CC BY
20
УДК 579.61: 616.316-092
Семанюк Н.В. *
E-mail: [email protected] Льв\вський нацюнальнийутеерситет еетеринарногмедицини та бютехнологт ¡мет С.З. Тжицького, вул. Пекарсъка, 50, м. Львгв, 79050, Украгна
ВИКОРИСТАННЯ М1КРОБНИХ БЮПЛ1ВОК У Д1АГНОСТИЦ1 ХРОН1ЧНОГО КАТАРАЛЬНОГО Г1НГ1В1ТУ У СОБАК
У результатi проведених дослгджень встановлено, що з наростанням важкост1 хронгчного катарального гirnieimy у зубному нальот1 собак збшъшуетъся nopiennno гз контрольною групою кглъкгстъ мтрооргатзм1в, що утворюютъ бгоплгвку: за легкого ступеня хворобы цей показник збшъшуетъся у 1,47 раза, за середнъого - у 2,31 г за важкого ступеня - у 2,86 раза. 1з зростання важкост1 хворобы в1дбуваетъся eipozidne (Р<0,05 - Р<0,001) накопиченням у бюпл\вках низъког щыъност1 екстрацелюлярного матриксу i створюютъся умови для формування цими ж мтрооргашзмами 6iomieoK середнъог i высоког щыъност1. У порядку зниження насыченост1 6iomieoK высоког щыъност1 мжрооргатзми, ят були гзолъоват гз зубного налъоту, розташувалисяу такому порядку: E. coli, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp., Acinetobacter spp. i Micrococcus spp. Саме тому, впровадження дослгдженъ гз визначення мгкробних 6iomieoK у ветеринарну стоматологт, у тому числ1 г д1агностику важкост1 перебйу хронгчного катарального zinzieimy у собак, сприятиме npaernbHoemi постановки дгагнозу, суттево розширитъ уявлення щодо патогенезу захворювання, а також надастъ можливктъ адекватно призначати етютропну тератю та оцтювати ггефективтстъ.
Ключовг слова: мжробт бюпл\вки, щыътстъ, хротчний катаралъний 2iH2ieim, собаки, МАФАнм, легкий стутнъ, середши стутнъ, важкий стутнъ.
УДК 579.61: 616.316-092
Семанюк Н.В. *
Львовский националъныйуниверситет ветеринарноймедицины и биотехнологий имени С.З. Гжицъкого, ул. Пекарская, 50, г. Львов, 79050,
Украина
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНЫХ БИОПЛЕНОК В ДИАГНОСТИКЕ ХРОНИЧЕСКОГО КАТАРАЛЬНОГО ГИНГИВИТА У СОБАК
В результате проведенных исследований установлено, что с нарастанием тяжести хронического катарального гингивита в зубном налете собак увеличивается в сравнении с контрольной группой количество микроорганизмов, которые образуют биопленку: при легкой степени болезни этот показатель увеличивается в 1,47раза, за среднего - в 2,31 и при тяжелой степени - в 2,86 раза. С ростом тяжести болезни происходит достоверное (Р<0,05 - Р<0,001) накопление в биопленках низкой плотности экстрацеллюлярного матрикса и создаются условия для формирования этими же микроорганизмами биопленок средней и высокой плотности. В порядке
299
снижения насыщенности биопленок высокой плотности микроорганизмы, которые были изолированы из зубного налета, расположились в таком порядке: E. coli, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp., Acinetobacter spp. и Micrococcus spp. Именно поэтому, внедрение исследовании биопленок в ветеринарную стоматологию, в том числе и диагностику тяжести протекания ХКГу собак, будет способствовать правильности постановки диагноза, существенно расширит представление о заболевании, а также предоставит возможность адекватно назначать этиотропную терапию и оценивать ее эффективность.
Ключевые слова: микробные биопленки, плотность, хронический катаральный гингивит, собаки, мафанм, легкая степень, средняя степень, тяжелая степень.
UDC 579.61: 616.316-092
Semaniuk N.V.
Lviv national university of veterinary medicine and biotechnologies named after S. Z. Gzhytskyj, 50, Pekarska St., Lviv, 79010, Ukraine
DOGS HAVE THE USE OF MICROBIAL BIOFILMS IN DIAGNOSTICS OF CHRONIC CATARRHAL GINGIVITIS
It is set as a result of the conducted researches, that with growth of weight of chronic catarrhal gingivitis in the dental raid of dogs increases by comparison to a control group amount of microorganisms which form a biofilm: at the easy degree of illness this index increases in 1,47 times, for middle - in 2, 31 and at a heavy degree -in 2,86 times. From the increase of weight of illness there is a reliable (P<0,05 -P<0,001) accumulation in the biofilms of low-density of extracellulary matrice and terms are created for forming of biofilms of middle and high closeness the same microorganisms. In the order of decline of saturation of biofilms of high-density microorganisms which were isolated from a dental raid were situated in such order: E. coli, Staphylococcus of spp., Enterococcus of spp., Corynebacterium of spp., Pseudomonas of aeruginosa, Streptococcus of spp., Acinetobacter of spp. and Micrococcus of spp. For this reason, introduction of researches from determination of microbal biofilms in veterinary stomatology, including diagnostics of weight of motion of chronic catarrhal gingivitis for dogs, will assist the rightness of raising of diagnosis, substantially will extend presentation in relation to pathogeny of disease, and also will give possibility adequately to appoint etiotropic therapy and estimate her efficiency.
Key words: microbal biofilms, closeness, chronic catarrhal gingivitis, dogs, мафанм, easy degree, middle degree, heavy degree.
Висока розповсюджешсть хрошчного катарального гшпвпу у собак е предметом дослщжень як в1тчизняних, так i закордонних науковщв [1, 3, 6]. Д1агностика хвороби не становить труднощ1в, проте встановлення важкост1 nepe6iry хвороби за хрошзаци процесу вимагае додаткових дослщжень. В ix основ! повинен домшувати мжробюлопчний чинник, оскшьки ротова порожнина, через наявшсть у нш достатньо! кшькост1 вологи i поживних
300
речовин, е сприятливим бютопом для м1крооргашзм1в, яю забезпечують onip оргашзму тварин колошзаци алохтонними патогенними i потенцшно патогенними мкрооргашзмами. Будь-як1 спроби прибрати мкрофлору не лише даремш, але й шюдлив1, оскшьки вони можуть призвести до дисбюзу [4]. Виникае дисбюз i за колошзаци ротово! порожнини хвороботворними мжрооргашзмами або надм1рного росту окремих представниюв нормофлори, що спричиняе до вщкладання на зубах зубного нальоту i формування мжробно! бюпл1вки [2]. У склад1 бюпл1вок кл1тини бактерш, об'еднаш складними м1жкл1тинними зв'язками, здшснюють регуляцш експреси гешв у р1зних частинах бюпл1вок. Це дае пщставу популяцш бактерш, яю утворюють бюпл1вку, розглядати як функцюнальний аналог багатокл1тинного оргашзму, у якому мшрооргашзми за рахунок матриксу пщтримують «вщчуття кворуму» [7]. У склад1 бюпл1вок мжрооргашзми в 100-1000 раз1в стшюш1 до дп дезшфшуючих речовин, антибактер1альних препараив, бактерюфапв, антитш i фагоциив [5].
Саме тому, впровадження дослщжень з визначення мжробних бюпл1вок у ветеринарну стоматологш, зокрема i д1агностику важкост1 nepeöiry ХКГ у собак, сприятиме правильное^ постановки д1агнозу, суттево розширить уявлення про захворювання, а також надасть можливкть адекватно призначати етютропну терапш та оцшювати И ефектившеть.
Метою роботи було дослщити можливкть використати як д1агностичний тест на ХКГ у собак здатност1 видшених i3 зубних вщкладень м1крооргашзм1в формувати бюпл1вки.
Матер1ал i методи дослщження. Для визначення здатност1 формувати бюпл1вки використовували мезофшьш аеробш i факультативно анаеробш мжрооргашзми (МАФАнМ), що були ¿зольоваш i3 зубних бляшок 20 безпородних домашшх собак вжом 5,0-6,0 роюв вагою 10-30 кг, яю за клмчним проявом патолопчного процесу у яснах були роздшеш на 4 групи (по 10 тварин у кожнш): контрольну - здоров! тварини, I дослщну - з легким ступенем хрошчного катарального гшпвпу, II - з середшм i III дослщну групу - з важким ступенем nepeöiry хрошчного катарального гшпвпу.
Для вивчення здатност1 м1крооргашзм1в формувати бюпл1вки та визначення ix щшьност1 використовували стерильш одноразов! пластиков! чашки Петрг Внесену у чашки Петр1 в об'ем1 1,0 см3 добову культури м1крооргашзм1в у концентрацп 105 КУО/см3 витримували 3 год. за юмнатно! температури, пот1м додавали 5,0 см3 МПБ та шкубували за t° 30 °С протягом 24-48 год. Шсля шкубацп чашки триразово вщмивали фосфатним буфером, висушували та фжсували утвореш бюпл1вки 96° етиловим спиртом протягом 10 хв. Пот1м фарбували розчином 0,1 % кристал1чного фюлетового протягом 10 хв., знову промивали фосфатним буфером i висушували. У чашки додавали 2,5 см3 96° етилового спирту i добре ix вщмивали. Вим1рювали оптичну густину змитого розчину спирту спектрофотометрично за довжиш хвил1 570 нМ [8]. До бюпл1вок з низькою щшьшетю були вщнесеш бюпл1вки , насичешсть яких складала до 0,5 од.опт.щ., до бюпл1вок з середньою щшьшетю були вщнесеш
301
бюпл1вки, насичешсть яких становила вщ 0,5 до1,0 од.опт.щ. i до бюпл1вок з високою щшьшстю були вщнесеш бюпл1вки, насичешсть яких становила вище 1,0 од.опт.щ.
Отримаш результати дослщжень обробляли статистично з використанням програм Microsoft Excel i Statistika.
Результати й обговорення. Результати дослщження у зубному нальот1 собак з хрошчним катаральним гшпв1том вмюту мжрооргашзм1в, яю формують бюпл1вку, наведен! у таблиц! 1.
Таблиця 1
Bmîct м1кроорган1зм1в, hkî формують бшпл1вку, у зубному нальот1 собак за
хромчного катарального гшг1в1ту
Групи тварин, кшьшсть ¡зольованих шта]шв MiKpoopraHiîMÎB Од. вим1ру E. coli Acinetobacter spp. Corynebacterium spp. Enterococcus spp. Micrococcus spp. Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus spp. Streptococcus spp.
Контрольна група Кшьшсть 1зольованих штам1в (n=168) n 14 3 11 8 37 2 14 79
% 8,3 1,8 6,6 4,8 22,0 1,2 8,3 47,0
Кшьшсть пл1вкоутворюючих штам1в (n=36) n 2 1 2 2 11 1 3 14
% 5,5 2,8 5,5 5,5 30,5 2,8 8,3 38,9
I група Кшьшсть 1зольованих штам1в (n=186) n 20 5 14 9 33 7 18 80
% 10,7 2,7 7,5 4,8 17,7 3,8 9,7 43,1
Кшьшсть пл1вкоутворюючих штам1в (n=53) n 5 3 4 4 11 3 7 16
% 9,4 5,7 7,5 7,5 20,8 5,7 13,2 30,2
II група Кшьшсть 1зольованих штам1в (n=197) n 26 8 17 12 28 10 23 73
% 13,2 4,1 8,6 6,1 14,2 5,1 11,7 37,0
Кшьшсть пл1вкоутворюючих штам1в (n=83) n 11 5 7 7 13 6 14 20
% 13,2 6,0 8,4 8,4 15,6 7,2 16,9 24,3
III група Кшьшсть 1зольованих штам1в (n=190) n 35 8 16 14 22 11 28 56
% 18,4 4,2 8,4 7,4 11,6 5,8 14,7 29,5
Кшьшсть пл1вкоутворюючих штам1в (n=103) n 15 7 10 9 12 8 20 22
% 14,6 6,8 9,7 8,7 11,6 7,8 19,4 21,4
Встановлено, що здатшсть до формування бюпл1вки для ¿зольованих МАФАнМ була р1зною I 1х кшьккть збшьшувалась ¿з наростанням важкосп патолопчного процесу. Так, у здорових собак (контрольна група) ¿з 168 ¿золят1в зубного нальоту лише 36 штам1в (21,4%) володши здатшстю до формування бюпл1вки, у собак I групи ¿з 186 ¿золят1в - 53 (28,5%), II- о! з з 197 - 42,1% I Ш
302
групи з 190 ¿зольованих мшрооргашзм1в бюпл1вку утворювали 54,2% штам1в мжрооргашзм1в.
Збшьшення юлькоси пл1вкоформуючих м1крооргашзм1в у зубнш бляшщ з наростанням важкост1 ХКГ вщбувалося за рахунок збшьшення юлькоси E. coli за легкого ступеня хвороби на 3,9%, середнього - на 7,7% i важкого ступеня на 9,1%; Acinetobacter spp. вщповщно на 2,9, 3,2 i 4,0%; Corynebacterium spp. - на 2,0, 2,9 i 4,2%; Enterococcus spp. - на 2,0, 2,9 i 3,2%; Pseudomonas aeruginosa -на 2,9, 4,4 i 5,0%; Staphylococcus spp. - на 4,9, 8,6 i 11,1%. Одночасно i3 збшьшенням юлькост1 формуючих бюпл1вку МАФАнМ у зубнш бляшщ зменшувалась юльюсть таких бюпл1вкоутворюючих мкрооргашзм1в, як Micrococcus spp. i Streptococcus spp., яю були домшуючими у собак контрольно! групи. Зокрема, юльюсть Micrococcus spp. пор1вняно i3 здоровими собаками зменшилась за легкого ступеня хвороби на 9,7%, середнього - на 14,9% i важкого ступеня - на 18,9%, a Staphylococcus spp. - за легкого ступеня хвороби на 8,7%, середнього - на 14,6% i важкого ступеня - на 17,5%.
Домшуючими у зубному нальот1 серед МАФАнМ, яю здатш утворювати бюпл1вку у тварин контрольно! групи були Micrococcus spp. i Streptococcus, за легкого ступеня ХКГ - Micrococcus spp., Staphylococcus spp. i Streptococcus, середнього i важкого - E. coli, Micrococcus spp., Staphylococcus spp. i Streptococcus.
Викликае пересторогу проникнення у бюпл1вку i наростання у нш пл1вкоутворюючих штам1в Pseudomonas aeruginosa, чинниками патогенност1 яко! е наявшсть рухливост1, токсиноутворення i продукщя гщролпичних фермешчв. Прогноз попршуеться високою резистентшстю цього мжрооргашзму до дп антибютиюв.
Отже, з наростанням важкост1 ХКГ у зубному нальот1 собак збшьшуеться пор1вняно i3 контрольною групою юльюсть м1крооргашзм1в, що утворюють бюпл1вку. Так, за легкого ступеня хвороби цей показник збшьшуеться у 1,47 раза, за середнього - у 2,31 ¿за важкого ступеня - у 2,86 раза.
Важливим за формування бюпл1вки е И щшьшсть, осюльки щшьна позаклпинна матриця надшшше захищае мжробш клпини вщ несприятливих фактор1в зовшшнього середовища. Результата визначення оптично! щшьност1 бюпл1вок, сформованих мезофшьними аеробними i факультативно анаеробними мжрооргашзмами зубних вщкладень собак за хрошчного катарального гшпвпу показано у таблиц! 2.
3 наведених у таблиц! даних видно, що оптична щшьшсть для бюпл1вок, утворених ¿золятами дослщжуваних мжрооргашзм1в, становила вщ 0,07 до 1,49 од.опт.щ. 1з зростанням важкосп хвороби вщбуваеться в1рогщне (Р<0,05 -Р<0,001) накопичення у бюпл1вках низько! щшьност1 екстрацелюлярного матриксу i створюються умови для формування цими ж мжрооргашзмами бюпл1вок середньо! i високо! щшьностг Найбшьш насиченими були бюпл1вки за важкого ступеня хвороби. У порядку зниження насиченост1 бюпл1вок високо! щшьност1 дослщжуваш мжрооргашзми розташувалися у такому порядку: E. coli, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas
303
aeruginosa, Streptococcus spp., Acinetobacter spp. i Micrococcus spp.
Таблиця 2
Оптична щшьшсть бшпл1вок, сформованих мезофшьними аеробними i факультативно анаеробними мжрооргашзмами зубних вщкладень собак за _хромчного катарального гшг1в1ту, од.опт.щ., M±m, n=5_
1зольоват м1кроорган1зми Щшьшсть бюпл1вки Контрольна група Досл1дн1 групи
I II III
E. coli Низька 0,11±0,01 0,20±0,02** 0,22±0,02*** 0,28±0,02***
Середня - - 0,69±0,04*** 0,84±0,03 ***
Висока - - 1,34±0,12*** 1,49±0,01 ***
Acinetobacter spp. Низька 0,10±0,01 0,13±0,01*** 0,20±0,01*** 0,19±0,02***
Середня - 0,44±0,03 *** 0,53±0,03 *** 0,79±0,05***
Висока - - - 1,21±0,10***
Corynebacterium spp. Низька 0,07±0,01 0,16±0,01*** 0,20±0,01 *** 0,20±0,02**
Середня - 0,58±0,04*** 0,66±0,04*** 0,84±0,05***
Висока - - 1,17±0,08*** 1,34±0,11 ***
Enterococcus spp. Низька 0,09±0,01 0,14±0,01 * 0,18±0,01 ** 0,19±0,01 ***
Середня - 0,51±0,01*** 0,63±0,02*** 0,72±0,04***
Висока - - 1,24±0,11*** 1,40±0,10***
Micrococcus spp. Низька 0,08±0,01 0,09±0,01 0,12±0,01* 0,13±0,01**
Середня 0,53±0,03 0,59±0,03 0,62±0,04** 0,62±0,05**
Висока - 1,27±0,10*** 1,20±0,09*** 1,13±0,05***
Pseudomonas aeruginosa Низька 0,15±0,01 0,16±0,02 0,21±0,02* 0,29±0,02***
Середня - 0,58±0,03*** 0,54±0,02*** 0,58±0,04***
Висока - - 1,11±0,11*** 1,27±0,09***
Staphylococcus spp. Низька 0,09±0,01 0,32±0,02*** 0,43±0,03*** 0,49±0,02***
Середня 0,56±0,02 0,69±0,04 0,70±0,03 0,78±0,03
Висока - 1,23±0,08*** 1,35±0,07*** 1,44±0,08***
Streptococcus spp. Низька 0,14±0,01 0,31±0,02*** 0,30±0,02*** 0,34±0,03**
Середня 0,58±0,02 0,62±0,03 0,66±0,03 0,71±0,04
Висока - 1,13±0,01*** 1,17±0,04*** 1,22±0,04***
Примтка: * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001 - щодоконтролю.
Виявлення у дослщжуваних м1крооргашзм1в здатносп до формування pi3HOi оптично! щшьносп бюпл1вок вказуе, що бюпл1вкоутворення е багатоступеневим процесом, який починаеться i3 прикршлення м1крооргашзм1в до поверхн1 зуба або ¿нших структур зубного нальоту i зак1нчуеться продукуванням екстрацелюлярного матриксу. Чим щ1льн1ша б1опл1вка, тим
304
мжрооргашзм стае бшьш захищеним вщ дп ¿мунних чинниюв захисту -нейтрофшв, штерлейюшв, ¿муноглобулмв, а також антимжробних препарата.
Висновки.
1. 3 наростанням важкост1 ХКГ у зубному нальот1 собак збшьшуеться пор1вняно i3 контрольною групою юльюсть м1крооргашзм1в, що утворюють бюпл1вку: залегкого ступеня хвороби цей показник збшьшуеться у 1,47 раза, за середнього - у 2,31 ¿за важкого ступеня - у 2,86 раза.
2. 1з зростання важкост1 хвороби вщбуваеться в1рогщне (Р<0,05 - Р<0,001) накопичення у бюпл1вках низько! щшьност1 екстрацелюлярного матриксу i створюються умови для формування цими ж мжрооргашзмами бюпл1вок середньо! i високо! щшьностг
3. У порядку зниження насиченост1 бюпл1вок високо! щ1льност1 м1кроорган1зми, як1 були ¿зольоваш i3 зубного нальоту, розташувалися у такому порядку: E. coli, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp., Acinetobacter spp. iMicrococcus spp.
Перспективи подальших дослщжень.
Перспективним напрямком е вивчення взаемод11 м1кроорган1зм1в в асощащях та механ1зм1в формування резистентност1 пол1м1кробних ¿нфекц1й. Отриман1 дан1 будуть використан1 за розробки cnoco6iB руйнування м1кробних 61опл1вок.
Л1тература
1.Белобородова Н. В. Клиническое значение микробных биопленок // http ://www. internist.ru/articles/cardiology/cardiology_216.html
2.Бухарин О. В. Фундаментальные и прикладные аспекты проблемы персистенции микроорганизмов / О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяцов, Л. М. Хуснутдинова // Журн. микробиология. - 2003. - №4. - С. 3-8.
3.Гусельников Е.В. Некоторые аспекты ветеринарной стоматологии // «Ветеринарная практика». - 2002. - № 17. - С. 36-44.
4.Сурдина Э.Д. Состояние пульпы интактных зубов при генерализованном гингивите тяжелой ступени: Автореф. дис. канд. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2007 -25 с.
5.Costerton J.W. Biofilm in implant infections: its production and regulation / Costerton J.W., Montanaro L., Aciola C.R // Int. J. Artif. Organs. - 2005. - № 28. -P. 1062-1068.
6.Gawor J. Zapalenie blony sluzowej jamy ustnej u psuw wywolane plytk^ naz^bn^ // Zycie Weterynaryjne, 2005. - 80(6). - S. 346 -352.
7.Miller M. Quorum sensing in bacteria / M. Miller, B. Bassler // Annu Rev. Microbiol. - 2001. - Vol. 55. - P. 165 -199.
8.Stepanovic S. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation / S. Stepanovic, D. Vurovic, I. Duric, B. Savic // J. Microbiol. Methods. - 2000. - Vol. 40. - P. 175 -179.
Рецензент - д.вет.н., професор Гуфрш Д.Ф.
305
