnips) [5, 15, 10], устойчивость которых контролируется 3 доминантными независимо наследуемыми генами [12, 4].
По сведениям японских исследователей, устойчивость, определяемая отдельными генами, при интродукции в капусту пекинскую частично или полностью преодолевается патогеном [10], и большинство выведенных сортов при неоднократном возделывании на одном участке со временем становятся восприимчивыми. Для решения этой проблемы и обеспечения надежной защиты растений необходимо объединение всех 3 генов в одном генотипе, что реально выполнимо только при использовании молекулярных маркеров [11, 8].
Первые результаты по маркированию представлены в [11]. В дигаплоид-
ных популяциях, полученных из F t потомства от скрещивания устойчивой линии кормовой репы и восприимчивой капусты пекинской, были найдены 3 RAPD маркера, связанные с генами устойчивости к киле. В Центре «Биоинженерия» РАН на популяциях ВС! и F2 от скрещивания устойчивой репы и восприимчивой капусты пекинской была подтверждена эффективность и соответственно пригодность для селекции одного из предложенных маркеров (RA12-75A650). Однако некоторые недостатки RAPD технологии, такие как низкие стабильность и воспроизводимость результатов, а также типично доминантная природа маркера, не позволяющая выявлять гетерозиготы, ограничивают ее эффективность при использовании в селекции. Для решения этой проблемы на основе RAPD маркеров разрабатывают лишенные этих недостатков SCAR (sequence characterized amplified region) маркеры.
Цель работы — изучить возможность конвертирования RAPD маркера RA12 - 7 5 65о доминантного гена устойчивости к киле в соответствующий доминантный / ко-доминантный SCAR маркер и оценить его эффективность на различных популяциях пекинской капусты и репы.
Материалы и методы
Растительный материал. Размножение растений и оценка устойчивости к киле крестоцветных были проведены на Селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева МСХА в зимней остекленной теплице; молекулярный анализ — в Центре «Биоинженерия» РАН в лаборатории «Генома растений» в 2002-2004 гг.
В качестве донора генов устойчивости к киле использовали растения линии ECD04-1, полученной в результате 2 циклов самоопыления европейской линии-дифференциатора ECD04; в качестве донора аллелей восприимчивости — растения линии JRT1-1, отобранной из потомства 2-го инбредного поколения азиатской репы Just Right
Turnip, и растения инбредной линии капусты пекинской Се-3, полученной из сорта зарубежной селекции «Sensor».
Оценка устойчивости / восприимчивости к киле. Оценку устойчивости к киле проводили на искусственном инфекционном фоне. Индекс расового состава использованной полевой популяции патогена определяли в соответствии с реакцией европейских сортов-дифференциаторов (ЕСД) [6] — 16/11/31. Для заражения использовали суспензию спор с концентрацией 107 спор/мл.
Посев проводили в кассеты, на глубину 0,5 см с немедленным внесением суспензии спор килы, используя модификацию пипеточного метода [13]. Учет устойчивости растений проводили через 6 недель. За устойчивое принимали растение без малейших признаков поражения килой.
Молекулярный анализ. Выделение геномной ДНК проводили из молодых тканей по методике [2]. Амплификацию геномной ДНК проводили на амплифи-каторе ABS-2000 (Applied Biosystems) в 15 мкл реакционной смеси, содержащей буфер (67 мМ трис-HCl рН-8,8; 166 мМ (NH4)2S04; 2,5 мМ MgCl2; 0,01% Твин-20), по 0,2 мМ каждого dNTP, 5-15 пМ соответствующего праймера-(ов), 20 нг геномной ДНК и 0,5 ед. Taq-полимеразы; праймер RA12-75 — 5' -CATTATGCGGGC-3'. RAPD амплификацию проводили по следующей программе: 3 мин при 94°С; 35 циклов: 94°С — 30 с, 36°С — 30 с, 72°С — 1 мин; 72°С — 10 мин. SCAR амплификацию — 3 мин при 94°С; 35 циклов: 94°С — 15 с, 64°С — 15 с, 72°С — 1 мин; 72°С — 5 мин.
Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,5 %-м агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, и трис-ацетат-ЭДТА элек-трофорезном буфере (RAPD при напряженности 4 Вт/см в течение 120 мин; SCAR при напряженности 6 Вт/см в течение 30 мин). Целевой фрагмент RAPD маркера ре-амплифицировали и
элюировали из геля легкоплавкой ага-розы. Клонирование RAPD фрагмента проводили с помощью набора pGEM_T Vector System 1 {«Promega», USA) согласно инструкции фирмы производителя. Полученными препаратами плаз-мидной ДНК проводили трансформацию компетентных клеток Е. сой. Рекомби-нантные клоны отбирали методом «бело-голубой» селекции. Отобранные клоны размножали с последующим выделением плазмидной ДНК.
После проведения ПЦР (амплификация ДНК-клонов с праймером RA12-75) и рестрикционного (разрезание плазмид по сайтам рестрикции, фланкирующим вставку с 2 концов) анализа плазмид на наличие вставки целевого фрагмента его секвенирова-ли с помощью автоматического секве-натора 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Co., USA). Полученную последовательность фрагмента ДНК проверили на сходство с известными последовательностями в базе данных Генбанка (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ GenBank). Подбор специфичных праймеров проводили с использованием программы OLIGO 6.1 (Molecular. Biology Insights, Cascade, USA).
Результаты
В результате проведенной RAPD амплификации с использованием прай-мера RA12-75 выявлено отсутствие полиморфизма по целевому фрагменту массой 650 п.н. между устойчивой европейской (ECD04-1) и восприимчивой азиатской (JRT1-1) репами, в то же время проявляется четкий полиморфизм по маркерному локусу между линиями устойчивой репы ECD04-1 и восприимчивой капусты пекинской Се-3 (рис. 1).
RAPD маркер RA12-7 5650, сцепленный с признаком устойчивости к киле, был амплифицирован, разделен от других амплифицированных фрагментов в агарозном геле и выделен для клонирования.
12345678М
ШШ fS ^^
mm- m<m ШЩ ШЩ ЩЩ ^ ^ ^ ■ mm Щ
ФЩ f?5 » • ■ ....
<м Щ *
Рис. 1. RAPD фрагмент (650 п.н.), ампли-фицированный с праймером RA12-75 (5'-CATTATGCGGGC-3'), сцепленный с геном устойчивости к киле. 1-4 — устойчивые образцы репы ECD04-1, 5-8 — восприимчивые образцы пекинской капусты Се-3, М — маркер молекулярной массы
Данный фрагмент был клонирован и секвенирован. Сравнение секвениро-ванной последовательности локуса RA12 - 7 5 650 с базой данных Генбанка показало, что данная последовательность с 5'-конца представлена фрагментом, гомологичным участку клона T24I21 хромосомы 2 Arabidopsis thaliana.
В то же время З'-конец локуса RA12 - 7 5 650 состоял из 2 вырожденных повторов, сходных с фрагментом клона AJ_245480 B.napus, кодирующим S-аденозил метионин салициловой кислоты карбоксил метионил трансфера-зу и ген гликопротеина S-локуса, фланкированными с 3'- конца участком LTR ретротранспозона.
На основе известной последовательности RAPD-локуса RA12 - 7 5 650 были разработаны 6 специфичных праймеров: 3 прямых — SCARplF, SCARp50F, SCARp91F и 3 обратных — SCARp406R, SCARp463R, SCARp636R (таблица).
Возможные комбинации синтезированных SCAR праймеров показали раз-
Специфичные к RAPD-локусу RA12-75650 праймеры, использованные в данном исследовании
Праймер
5'~3' последовательность
>SCARp1F GGA ТСС ATT ATG CGG GCA GTT AG
>SCARp50F СТА GTT AAA TGG CTC TGC GGT TG
>SCARp91 F GAG CTT GAT CTG CTG CCA TCG G
>SCARp406R CAC GCG ATG AAT ATG АТС CTT AG
>SCARp463R GGA TTG GGA GGT ATG TGG TAG AG
>SCARp636R ATG CGG GCC AGC CAA TTA GGC
личную эффективность при идентификации восприимчивых (Се-3) и устойчивых (ECD04-1) генотипов (рис. 2).
Две пары специфичных праймеров SCARp91F — SCARp636R и SCARp50F —
SCARp636R при оптимизированных условиях ПЦР дали ко-доминантные фрагменты, выявляющие как восприимчивый, так и устойчивый генотипы (рис. 2).
Рис. 2. SCAR фрагменты, полученные в результате амплификации S-восприимчивых (Се-3) и R-устойчивых (ЕСД04-1) образцов с различными комбинациями праймеров: 1 — SCARp1f-SCARp406r; 2 — SCARp1f-SCARp463r; 3 — SCARp1f-SCARp636r; 4 — SCARp50f-SCARp406r; 5 — SCARp50f-SCARp463r; —SCARp50f - SCARp636r; 7—SCARp91 f-SCARp406r: 8 — SCARp91f-SCARp463r, 9 — SCARp91f-SCARp636r; 6 и 9 — комбинации, давшие ко-доми-нантные фрагменты, выявляющие устойчивые (вертикальные стрелки) и восприимчивые (горизонтальные стрелки) генотипы; М — маркер молекулярной массы
Ко-доминантная природа полученных маркеров, необычная для SCAR, была обусловлена наличием 2 вырожденных повторов на З'-конце целевого фрагмента у устойчивого генотипа (репы) и 1 —у восприимчивого генотипа (пекинской капусты).
Испытание синтезированных специфичных праймеров показало, что один
из маркеров (комбинация SCARp91F-SCARp636R) позволяет четко различать генотипы устойчивых образцов европейской репы ECD04-1 от генотипов восприимчивых образцов капусты пекинской Се-3, но является неэффективным при анализе устойчивости в популяциях азиатской репы JRT1-1 (рис. 3).
1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 М 11 12 13 14 15
Рис. 3. Эффективность комбинации SCARp91F — SCARp636R при различении устойчивых и восприимчивых генотипов: 1-5 — образцы устойчивой линии ECD04-1; 6-10 — образцы восприимчивой линии Се-3; 11-15 — образцы восприимчивой линии JRT1-1; М — маркер молекулярной массы
Выводы
1. Разработанный ко-доминантный SCAR маркер одного из генов устойчивости к киле эффективен при идентификации устойчивого и восприимчивого генотипов в популяциях от скрещивания восприимчивой капусты пекинской с устойчивой репой, однако непригоден для анализа потомств от скрещивания европейской (ECD04-1) и азиатской (JRT1-1) реп.
2 Данный маркер может быть использован при поиске маркеров к двум другим генам устойчивости к киле у Brassica rapa L.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов Ю.П. Сократить потери от килы// Защита растений, 1984. № 9. — 2. Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов // Молекулярная генетика, 1997. Т. 33. №4. С. 443-450. — 3. Кравченко В.И., Боос Г.В., Сурмава М.Е. Характеристика генофонда капусты по устойчивости к Plasmodiophora brassicae // Тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1982. Т. 72. Вып. 3. С. 113-120. — 4. Монахос Г.Ф., Теренина Н.С. Генетические источники устой-
чивости к киле крестоцветных (Plasmo-diophora brassicae Wor.) при селекции пекинской капусты / Изв. ТСХА, 1998. Вып. 3. С. 87-93. — 5. Ashikawa М., Yoshikawa Н., Hi-da К. //Bull, of the Veg. and Orn. Crop Res. St. 1980. P. 35-73. — 6. Buczacki S., Toxopeus H., Mattusch P. et al. // Trans. Br. mycol. Soc., 1975. P. 295-303. — 7. Crisp P., Crute I.R., Sutherland R.A., et al. // Euphytica, 1989. 42. P. 215226. — 8. Hirai М., Harada Т., Kubo N. et al. // Theor. Appl. Genet, 108, 2004. P. 639-643. — 9. Ikegami H., Ito Т., Imuro У. et al. / N.S. Tale-kar, T.D. Griggs (Eds), Chinese cabbage. Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, 1981. P. 81-90. — 10. Kuginuki Y., Yoshikawa H., Hida K. // ISHS Symposium on Brassicas, Abstracts of 9 th Crucifers genetics workshop. Lisbon, 1994. — 11. Kuginuki Y., Ajisaka H., Yui M. et al. // Euphytica. 1997. P. 149-154. — 12. Toxopeus H., Janssen A. // Euphytica, 24. 1975. P. 751-755. — 13. Voo-rips R.E., Visser D.L. // Neth. J. PI. Pathol. 99, 1993. P. 269-276,— 14. Voorips R.E. // Euphytica, 1995. V. 83. P. 139-146. — 15. Yoshikawa H. / N.S. Talekar, T.D. Griggs (Eds.), Chinese Cabbage. Proceedings of the 1st International Symposium, Tsukuba, Japan. 1981. P. 405-413.
SUMMARY
Random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker RA12-75A linked to a clubroot-resistance locus of Brassica rapa L. was converted into co-dominant marker SCARp91F-SCARp636R useful for differentiation of susceptible and resistant genotypes in populations from cross of lines of European turnip (ECD04-1 — donor of resistance genes) and Chinese cabbage. But ineffectiveness both RAPD locus RA12-75A and the developed SCARp91F-SCARp636R marker, was shown for hybrid population obtained from resistant and susceptible plants of turnip.
