CC BY
86
УДК 577.15.07
Буракаева А.Д., Левин Е.В.
ОАО «Научно-исследовательский и проектный институт экологических проблем» г. Оренбург
Е-mail:[email protected]
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКОФИЛЬНОГО ГРИБА HYPOMYCES ROSELLUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ СРЕДАХ
В последние годы проблема утилизации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих отходов деревоперерабатывающей, сельскохозяйственной и целлюлозно-бумажной промышленности имеет широкие перспективы практического использования в связи с необходимостью защиты окружающей среды.
Способность микофильных грибов к образованию целлюлаз и гемицеллюлаз (ксиланаз) создает условия прямой микробной трансформации древесно-растительных отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности в белок и другие практически ценные органические соединения. Из имеющихся в литературе данных известно, что биосинтез гидролитических ферментов у микроскопических грибов происходит при внесении в питательную среду индукторов, а также за счет подбора оптимальных условий культивирования микромицетов.
Микофильный гриб Иуротусев говеПив ВКПМ F-242 известен как продуцент протеолитичес-ких ферментов и других практически ценных продуктов метаболизма. Однако в литературе отсутствуют данные по изучению способности микофильного гриба Нуротусев говеПив ВКПМ F-242 к биосинтезу ферментов, обеспечивающих эффективный гидролиз древесно-растительных отходов сельского хозяйства и деревоперерабатывающей промышленности. В результате наших исследований было показано, что в глубинных условиях при культивировании штамма на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода хвойные опилки, пшеничные отруби и кукурузные стержни гриб синтезирует внеклеточную эндо-1,4-Ь^-глюканазу и ксила-назу. Наибольшая активность целлюлолитических ферментов отмечалась на среде с кукурузными стержнями, при этом количество ксиланазы составило 7,08 ед/мл; целлюлазы - 5,7 ед/мл. Определение фракционного состава культуральной жидкости показало, что большая часть внеклеточных белков являются водо- и спирторастворимыми.
Ключевые слова: микофильный гриб Нуротусев говеПив, целлюлаза, ксиланаза, водо- и спирторастворимые белки.
В последние годы проблема утилизации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих отходов деревоперерабатывающей, сельскохозяйственной и целлюлозно-бумажной промышленности имеет широкие перспективы практического использования в связи с необходимостью защиты окружающей среды.
Способность микофильных грибов к образованию целлюлаз и гемицеллюлаз (ксиланаз) создает условия прямой микробной трансформации древесно-растительных отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности в белок и другие практически ценные органические соединения. Из имеющихся в литературе данных известно, что биосинтез гидролитических ферментов у микроскопических грибов происходит при внесении в питательную среду индукторов, а также за счет подбора оптимальных условий культивирования микромицетов [1].
Микофильный гриб Hypomyces roseПus ВКПМ F-242 известен как продуцент протео-литических ферментов и других практически ценных продуктов метаболизма. Однако в ли-
тературе отсутствуют данные по изучению способности микофильного гриба Hypomyces гс^П^ ВКПМ F-242 к биосинтезу ферментов, обеспечивающих эффективный гидролиз дре-весно-растительных отходов сельского хозяйства и деревоперерабатывающей промышленности.
Целью настоящей работы было изучение микофильного гриба Hypomyces rosellus ВКПМ F-242 как возможного продуцента целлюлаз и ксиланаз.
Материал и методы исследований
В нашей работе использовали штамм микофильного гриба Hypomyces ГОБбИш ВКПМ F-242, ранее известный как продуцент практически важных продуктов [2], [3], [4], [5]. Глубинное выращивание культуры и проверку способности образовывать внеклеточные гидролитические ферменты проводили на среде Чапека-Докса в присутствии 2 % древесно-растительных отходов: хвойные опилки, отруби пшеничные. и кукурузные стержни. Культуру выращивали в колбах на качалках (220 об/мин.) в течение 2, 4 и 6 суток
Буракаева А.Д., Левин Е.В.
Использование микофильного гриба Hypomyces rosellus..
при температуре 22-24оС. Посевным материалом служил двухсуточный мицелий, выращенный на жидком сусле 40 по Баллингу, который вносили в количестве 5 %. После завершения процесса культивирования в культуральной жидкости определяли: биомассу - весовым методом; редуцирующие сахара - феррацианид-ным методом на КФК-3 при длинах волн а = 400 и 420 нм (для глюкозы и ксилозы соответственно) согласно [6], [7]. Активность эндо-1,4-Ь-Э-глюканазы (Сх) - вискозиметрически по падению вязкости раствора 1% высокополимерной карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), а также по образованию редуцирующих веществ в результате гидролиза низкомолекулярной карбоксиметилцеллюлозы по методу Мендельса и Вебера. Активность фермента выражали в условных единицах. За единицу активности принимали такое его количество, которое катализирует образование 1 мг глюкозы в 1 мл за 1 час в оптимальных условиях опыта. Об активности ксиланазы судили по количеству редуцирующих сахаров, которые образовались при гидролизе соответствующего субстрата, в частности, 1%-ной суспензии ксилана. За единицу активности ксиланазы принимают такое количество фермента, которое образовывало 1 мг редуцирующих сахаров (в пересчете на глюкозу) [8].
Обсуждение результатов
Изучение динамики роста микофильного гриба показало, что все субстраты способствуют хорошему росту культуры. Самым оптимальным источником углерода оказались пшеничные отруби, на которых рост культуры начинался уже в первые сутки и достигал максимума в на 4 сутки роста культуры. Наибольшая активность цел-люлолитических ферментов отмечалась на среде с кукурузными стержнями, при этом количество целлюлазы составило 5,7 ед/мл, ксиланазы - 7,8 ед/мл (таблица 1). Высокая ксиланаз-ная активность обусловлена видимо тем, что кукурузные стержни в основном состоят из ксилана. Кроме того, мы установили, что чем больше вязкость культуральной жидкости после культивирования гриба, тем выше ферментативная активность. Это происходит, по-видимому, в результате накопления ферментов в
Таблица 1. Активность ферментов на различных растительных субстратах
Субстрат Вязкость 'ПкИН; сСТ Ксиланазная активность, ед/мл Целлюлазная активность, ед/мл
Хвойные опилки 1,55 5,04 2,5
Пшеничные отруби 1,81 6,2 4,5
Кукурузные стержни 2,98 7,8 5,7
Рисунок 1 Водо- и солерастворимые белки культуральной жидкости Нурошусез гозеПш на различных субстратах
Рисунок 2 Спирто- и щелочерастворимые белки культуральной жидкости Нурошусез гозеПиз на различных субстратах
Биологические науки
культуральной жидкости, которые представляют собой белковые молекулы, в связи с чем образуется коллоидная система.
Из литературных данных известно, что грибные белки имеют достаточно высокую биологическую ценность и хорошо усваиваются организмом поскольку содержат главным образом водо- и спирторастворимые фракции. Определение фракционного состава белка культуральной жидкости Нурошуеез гозеПиБ выяви-
ло, что большая часть белков культуральной жидкости являеются водо- и солерастворимы-ми. На пшеничных отрубях их количество достигало 298 и 76,9 мг/мл, на кукурузных стержнях - 45 и 27 мг/мл, на хвойных опилках 55 и 85,5 мг/мл соответственно. (рисунок 1, 2). Таким образом, микофильный гриб Нурошуеез гсвеИш ВКПМ F—242 является перспективным продуцентом ферментных препаратов для утилизации целлюлозосодержащих отходов.
14.11.2014
Список литературы:
1. Ферменты микроорганизмов /Под ред. А.А. Имшенецкого.- М:Наука, 1973. - 316 с.
2. Штамм Hypomyces rosellus 94/77 - продуцент протеазного комплекса и препарата антибактериального и фунгицидного спектра действия. Авторское свидетельство СССР №1135189 / Е.Г. Торопова [и др.]. - Опубл. 30.08.85. - Бюл. №32.
3. Буракаева, А.Д. Способ получения красителя / А.Д. Буракаева // Патент РФ №2065462, опубл.20.08.96, бюл.№23.
4. Способ получения смеси насыщенных углеводородов микробиологическим путем / А.Д. Буракаева [и др.] // Патент РФ №2439158, опубл. 10.01.2012 г., бюл.№1.
5. Буракаева, А.Д. Микофильные грибы - продуценты практически важных продуктов: монография / А.Д.Буракаева. -НОУ ВПО МТИ «ВТУ». - Оренбург. - Типография «Экспресс-печать», 2013. - 160 с.
6. Методы экспериментальной микологии. Справочник.- Киев: Наукова думка, 1982. - 550 с.
7. Филиппович, Ю.Б. Практикум по общей биохимии / Ю.Б. Филиппович, Т.А. Егорова, Г.А. Севастьянова. - М.: Просвещение, 1982. - 311 с.
8. Синицын, А.П. Методы изучения и свойства целлюлитических ферментов / А.П. Синицын, В.М. Черноглазов, А.В. Гусаков // Итоги науки и техники. Сер. «Биотехнология». - М. - 1990. - Т. 25. - 152 с.
Сведения об авторах:
Буракаева Айгуль Дикатовна, старший научный сотрудник ОАО «Научно-исследовательский и
проектный институт экологических проблем», кандидат биологических наук
Левин Евгений Владимирович, генеральный директор ОАО «Научно-исследовательский и проектный
институт экологических проблем», кандидат физико-математических наук
460037, г. Оренбург, ул. Караванная д. 6 А, тел. (3532) 372983, e-mail: [email protected]
