CC BY
18
Мешрманова Ж.Б.
ОТАНДЬЩ «VITRENAL» ВИТРЕОСИНЕРЕТИГ1Н ДИПРОСПАНМЕН Б1РГЕ КОЛДАНУДЬЩ ТИ1МД1Л1Г1Н ЭКСПЕРИМЕНТТЕ САЛЫСТЫРМАЛЫ БАРАЛАУ
Полимерлердщ витреосинерезиске кабшеттшИне салыстырмалы сараптама жYргiзiлдi. Эксперимент™ жануарлардыч тiндерiне эсерiн жэне шыны тэрiздi денеге полимерлердi ечпзгенде оныч витреосинерезиске кабшеттшп зeрттeлдi.
А. Ш. Орадова
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ M.TUBERCULOSIS
Казахский Национальный медицинский университет им. С. Д. Асфендиярова, кафедра лабораторной диагностики и молекулярной медицины (Алматы)
Обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в клинических образцах является одним из основных диагностических подходов во фтизиатрии. В настоящее время традиционные микробиологические методы выявления возбудителя по своей эффективности уже не удовлетворяют клиницистов. Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью: для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ) необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 тыс. микробных клеток. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10 - 30%. Чувствительность бактериологического посева значительно выше -20 - 100 МБТ, однако, исследование занимает длительное время - 1 - 2 мес. В связи с этим МБТ в нашей стране выявляют в среднем лишь у 50 - 60% больных активным туберкулезом
В последние годы показано, что различные молекулярно-биологические методы позволяют проводить детекцию микобактерий туберкулезного комплекса (МТК) непосредственно в клиническом материале в течение нескольких часов, определять их лекарственную чувствительность. Однако в практическом здравоохранении диагностика туберкулеза и его лечение продолжают основываться на культуральном методе. Идентификация микобактерий в клинической лаборатории остается сложной и длительной процедурой. Она основывается на фенотипических особенностях: скорость роста, морфология колоний, пиг-ментообразование, биохимические свойства - и занимает не менее 6 нед [2].
В настоящее время традиционные микробиологические методы выявления микобактерий туберкулеза (МБТ) не удовлетворяют требованиям клиницистов. Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью, более чувствителен культуральный метод исследования (посев клинического материала на плотные яичные среды), но исследование занимает 1 - 2 мес.
За рубежом широкое распространение
получила радиометрическая система ВАСТЕС для быстрого обнаружения живых МБТ в жидкой питательной среде. Микобактерии культивируют в жидкой ВАСТЕС среде, где в качестве источника углерода используется меченая 14С пальмитиновая кислота. При положительных данных бакте-риоскопического исследования рост МБТ обнаруживали радиометрически на 7 - 10 день и на 14 - 21 дни при отрицательных данных [1].
К недостаткам этого метода, ограничивающим возможность его широкого применения, относятся:
■ высокая себестоимость исследования;
■ необходимость применения радиоактивных изотопов и специального радиометрического оборудования, сложность работы с изотопной технологией;
■ необходимость дополнительного посева на плотную питательную среду при возникновении проблем с идентификацией или интерпретацией результатов [3]. Следовательно, задача быстрой микробиологической диагностики туберкулеза далека от окончательного решения. В ряде фтизиобакте-риологических лабораторий Казахстана в последние годы используются автоматизированные системы бульонного культивирования микобакте-рий, однако для идентификации изолятов методы генетического анализа не применялись.
Биологический метод применяется для выявления не только типичных, но и разнообразных, биологически измененных, форм возбудителя, в частности L-трансформированных и фильтрующихся форм.
Самым восприимчивым к туберкулезной инфекции лабораторным животным является морская свинка. Считается, что ее заражение позволяет диагностировать туберкулез при наличии в материале, использованном для заражения, 1 - 5 микробных клеток.
Метод ПЦР основан на ферментативной амплификации выбранных специфических участков генома бактерий рода Mycobacterium tuberculosis M. bovis, M. africanum, M. microti), их дальнейшей детекции и идентификации. Аналитическая чувствительность метода, определяемая при последовательных разведениях суспензии бактериальных клеток, очень высока и составляет от 1 пг до 5 фг микобактериальной ДНК, что эквивалентно выявлению 1 - 10 бактериальных клеток.
В настоящее время существует ряд разработок по использованию ПЦР в диагностике туберкулеза, но до сих пор не найдена оптимальная маркерная последовательность в геноме My-
cobacterium tuberculosis, обеспечивающая максимальную специфичность и чувствительность анализа, что препятствует широкому применению ПЦР с целью выявления МБТ в практическом здравоохранении.
Постановка ПЦР предусматривает использование заведомо положительного и отрицательного контроля. При этом положительный контроль используется в качестве репера при регистрации результатов методом электрофореза, а также для оценки качества реагентов и работоспособности оборудования. Отрицательный контроль призван выявить контаминацию реагентов, в то же время не учитываются ошибки, связанные с возможным присутствием в пробе от больного ингибиторов ДНК-полимеразы или нарушениями пробоподготовки и условий хранения. В связи с этим предпочтительнее использовать появившиеся в последние годы наборы, предусматривающие постановку «внутреннего» контроля, т.е. контроля хода реакции непосредственно в анализируемой пробе.
Серьезными недостатками биологического метода являются его высокая стоимость, необходимость специальных условий, длительность проведения анализа и зависимость результатов от чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам. Под их влиянием многие штаммы снижают или теряют свою вирулентность [4].
Цель исследования: провести идентификацию культур, выросших на автоматизированной системе бульонного культивирования ВАСТЕС MGIT 960, с помощью метода пЦр-анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы 41 клинический штамм от впервые выявленных больных противотуберкулезного диспансера Жетысуйско-го района г. Алматы, поступивший для микробиологического исследования в период с ноября 2006 г. по апрель 2007 г.
Посевы производились в пробирки MGIT, на плотную среду Левенштейна-Йенсена. Учет результатов и идентификация культур, выросших на плотной среде, осуществлялась общепринятыми тестами.
Первичная идентификация микобактерий комплекса M. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам, приведенным в табл. 1.
Для последующей дифференциации M. tuberculosis и M. bovis культуры были проверены ниациновым тестом. Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, поэтому именно эта среда использовалась для проведения ниацино-вой пробы. Подлежащие дифференциации культуры микобактерий были выращены на среде Левенштейна-Йенсена в течение не менее 3 - 4 нед и имели достаточно массивный (не менее 50 колоний) рост [5].
Для постановки ниациновой пробы использовались специально приготовленные бумажные полоски фирмы «Ытей1а» (Индия). Преимущество этого метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия - вещества более безопасного и доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3 - 4 ч получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобак-териям человеческого вида или к другим мико-бактериям.
Все образцы, выявленные как позитивные в аппарате BACTEC 960 (с 4 дня инкубации), удалялись из прибора. После чего выполнялись следующие процедуры: мазок для окраски по Цилю-Нильсену с целью выявления кислотоустойчивых микроорганизмов; субкультивирование на плотной среде для подтверждения роста микобакте-рий, субкультивирование на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 1 000 мкг/мл салицилата натрия, для дифференциации МТК и нетуберкулезных микобактерий; посев на чашку с кровяным агаром для подтверждения отсутствия кон-таминирующей микрофлоры. Все позитивные пробирки, в которых выявлялся рост кислотоустойчивых бактерий, тестировали методом ПЦР на наличие ДНК M. tuberculosis complex с применением «Политуб» (Москва, НПФ «ЛИТЕХ») и набора реагентов «Ампли Сенс» (Москва, ЦНИИЭ) [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Из всех позитивных по ВАСТЕС пробирок кислотоустойчивые микроорганизмы были выявлены в 37 случаях. Время детекции роста мико-бактерий на автоматизированной системе колеба-
Таблица 1.
Культуральные признаки комплекса M. tuberculosis
Культуральные признаки Комплекс M. ШЬегси/оsis
Скорость роста Медленнорастущие>3 нед
Пигментообразование Цвет слоновой кости
Морфология колоний Я или 5формы
Наличие кислотоустойчивости Выраженная кислотоустойчивая окраска
Температура роста Оптимальный рост при 35 - 37°С
лось от 4 до 28 сут, что в среднем составило 11,6 сут и было значительно короче по сравнению со скоростью роста на плотной среде - 43 сут.
Для верификации принадлежности данных культур к M.tuberculosis complex был проведен ПЦР-анализ, для чего из каждой пробирки взято по 100 мкл образца. Положительный результат ПЦР со специфическими для M.tuberculosis/bovis праймерами был получен в 90,2% случаев (37 культур). В пяти случаях результат ПЦР был отрицательным. Из низ шесть проб (9,8%) были контаминированы посторонней флорой, что может объяснить отрицательные результаты ПЦР (ингибирование).
ВЫВОДЫ
Внедрение молекулярно-биологических методов диагностики, основанных на применении полимеразной цепной реакции, значительно повышает эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса по сравнению с традиционными микробиологическими методами (бактериоскопия, люминесцентная микроскопия, посев). При туберкулезе органов дыхания преимущество ПЦр наиболее ощутимо при недеструктивных и ограниченных формах болезни. При внелегочных формах болезни, характеризующихся олигобациллярностью, более адекватной диагностике будут способствовать использование различных способов выделения ДНК, одновременное исследование различных по характеру биологических образцов от одного больного и применение туберкулино-провокационных проб.
Сочетание молекулярных методов типиро-вания микобактерий туберкулеза с методами прямой детекции (секвенирование) резистентности к химиопрепаратам позволит в дальнейшем проводить не только статистические мониторинговые эпидемиологические исследования, но и получать достоверные результаты в клинически значимом масштабе времени. [7].
Таким образом, комбинированное исполь-
зование автоматизированной системы бульонного культивирования ВАСТЕС 960 и идентификация роста микобактерий с помощью тест-систем для ПЦР-анализа «Политуб» и «Ампли Сенс» в значительной степени сокращает время исследования (в среднем до 12,6 дня). Проведенные исследования позволили установить, что положительные результаты ПЦР зависели от морфологии выделенных культур.
ЛИТЕРАТУРА
1. Выявление М. tuberculosis в крови методом ПЦР (экспериментальная модель) /М. В. Альварес Фигероа, Л. Н. Лепеха, Б. В. Никоненко и др. //В сб.: Генодиагностика в современной медицине. Материалы 3 Всерос. конф. - М., 2000. - С. 277 -279.
2. Власенко В. В. Нова концепщя бюлогп ро-звитку мкобактерш туберкульозу //Медико-соцЬ альн аспекти боротьби с туберкульозом. Досвщ КиТвськоТ мкькоТ державно!' адмУстрацп: Збiрник матерiалiв науково-практичноТ конференцп. -КиТв, 2001. - С. 22 - 23.
3. Генодиагностика во фтизиатрии /Е. Г. Бочка-рев, Т. С. Денисова, Э. В. Генерозов и др. //Реф. ж. ВИНИТИ. Медицина. Реф. сб. Вып. Туберкулез. - 2002. - № 1. - С. 1 - 16.
4. Журило О. А. Мкробюлопчы методи обсте-ження хворих на туберкульоз /О. А. Журило, В. В. Власенко, А. I. Барбоваташ //Методичн рекомен-дацп. - К^в, 2001. - 24 с.
5. Момыналиев К. Т. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе /К. Т. Момыналиев, В. М. Говорун //Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - №4. -С. 25 - 32.
6. Перельман М. И. Фтизиатрия /М. И. Перель-ман, В. А. Корякин, И. В. Богадельникова. - М., 2004. - С. 282 - 300.
7. Хоменко А. Г. Туберкулез. - М., 1996. - С. 256 - 263.
Поступила 16.09.09
A.Sh. Oradova
USE OF MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR-GENETIC METHODS FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF M.TUBERCULOSIS
Three methods of tuberculosis diagnostics were compared in order to evaluate the relative effectiveness of the express diagnostic test by means of ВАСТЕС MGIT 960 and PCR, the cultural method of the diagnostics utilizing Levenshtein - Yensen and bacterioscopic methods. The polymerase chain reaction was used to identify isolates from medium. The analysis of the results demonstrated that the isolates from ВАСТЕС MGIT 960 were mostly M. tuberculosis. It is possible to use ВАСТЕС MGIT 960 for the express diagnostics of tuberculosis.
А. Ш. Орадова
M.tuberculosis АНЫКТАУ Ж6НЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯЛАУ УШ1Н МИКРОБИОЛОГИЯЛЬЩ Ж6НЕ МОЛЕКУЛЯРЛЫК-ГЕНЕТИКАЛЫК ТЭС1ЛДЕРД1 КОЛДАНУ
Бул жумыста ВАСТЕС MGIT 960 жэне ПЦР кемепмен Левенштейн Йенсен тэс^мен диагностикалау жэне бактериоскопиялау бойынша туберкулездi жедел диагностикалау тэстшщ кундылыры зерттелген. Алынран нэтижеы идентификациялау Yшiн полимеразды тобект реакция етюзшдг Алынран нэтижелердщ анализi ВАСТЕС MGIT 960 екпе туберкулезiмен наукастанран сыркаттардыч клиникалык Yлгiлерiнен белшген бактериялар формалары кеп жардайда М. tuberculosis формалары болып табылатынын керсетп. Сол себептен биологиялык материалда МБТ бар екенш жедел диагностикалауда ВАСТЕС MGIT 960 колдану mym^ болып табылады.
