CC BY
157
Обзоры
Использование бесклеточного матрикса
для формирования новых кровеносных сосудов и сердца
методом тканевой инженерии
Ш.Д. Ахмедов 1, СА. Афанасьев 1, MJ1. Дьякова 1, ТХ. Фатхутдинов 2, /7.6. Кактурский 2
1 ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра СО РАМН
2 ГУ НИИ морфологии человека РАМН, Москва
The use of perfusion decellularized matrix for new blood vessels formation in heart by the method of tissue engineering
Sh.D.Akhmedov1, SA. Afanasjev 1. ML, Dyakova1,T.H. Fathutdlnov 3, L.V. Kaktursky 3 1 Tomsk Institute of Cardiology, Tomsk
3 Scientific Institute of Human Morphology, Tomsk
Статья посвящена обзору литературы no теме разработки биоинженерных конструкций сосудистых кондуитов и клапанных структур сердца с целью последующего их использования в сердечно-сосудистой хирургии. Широко используемые в настоящее время в сердечно-сосудистой хирургии аутовенозные кондуиты, сосудистые протезы и искусственные клапаны сердца не всегда отвечают необходимым современным требованиям для лечения больных из-за ограниченного времени функционирования, связанного с деструктивными механизмами, которые развиваются после имплантации in vivo. Искусственные органы пока не способны в полной мере выполнять функции, заложенные природой по причине невозможности воссоздания сложной нервно-гуморальной системы регуляции процессов при адаптации к изменяющимся факторам внешней и внутренней среды. В этих условиях заслуживающей внимание является разработка новых медицинских технологий, позволяющих выращивать новые биологические ткани и органы на основе естественных матричных коллагеновых каркасов.
Ключевые слова: перфузионно-бесклеточный матрикс, тканевая инженерия, сердечно-сосудистая хирургия.
The article is a literature review devoted to the development of bioengineering constructions of vascular conduits and valvular structures of heart with the purpose of their use in cardio-vascular surgery. Autovenous conduits, vascular prostheses and artificial heart valves which are widely-used today do not always meet the necessary modern requirements for patients treatment because of their limited time of functioning associated with destructive mechanisms which develop after implantation in vivo. Artificial organs are not able to function naturally in full measure because of their inability to recreate a complex system of neurohumorat control of the processes during their adaptation to changing factors of external and internal environment. In these conditions a special attention should be drawn to the new medical technologies allowing growth of new biological tissues and organs basing on natural matrix collagen frame.
Keif words: perfusion decellularized matrix, tissue engineering, cardio-vascular surgery.
Болезни сердца и сосудов в большинстве стран мира составляют в структуре смертности более 50%, являясь среди неинфекционных болезней главной причиной инвалидизации больных [1—3]. Вместе с тем сердечнососудистая хирургия — одна из самых быстро и успешно прогрессирующих областей медицины, и своевременно выполненные операции у больных с заболеваниями сердца и сосудов не только предотвращают инвалидизацию многих тысяч больных, но и реально влияют на уровень смертности [4].
Общепринятым «золотым стандартом» лечения сердечно-сосудистых заболеваний, обусловленных облитерацией сосудов являются шунтирующие операции, представляющие собой обход или замену участка сужения за счёт трансплантатов и реваскуляризацию зоны ишемии. В настоящее время в России ежегодно выполняется около 15 тыс. операций аортокоронарного шунтирования, не менее 5 тыс. операций с использованием искусственных сосудистых протезов для хирургии сосудов нижних конечностей и при лечении врожденных пороков сердца.
В кардиохирургии в качестве трансплантата чаще всего используют участок подкожной вены (реваскуля-
e-mail: [email protected]
ризация сердца и нижних конечностей) и внутренней грудной артерии для «обхода» коронарных артерий [5]. Несмотря на более чем 50 летние исследования синтетических материалов, нативная вена и сегменты артерии остаются материалом выбора в качестве трансплантатов для процедур реваскуляризации. К сожалению, соответствующую вену или артерию для выполнения коронарной или периферической реваскуляризации не всегда возможно использовать из-за предыдущей операции или других заболеваний. Так, например, около 30% пациентов не обладают подходящей для трансплантации веной [5].
Также, существующие в настоящее время аутовенозные кондуиты, которые используются в качестве аортокоронарных шутов с целью реваскуляризации миокарда, не отвечают необходимым современным требованиям для лечения ИБС. Очень часто в стенке венозного кондуита возникают дегенеративные изменения, которые в итоге приводят к окклюзии шунта в течение ближайших 7^8 лет после операции. В итоге такие пациенты вновь начинают относиться к категориям повышенного риска в возникновении повторных инфарктов миокарда.
А
Обзоры
Существует значительная клиническая потребность в альтернативных аутогенным венам и артериям сосудистых протезах, использующихся в сосудистых восстановительных операциях — таких как аортокоронарное шунтирование (AKLLI), шунтирующие операции на нижних конечностях, артериовенозных шунтах и исправлении врожденных дефектов легочного кровотока, которые бы соответствовали всем необходимым биологическим и механическим характеристикам собственных сосудов пациентов. Однако, на данный момент синтетические материалы не соответствуют качествам нативных тканей, особенно в приложении к кровеносным сосудам малого диаметра. Так, например, синтетические материалы — такие как политетрафторэтилен и Дакрон® (Invista, Уилмингтон, DE) использовались с большим успехом для шунтирующих операций с диаметром сосуда более 6 мм, однако результаты их использования в сосудах малого диаметра были неудовлетворительными [6, 7]. Исторически, использование синтетических трансплантатов было связано с тремя ведущими причинами неудач: острый тромбоз, вызванный несостоятельностью функции эндотелия; рестеноз, вызванный хроническим воспалением и нарушением эластичности; и повышенная восприимчивость к инфекции [6—12]. Основными качествами идеального трансплантата должны быть его биологическая совместимость, прочность, гипоаллергенность и гипоиммуногенность, отсутствие токсичности, низкая стоимость, отсутствие тромбоген-ности. К настоящему времени ни один из разработанных заменителей сосудов не обладает этими качествами в полной мере [13]. Синтетические, аллогенные и ксено-генные графты провоцируют тромбозы, отторжение, хроническое воспаление и имеют весьма посредственные механические свойства.
В связи с этим особо актуальным является вопрос поиска нового альтернативного сосудистого кондуита, который бы позволил избежать недостатков имеющихся сосудистых протезов и кондуитов. Разработки кардиоваскулярной тканевой инженерии предлагают вживление биологических трансплантатов, которые могли бы соответствовать функциональным особенностям нативного сосуда. Предполагается, что кровеносные сосуды, спроектированные методом тканевой инженерии, будут содержать жизнеспособный эндотелий и иметь механические свойства, которые бы соответствовали нативным сосудам, без синтетических материалов, которые провоцируют хронические воспалительные реакции. В отличие от нативных сосудов, сосуды, полученные методом тканевой инженерии, обеспечили бы потребность в кондуитах соответствующего диаметра, были бы свободны от возможных «бифуркаций», не страдали бы от возможных болезней и предшествующих операций [14]. Этот подход также позволил бы решить проблему заболеваемости, связанной с забором вены для шунтов [15]. Появились первые зарубежные работы, в которых показана возможность получения соединительнотканных каркасов, как для отдельных кровеносных сосудов, так и целых органов (сердце). Имеются положительные сведения об использовании регенеративных способностей стволовых клеток для восстановления функций пораженных тканей и органов. Следует отметить, что на данный момент академические исследования в области тканевой инженерии очень активны, но пока еще не было примеров настоящих клинических и коммерческих успехов.
В качестве альтернативы было предложено наносить слой эндотелия на искусственные полимерные протезы на основе политетрафлуороэтилена (ПТФЗ) и полиэти-
лена терефталата. Зндотелизация таких протезов увеличивала бы биосовместимость конструкции, значительно снижая риск тромбозов и рестенозов полимеров. На оформленные синтетические каркасы наносятся матрикс, обеспечивающий нормальную адгезию и пролиферацию клеток и собственные эндотелиальные клетки пациента. Однако «сосуды», полученные таким методом (эндотелизированные протезы), способны обеспечивать нормальную гемоциркуляцию только в течение 3^5 лет и менее чем в 50% случаев [13].
В настоящее время эталоном научных достижений в этой области могут служить эксперименты американских исследователей по созданию бесклеточного матрикса на основе соединительнотканного каркаса, полученного вследствие перфузии органа раствором детергентов. Такой каркас подсаживался в брюшную полость другого животного с подсоединением к его кровеносной системе. Перфузия трансплантата кровью животного-хозяи-на приводила к формированию мышечной структуры сосудов и сердца и появлению признаков нормальной функциональной активности органа.
Революционным направлением в сосудистой хирургии может стать применение полноценных тканеинженерных конструкций. Такие биоискусственные сосуды представляют собой 2- или 3-слойные тканево-клеточные структуры, выращиваемые в особых условиях in vitro на полом цилиндрическом биодеградируемом матриксе. Первым этапом на биополимер наслаивают гладкомышечные клетки стенки артерий, затем — эндотелиальные клетки, и третий слой (присутствующий не всегда) — адвентицию. Конструкция культивируется в специальных биореакторах в режиме «пульсирующей гидродинамической струи» около месяца. Рядом лабораторий были созданы такие конструкции и испытаны in vivo [16]. Уже несколько лет идут клинические испытания тканеинженерных сосудистых трансплантатов, однако только для протезирования крупных сосудов [17^ 19]. Замена сосудов меньшего диаметра (менее 6 мм во внутреннем диаметре) остаётся на данный момент практически нерешённой проблемой в связи с тромбо-генностью графтов, провоцируемой ими гиперплазией интимы и атеросклеротическими изменениями [20]. Биоинженерия в этой области пока остаётся в основном на уровне экспериментов in vitro или использовании моделей у животных.
Разрабатываются всё новые и новые подходы к проблеме создания тканеинженерных сосудов из аутогенных клеток человека. Недавно группой N.L’Heureux была предложена новая модель создания in vitro таких трансплантатов и получены многообещающие результаты при их испытаниях in vivo.
Для создания трансплантатов исследователи использовали человеческие фибробласты, выделенные из биопсийного материала кожи пациентов с тяжёлыми формами сердечно-сосудистых заболеваний. Эти трансплантаты были получены новым методом так называемой «послойной тканевой инженерии». Фибробласты культивировались в условиях, стимулирующих продукцию хорошо организованного внеклеточного матрикса, который формировал плотный «листок», с лёгкостью отделявшийся от поверхности культурального пластика. Такие «листки», состоящие из внеклеточного матрикса и клеток, могут в дальнейшем использоваться для конструирования трёхмерной модели сосуда, обладая всеми необходимыми механическими качествами [21]. Для этого «листки» последовательно оборачивались вокруг временной основы из нержавеющей стали с тефлоновым
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 2, 2009
Обзоры
покрытием, а затем освобождались от фибробластов и засевались клетками эндотелия. В итоге получалась модель, состоящая из адвентиции, бесклеточной внутренней мембраны и эндотелиального внутреннего слоя. Такой биоинженерный сосуд имел внутренний диаметр 4,2 мм при толщине стенки 407 мкм. Испытания физических свойств in vitro (через модель пропускался поток жидкости) подтвердили его прочность.
Затем свойства потенциального трансплантата были проверены in vivo. Сначала человеческие трансплантаты (с внутренним диаметром 1,5 мм) были пересажены иммуннонекомпетентным крысам (nude) в область абдоминальной части аорты (анастомоз). 12 из 14 «двухслойных» трансплантатов успешно интегрировались в окружающие ткани. Кровотечения обнаружено не было, равно как и сужения просвета сосуда или образования аневризм. Диаметр сосуда оставался стабильным на протяжении всего эксперимента (6 мес.), и, несмотря на отсутствие применения антикоагулянтов, в 85% процентах случаев не было отмечено образования тромбов. Гистологический анализ трансплантата на 90-й день от начала эксперимента показал целостность мембраны и отсутствие клеточной инфильтрации. То есть её матрикс не обладал иммуногенными свойствами и не провоцировал воспалительной реакции, часто приводящей к стенозу. К шестому месяцу толщина сосудистой стенки и внутренний диаметр графта также нисколько не изменились. Ультраструктурное исследование выявило организацию клеток и экстраклеточного матрикса, характерные для нормальных тканей. В адвентиции были обнаружены клетки, положительные по —-актину, что может указывать на возможное участие в регенерации гладкомышечных клеток, мигрировавших из мест анастомозов, а также циркулирующих в крови прогениторных клеток.
Сосуды с внутренним диаметром 4,2 мм показали хорошие биомеханические и биологические свойства в стандартном эксперименте (на фоне иммуносупрессии и тромболитиков) по созданию анастомозов на 4 собаках. Чтобы проверить качества трансплантата в более близком к человеческому биомеханическом окружении, графты с внутренним диаметром 4,2 мм были имплантированы трём макакам, которым предварительно была проведена иммуносупрессия. Ультразвуковое исследование, компьютерная томография-ангиография и биопсии подтвердили, что все сосуды не были подвержены клеточной инфильтрации и не демонстрировали признаков сужения или образования аневризм. На гистологических срезах был заметен умеренный иммунный ответ, образование артерио-артериальных анастомозов и покрытая нормальным эндотелием внутренняя мембрана. Также были найдены позитивные по —-актину клетки в составе адвентиции. Более того, такие же клетки присутствовали и в окружающей сосуды ткани.
Таким образом, с использованием оригинального методического подхода (послойное формирование сосуда), были разработаны тканеинженерные трансплантаты, в полной мере обладающие необходимыми для клинического применения качествами. В экспериментах in vivo сосуды продемонстрировали достаточно высокую прочность, стимулировали регенерацию и ангиогенез, препятствовали развитию аневризм. Нормальный эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность графта, препятствовал тромбозам и не подвергался лимфоидной инфильтрации.
Это исследование было максимально приближено к клинических условиям, поскольку кровеносные сосуды
полностью «сконструированы» из собственных клеток пациентов. Кроме того, сосуды были испытаны сразу в 3-х in vivo моделях (крыса, собака, обезьяна). Другим неоспоримым преимуществом работы является то, что авторы изучали судьбу сосудов в течение длительного времени — полгода после трансплантации. То есть, можно предположить, что в клинике такие сосуды могут «прослужить» длительное время без развития осложнений. Впервые модель была опробована на приматах, то есть в биомеханическом окружении, практически на 100% соответствующем условиям организма человека. Разработанные трансплантаты успешно зарекомендовали себя в замене поврежденных сосудов и далее могут проходить клинические испытания, которые должны подтвердить эффективность конструкции у пациентов.
В 2005 г. Американская ассоциация сердца опубликовала сообщение группы авторов о первом клиническом опыте использования кровеносного сосуда, полученного методом тканевой инженерии. Сосуд был изготовлен с использованием фибробластов, полученных при кожной биопсии и эндотелиальных клеток из подкожной вены. Сосуд, длиной 17 см и диаметром 4,7 мм был имплантирован как артерио-венозный шунт между плечевой артерией и аксиллярной веной у двух пациентов, которые вынуждены были длительное время находиться на диализе. Хорошая функция графта была подтверждена ультразвуковым исследованием и компьютерной томографией. Непродолжительное наблюдение за пациентами показало удовлетворительный кровоток, без признаков тромбообразования или механических повреждений.
В октябре 2007 г. New England Journal of Medicine [22] опубликовал статью «Tissue-Engineered Blood Vessel for Adult Arterial Revascularization» о клинических результатах использования артерио-венозных шунтов у 10 пациентов, находящихся на гемодиализе. Сосуды были изготовлены с применением той же самой технологии. Пациенты имели типичные для терминальной почечной недостаточности факторы риска, включая предварительно неудавшуюся попытку установки графта для диализа, сахарный диабет, контролируемую артериальную гипертензию, ожирение. Возраст пациентов колебался от 29 до 89 лет. Потентность сосудистого графта была оценена с помощью ультразвукового исследования и ангиографии. Сосуды были получены из аутогенных клеток пациента. Цель исследования состояла в том, чтобы показать, что кровеносный сосуд, созданный путем тканевой инженерии, полученный in vitro, мог выдержать нагрузку артериального давления в артерио-веноз-ной фистуле в течение, по крайней мере, 3 мес. После этого времени сосудистые графты были пунктированы в качестве доступа для гемодиализа. У трех пациентов в течение 5 мес. наблюдались нормально функционирующие артериовенозные шунты. Изучение эластичности сосудистого графта, производимое при помощи ультразвукового исследования на 5 мес. наблюдения показало возрастание в 4,8 раз для первого пациента и 2,7 кратное для четвертого пациента, относительно доопераци-онных величин без сопутствующей дилатации или доказательств механической деградации. Это может служить индикатором формирования эластичного компонента, аналогичного доклиническим испытаниям.
Потенциальные выгоды от использования сосудов, полученных методом тканевой инженерии, могут превысить любые дополнительные риски, связанные с отсроченной хирургической операцией, особенно у пожилых пациентов, с хронической стабильной стенокардией.
Обзоры
Не удивительно, что многие группы исследователей попытались решить ведущую проблему продолжительности «выращивания» новых сосудов сосредотачиваясь на бесклеточных методиках, которые являются более приоритетными в плане простоты технологии. В то время, как эти имеющиеся в наличии подходы более предпочтительны на первый взгляд, они не в состоянии изменить к лучшему результаты с трансплантатами из политетрафлорэтилена. В качестве контраста тканевая инженерия является более дорогостоящей и сложной, но в перспективе обещает быть значительно более эффективной. Действительно, такие сложные и дорогостоящие технологии, получившие фактическое применение, (например, ЯМРТ или Холтер-электрокардиография), смогли со временем достигнуть широкого распространения и клинического использования, поскольку технические инновации в экономических масштабах уменьшают стоимость и увеличивают доступность [23].
Согласно вышеизложенному, представляется интересной разработка технологии поэтапного получения «новых» сосудов на основе децеллюляризованного матрикса. Примером получения подобной матрицы является работа Е. Ропк и соавт., 2007. В этой работе получены и исследованы структура, упругость и сопротивление давлению децеллюляризованной каротидной артерии свиньи. Для получения бесклеточного матрикса была использована сложная многоступенчатая технология, включающая последовательную обработку гипотониче-сой средой, гипертонической средой с добавлением 1% тритона Х-100, ферментативной средой (0,2 мг/мл ДНКазы и 20 мкг/мл РНКазы), средой с 1% БОБ при постоянном встряхивании в течение нескольких суток. Полученные сосуды были частично децеллюляризова-ны, с повышенной упругостью, несколько сниженным сопротивлением давлению. Данная работа является хорошей предпосылкой для дальнейшей разработки технологии получения сосудистых каркасов для трансплантации в них эндотелиальных клеток и воссоздания нормальной структуры «нового» сосуда.
Несмотря на обширный арсенал медицинских технологий, позволяющий более или менее успешно противостоять патологиям сердца и сосудов, кардинального решения проблемы нет до сих пор. Основной причиной повреждения сердца в большинстве случаев служит нарушение адекватного кровообращения по коронарным сосудам. Атеросклероз сосудов является первопричиной огромного количества заболеваний и не всегда успешно поддается лечению. В запущенных случаях единственно реальной возможностью становится замена органа. Трансплантация донорских органов сопряжена с множеством этических, моральных и правовых трудностей, не говоря уже об опасности отторжения трансплантата. Но, тем не менее, приблизительно 3 ООО больных в США ждут донорское сердце; во всем мире 22 млн человек живут с сердечной недостаточностью. Пересадка сердца является единственным методом лечения сердечной недостаточности в терминальной стадии, но количество доноров ограничено. После пересадки сердца пациент должен пожизненно принимать иммунодепрессанты, часто наблюдается развитие артериальной гипертензии, диабета, почечной недостаточности [24].
Искусственные органы не способны в полной мере выполнять функции, заложенные природой по причине невозможности воссоздания сложной нервно-гуморальной системы регуляции процессов при адаптации к изменяющимся факторам внешней и внутренней среды. В этих условиях идеальным решением проблемы явля-
ется разработка медицинских технологий, позволяющих исправлять дефекты органа путем выращивания новой ткани на основе естественных каркасов. Создание искусственного сердца — одно из самых амбициозных устремлений в области развивающейся тканевой инженерии.
Созданное искусственно «биологическое» сердце — теоретическая альтернатива пересадке или искусственному механическому желудочку. Попытки получить методом тканевой инженерии сердечную ткань включали многочисленные методики [25]. Создание «биологического» сердца требует разработки кардиальной архитектуры, соответствующих клеточных компонентов и обеспечения насосной функции. Создаваемые контрак-тильные кольца и пластины при испытаниях на опытных животных улучшали функцию левого желудочка [26— 28]. Однако, создание «сердечной заплаты» было ограничено неспособностью поддерживать геометрию сердца, необходимую для поддержки высокой потребности кардиомиоцитов в кислороде и энергетической потребности на глубине более 100 мкм от поверхности трансплантата [25]. Использование каналов конструкции экстрацеллюлярной сердечной матрицы, носителей кислорода и сложных кардиотонических растворов усиливало прямое соотношение между объемом перфузии и размерами трансплантата или «плотностью» клеток [29]. Для создания целого сердца с объемной структурой и васкуляризацией была предпринята попытка «децеллю-лирования» сердец животных (крыс) путем коронарной перфузии с детергентами, чтобы получить бесклеточ-ный тканевой комплекс для дальнейших манипуляций [30—34]. Авторы «децеллюлировали» сердце методом коронарной перфузии с детергентами, сохраняли внеклеточный матрикс и создавали бесклеточную перфу-зирумую архитектонику сердца, бесклеточные клапаны и неповрежденные камеры сердца. Затем для имитации сердечно-клеточной композиции эта конструкция повторно «заселялась» неонатальными сердечными клетками или аортальными эндотелиальными клетками и культивировалась в моделируемых физиологических условиях до «созревания» органа. Для восстановления сердечных функций, продержали 8 подобных конструкций в течение 28 сут. в биореакторе, который симулировал нормальную физиологию сердца. На 4-е сут. макроскопически наблюдали сердечные сокращения. На 8-е сут. под действием физиологической нагрузки и электрической стимуляции конструкции могли выполнять насосную функцию (эквивалентную 2% работы сердца взрослых или 25% работы сердца 16 недельного плода) [35]. В конечном счете — постоянная коронарная перфузия, пульсация левого желудочка и синхронизированная левожелудочковая стимуляция приводили к формированию контрактильного миокарда, который мог выполнять насосную функцию.
Спонтанное сокращение эксплантантов сердца и выращивание культуры кардиомиоцитов (КМЦ) активно изучали многие исследователи в течение нескольких поколений. Впервые сердечная ткань была получена в конце 1950-х гг.: A. Moscona получил сферическую совокупность из клеток сердца куриного эмбриона, выращивая свежеизолированные клетки в колбах Зрленмейера при непрерывном перемешивании. Через 18 час. в этом простом биореакторе формировалась совокупность, содержащая до 200 клеток. Многие исследователи адаптировали модель A. Moscona’s для своих работ и нашли, что данные совокупности были функционально более подобными неповрежденной сердечной ткани, чем стандартные двухмерные монослойные культуры. Эта
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009
Обзоры
работа доказала, что изолированные клетки-предшественницы КМЦ сохраняют способность образовать ткань, подобную сердечной, в условиях клеточной культуры.
Другое важное открытие указывает на то, что КМЦ имеют генетически детерминированную тенденцию к агрегации. При длительном культивировании на содержащих сыворотку питательных средах высокой плотности исследователи часто наблюдают, что весь ритмично сокращающийся монослой отделяется от поверхности культуры, формируя слой спонтанно сокращающихся КМЦ, плавающий на поверхности среды. Поскольку эти слои, лишенные механической нагрузки, быстро прекращали сокращаться, процесс отделения клеток считали недостатком клеточной культуры при проведении эксперимента. Однако Т. Shimizu и коллеги использовали свободный плавающий монослой для получения свободного экзогенного матрикса сердечной ткани. В конце 1980-х гг., Н. Vandenburgh и коллеги искали решение преодоления проблемы отделения культуры дифференцированных скелетных мышечных волокон (имеют сходную с КМЦ сократительную способность) и предложили покрывать их культуру слоем недавно нейтрализованного коллагена I для создания постоянной механической нагрузки на клетки. Это позволяло улучшить диф-ференцировку клеток. Подобные наблюдения были получены ранее и для других типов клеток, когда коллаген наносили на или под монослой, или помещали клетки в гель коллагена. Например, тироциты, культивируемые в коллагене, организовывались в фолликулы, эпители-оциты почек и молочной железы формировали протоки, напоминающие нативные. Эти данные доказывают, что трехмерное окружение в коллагеновом геле способствует формированию ткани и клеточной дифференциров-ки различных типов клеток in vitro.
Другой подход в тканевой инженерии сердца направлен на поиск способов получения улучшенной сердечной модели in vitro, позволяющей измерять силу сокращений, и проводить генетические, фармакологические и механические манипуляции под контролем in vitro. Решением была адаптация метода, ранее развитого для эмбриональных фибробластов M.S. Kolodney и E.L. Elson, (1993). По существу, КМЦ культивировались в коллагеновом геле, но между двумя стеклянными трубками, которые были помещены в прямоугольные углубления и закреплены на фиксированном расстоянии с помощью металлической распорки. При таком культивировании клетки, объединяясь, формировали спонтанно сокращающуюся сеть, которая прикреплялась к стеклянным трубкам и могла быть соединена с преобразователем механической силы для регистрации силы сокращения. Продолжительное циклическое растяжение искусственной сердечной ткани (ИСТ) увеличивало силу сокращения и стимулировало развитие сердечной ткани.
Параллельно развивались два других, принципиально различных подхода тканевой инженерии. Одна из первых групп исследователей первоначально использовала в качестве основы полигликоевую кислоту в комбинации с культурами, выращенными в биореакторе. Параллельно, R.K. Li и соавт. заселяли эмбриональные желудочковые КМЦ крыс на желатиновую основу и имплантировали их после семидневного культивирования in vitro в сердце крысы с крионекрозом. Спонтанная сократительная активность регистрировалась как in vivo, так и in vitro, но гистологические микрофотографии выявили, главным образом, клетки неизвестного происхождения, погруженные в материал подложки, и плохое развитие саркомеров в некоторых КМЦ, представленных в
структуре. J. Leor и др. разработали альгинатную подложку, засеваемую эмбриональными КМЦ, с последующей имплантацией в сердце крысы. Конструкция была высоко васкуляризирована, но до конца не встраивалась в миокард реципиента. Важное преимущество данного подхода — формирование матрицы, на основе которой твердые материалы могут быть сформированы в любой трехмерной геометрической форме. Недостатки данного подхода: низкое механическое сопряжение, освобождение потенциально токсичных веществ во время деградации и несовместимость с физиологическим ростом клеток. КМЦ выживают в течение некоторого времени и начинают сокращаться на таких искусственных подложках, но остаются в значительной степени разобщенными и не формирует когерентно сокращающуюся сердечную ткань.
Альтернативно развивается смешанный подход, сочетающий выращивание КМЦ новорожденных крыс на коллагеново-матригелевой основе с длительной электрической стимуляцией. Это позволило формировать сердечную ткань с улучшенными морфологией и сократительной функцией по сравнению с нестимулируемыми культурами. Следовательно, электрическая стимуляция приводит к дифференцированию сердечной ткани подобно механическому воздействию. Электрическая активность — прямой стимул для дифференцирования и формирования ткани или это следствие сокращения клеток при стимуляции — экспериментально пока невозможно выяснить. Работа М. Radisic et al., 2004, также поддержала мнение, что лучшей биологической внеклеточной матрицей является комплекс коллаген-ламинин (ламинин представлен в высокой концентрации в мат-ригеле) для получения сердечной ткани.
Третий подход можно назвать тканевой инженерией без матрицы: обработка и систематизация отдельных клеточных монослоев после длительного культивирования. Shimizu и коллеги использовали термочувствительное поверхностное покрытие для культуральных чашек, что позволяет КМЦ (или любым другим типам клеток) находиться при 37°С и их можно отделять при комнатной температуре как неповрежденный монослой. Эти сокращающиеся монослои можно складывать, формируя связанные трехмерные слои сердечной ткани до 50^75 мкм толщиной. Преимущество этой техники — относительная независимость от потенциально иммунногенных или патогенных материалов подложки.
Наконец, еще один подход может состоять в том, чтобы создать новую сердечную ткань, вводя жидкие, «кардиогенные» матричные смеси в сердце, с клетками или без них. Эта «тканевая инженерия in situ» основана на предпосылке что подходящие матрицы будут посылать соответствующие сигналы сердечным «прародителям», таким как c-kit, sca-1 и isl-1 клеткам, для пролиферации и формирования новой ткани сердца.
Важные структурные особенности дифференциров-ки КМЦ — организация саркомеров, поперечная исчер-ченность, связь клеток через десмосомы, образование пар Т-тубуло-саркоплазматической сети на уровне Z-группы. Эти особенности наблюдались в сердечных биоконструкциях при длительном растяжении или электрической стимуляции, что указывает на стимулирующую роль этих условий на конечную дифференцировку сердечной ткани.
Таким образом, определены критические факторы для тканевой инженерии сердечной ткани in vitro:
— подходящая биологическая матрица (коллаген I, IV и ламинин;
Обзоры
— механическая нагрузка;
— полное соединение клеток сердца;
— электрически стимулируемая или спонтанная сократительная активность.
Одной из центральных нерешенных проблем всех разработанных подходов — ограничение размера, который определен максимальными расстояниями для передачи питательных веществ и кислорода. Ни одна из нынешних технологий не производит биоконструкций, в которых мышечные полоски превышают 50^100 мкм. На ранних опухолях было показано, что в отсутствие капилляризации и перфузии, опухоли, внедренные в мышей, не достигали размера больше, чем 2^3 мм. Однако развитие событий в данном аспекте зависит от метаболических потребностей и клеточной плотности соответствующей ткани. У сокращающихся КМЦ очень высокая метаболическая активность. Соответственно, плотность капилляров во взрослом сердце очень высока, составляя приблизительно 2400^3300 мм2 у крыс и человека (межкапиллярное расстояние 19^20 мкм). С другой стороны, раннее эмбриональное сердце крысы и взрослое сердце лягушки — аваскуляризованы и питаются исключительно кровью, циркулирующей в пределах системы трабекул. Таким образом, крупные сердечные мышцы развиваются физиологически через вас-куляризацию или через интенсивную трабекуляризацию с одиночными волокнами, меньшими чем 50^75 мкм. В биоконструкциях сеть из волокон КМЦ состоит из мышечных связок диаметром 30^50 мкм. Только в некоторых компактных частях мышечные волокна достигают толщины до 100 мкм. Таким образом, можно срастить 3^4 монослоя КМЦ, не утолщая ткань.
Некоторые исследователи увеличивают поставку кислорода и питательных веществ для биоконструкций в биореакторах, увеличивая концентрацию кислорода и добавляя кислородные курьеры, такие как перфлюо-рокарбон. Такая оптимизация условий оказала благоприятное воздействие на плотность и метаболизм клеток в культуре и позволила смоделировать образование сердечной ткани с клинически значимой толщиной в 500 мкм.
Другая стратегия состоит в том, чтобы стимулировать ангиогенез в сердечных биоконструкциях. S. Levenberg и коллеги смешали эндотелиальные клетки и фибробласты с культурой скелетных миобластов на синтетическом полимере и наблюдали образование скелетной мышцы с увеличенной плотностью сосудистых структур.
Ранние исследования R.K. Li и J. Leor показали, что внедренные в сердце КМЦ были видимы в течение длительного времени после внедрения, несмотря на отсутствие иммунодепрессии, но никаких доказательств развития новой сердечной ткани не было предоставлено. Т. Shimizu продемонстрировал выживание и васкуляри-зацию их «бутербродной» конструкции и зарегистрировал сократительную активность после ее внедрения в сердце крыс. Выживание, васкуляризацию и диффе-ренцировку КМЦ после внедрения в сердце крысы наблюдали в присутствии иммунодепрессантов. Но даже при том, что эти данные все вместе предполагают, что биоконструкции быстро васкуляризуются после внедрения, и гипоксия в течение и после внедрения не является главной проблемой выживания клеток, несколько важных вопросов остаются без ответа.
1. Действительно ли достаточна васкуляризация?
2. Сколько из внедренных КМЦ сохраняет жизнеспособность в отдаленном периоде?
3. Соединяются ли трансплантированные клетки электрически и механически с миокардом?
4. Увеличивает ли введение сердечных конструкций полезную работу сердца?
Ранние исследования показали увеличение развиваемого давления и сердечного выброса, в изолированном Langendoгff-пepфyзиpyeмoм сердце. Однако эффекты были малы, и о подобных эффектах сообщали в малочисленных исследованиях по введению клеток. Таким образом, преимущества прививания трехмерной конструкции по сравнению с инъекцией клеток остаются неясными.
Как обрисовано в общих чертах выше, оптимальной матрицы для развития сердечной ткани еще не найдено. Альгинат, желатин, полигликолевая или полимолочная кислоты, используемые для формирования хряща, кости, уха, кожи, кровеносных сосудов, или клапанов сердца, вряд ли будут являться материалами выбора для формирования ткани миокарда. Причина — в физиологических свойствах сердечной мышечной ткани, особенно потребности в высокой механической стабильности и большой согласованности клеток. Кроме того, мышечные волокна в сердечных слоях располагаются с различной ориентацией для оптимального обеспечения сократительной функции.
Важной концептуальной проблемой сердечной инженерии является поиск подходящего источника клеток. Желудочек взрослого человека содержит 5x10° КМЦ, то есть, 40 млн КМЦ на грамм миокарда. Отсюда следует, что создание даже маленького участка ткани потребовало бы десятков миллионов КМЦ. Одним из возможных подходов, получивших в последние годы широкое распространение, стало использование стволовых клеток, существующих во взрослом организме, который могут дать начало формирования взятого у той же особи КМЦ, так же, как клетки эндотелия и ГМК. Такие клетки найдены в различных тканях, включая костный мозг, периферическую кровь, пуповину, и жировую ткань.
Все аллогенные методы лечения стоят перед проблемой иммунносовместимости. Другая проблема состоит в том, что большинство обычно используемых сред чужеродно (эмбриональная сыворотка коров, сыворотка лошади, эмбриональный экстракт цыпленка, матригель, коллаген) и может спровоцировать иммунный ответ.
Части вышеперечисленных недостатков лишены методы, основанные на децеллюларизации поврежденного органа и наслаивание (рецеллюларизация) на полученную матрицу собственных стволовых клеток. На сегодняшний день существует несколько технологических приемов децеллюларизации, их можно разделить на 2 группы: физические и химические методы.
Физические методы представлены следующими подходами:
— замораживание (внутриклеточные кристаллы льда разрушают клеточную мембрану);
— механическое раздавливание клеток;
— механическое перемешивание («отшелушивание» клеток);
— разрушение клеток ультразвуком.
Недостаток этих методов — возможное повреждение экстрацеллюлярной матрицы. Большого распространения эти методы, как самостоятельные, не получили.
Химические методы:
— обработка неионными детергентами (тритон Х-100). Разрушение липид-липидных и липид-белковых взаимосвязей при сохранении белок-белковых взаимосвязей. Результаты неоднозначны, зависят от типа обрабатываемой ткани.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009
Обзоры
— обработка ионными детергентами (SDS, дезок-сихолат натрия, тритон Х-200). Наилучший результат показан при применении SDS. Солюбилизация цитоплазматических и ядерных мембран, денатурация белка, удаляет остатки ядра и цитоплазматических белков, возможно нарушение нативной структуры ткани и повреждение коллагена.
— обработка цвиттерионными детергентами (CHAPS, SB-10, SB-16). Действуют по типу ионных и неионных детергентов. Как и в случае с тритоном Х-100 и Х-200 возможно нарушение структуры ткани, повреждение коллагена.
— обработка гипотоническими и гипертоническими растворами. Лизис клеток вследствие осмотического шока. Эффективно для лизиса клеток, но не удаляет клеточные остатки.
— обработка ЭДТА и ЭГТА. Хелатирующие агенты, которые связывают двухвалентные ионы металлов, в результате клетки разрушаются вследствие адгезии с экстрацеллюлярной матрицей. Не используют отдельно, обычно с ферментами (например, трипсином).
Отдельно выделяют в химических методах ферментативную обработку:
— трипсином. Разрушает пептидные связи с С-кон-ца. Длительная обработка трипсином может повредить матрицу. Удаляет ламинин, фибронектин, эластин.
— эндонуклеазами. Катализируют гидролиз внутренних связей рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых цепей. Трудно удаляются из тканей и могут спровоцировать иммунный ответ.
— экзонуклеазами. Катализируют гидролиз конечных связей рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых цепей.
Для предотвращения повреждения нативной структуры экстрацеллюлярной матрицы ферментами используют ингибиторы ферментов, такие как фенилметилсуль-фонилфлуорид, апротонин, лейпептин, либо лимитируют работу ферментов, изменяя температуру или pH среды.
Для эффективного и успешного получения децеллю-ларизованного матрикса при химической обработке используют совокупность нескольких факторов. Например, для удаления клеточного материала с легочного клапана
сердца свиньи K. Schenke-Layland (2003) использовал сочетание 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА при механическом перемешивании в течение 24 час. R.W. Grauss (2005) для очистки аортального клапана сердца свиньи использовал сочетание 0,5% трипсина, 0,05% ЭДТА, 0,02 мг/мг ДНКазы, 20 мкг/мл РНКазы и 0,02% гента-мицина.
Обычно подготовка экстрацеллюлярного матрикса требует длительной предварительной работы по поиску наиболее подходящих условий для децеллюляризации выбранного объекта. Примером данного подхода могут служить исследования Н.С. Ott и соавт. (2008) по деи рецеллюляризации сердца крысы. Изначально использовались четыре различных способа: с использованием SDS, полиэтиленгликоля, тритона Х-100 и ферментов. Наилучший результат был получен при перфузии сердца SDS. Полученное децеллюляризованное сердце заселялось пятикратной инъекцией клеток (неонатальные кардиомиоциты, гладкие миоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки). Электрическая стимуляция применялась через 24 час. после имплантации клеток. В конечном счете, на 8-е сут. была получена конструкция с частично восстановленной структурой миокарда, развивающая некоторое давление и силу сокращений. Несмотря на то, что образованная конструкция далека от совершенства, полученные результаты являются весьма обнадеживающими.
И, наконец, прорывом в этой области служат эксперименты американских исследователей по созданию биоискусственного сердца на основе соединительнотканного каркаса, подсаженного в брюшную полость другого животного с подсоединением к его кровеносной системе. Перфузия трансплантанта кровью животного-хозяина приводила к формированию мышечной структуры сердца и появлению признаков нормальной функциональной активности органа.
Отечественных работ посвященных использованию этих технологий в области сердечно-сосудистой хирургии мы не встретили. Поэтому разработка собственных наработок в эксперименте с последующей возможностью внедрения их в клиническую практику является несомненно актуальной.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бокерия Л.А., Бузиашвили Ю.И., Работников B.C. и др. Острый коронарный синдром. Возможности диагностики и лечения — М., 2004.
2. Бокерия Л.А., Стрижакова Л.Л., Юшкевич Т.И. Анализ научной эффективности научно-исследовательских работ и методические основы построения целевой исследовательской программы по проблеме хирургического лечения заболеваний сердца и сосудов. В кн.: Грудная и серд.-сосуд. хир. 1997: 36-40.
3. Бокерия Л.А., Георгиев Г.П., Голухова Е.З. и др. Клеточные и интерактивные технологии в лечении врожденных и приобретенных пороков сердца и ишемической болезни сердца. Вестник РАМН 2004; 9: 48-55.
4. Бокерия Л.А., Стрижакова Л.Л., Юшкевич Т.И. К вопросу о планировании научных исследований [обзор литературы]. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН 2004; 5(101: 46-61.
5. Taylor L.M., Edwards J.M., Porter JM. Present status of reversed vein bypass grafting: five-year results of a modern series. J. Vase. Surg. 1990; 11: 193-205.
6. Veith F.J., Gupta S.K., Ascer E. et al. Six year prospective multicenter randomized comparison of autologous saphenous vein and expanded polytetrafluoroethylene grafts in infrainguinal arterial reconstructions. J. Vase. Surg. 1986; 3: 104-14.
7. Sapsford R.N., Oakley G.D., Talbot S. Early and late patency of expanded polytetrafluoroethylene vascular grafts in aorta-coronary bypass. J. Thorac. Cardiovasc. Surg 1981; 81: 860-4.
8. Quinones-Baldrich W.J., Prego A., Ucelay-Gomez R. et al. Failure of PTFE infrainguinal revascularization: patterns, management alternatives, and outcome. Ann. Vase. Surg. 1991; 5: 163-9.
9. Seeger J.M. Management of patients with prosthetic vascular graft infection. Am. Surg. 2000; 66: 166-77.
10. Sarkar S., Salacinski H.J., Hamilton G., Seifalian A.M. The mechanical properties of infrainguinal vascular bypass grafts: their role in influencing patency. Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 2006; 31: 627-36.
11. Murray-Wijelath J., Lyman D.J., Wijelath E.S. Vascular graft healing—III: FTIR analysis of ePTFE graft samples from implanted bigrafts. J. Biomed. Mater .Res. B Appl. Biomater. 2004; 70: 223-32.
12. Hagerty R.D., Salzmann DL, Kleinert LB, Williams SK. Cellular proliferation and macrophage populations associated with implanted expanded polytetrafluoroethylene and polyethyleneterephthalate. J. Biomed. Mater. Res. 2000; 49: 489-97.
13. Baguneid M.S., Seifalian A.M., Salacinski H.J. et al. Tissue engineering of blood vessels. Brit. J. Surg. 2006; 93: 282-90.
14. Lamm P., Juchem G., Milz S., Reichart B. Continuous graft perfusion: optimizing the quality of saphenous vein grafts. Heart. Surg. Forum 2002; 5 [Suppl 41: S355-61.
15. Lavee J., Schneiderman J., Yorav S., Shewach-Millet M. Complications of saphenous vein harvesting following coronary artery bypass surgery. J. Cardiovasc. Surg. [Torino] 1989; 30: 989-91.
16. Shin'oka T. Clinical results of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. Nippon Geka Gakkai Zasshi 2004; 105: 459-63.
17. Hibino N.. Imai Y., Shin’okaT. et al. [First successful clinical application of tissue engineered blood vessel], Kyobu Geka 2002; 55: 368-73.
18. Naito Y., Imai Y., Shin’oka T. et al. Successful clinical application of tissue-engineered graft for extracardiac Fontan operation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2003; 125: 419-20.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009
■ И I II II
■TD
Обзоры
19. Matsumura G., Hibino N.. Ikada Y. et al. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterial. 2003; 24: 2303-8.
20. Isenberg B.C., Williams C., Tranquillo R. Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ. Res. 2006; 98: 25-35.
21. L’Heureux N.. Paquet N.. Labbe R. et al. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 1998; 12: 47-56.
22. L’Heureux N.. Todd N.. McAllister T.N. Tissue-Engineered Blood Vessel for Adult Arterial Revascularization. New. Engl. J.Med. 2007; 357(141: 1451-3.
23. L’Heureux N.. Dusserre N.. Marini A. et al. Technology Insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. J. Nature Clinical Practice Cardiovasc. Med. 2007; 4: 389-95.
24. Kobashigawa J.A., Patel J.K. Immunosuppression for heart transplantation; where are we now? Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2006; 3: 203-12.
25. Eschenhagen T., Zimmermann W.H. Engineering myocardial tissue. Clrc. Res. 2005; 97: 1220-31.
26. Zimmermann W.H., Melnychenko I., Wasmeier G. et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nat. Med. 2006; 12: 452-8.
27. Sekine H., Shimi Z.U., Kosaka T. et al. Cardiomyocyte bridging between hearts and bioengineered myocardial tissues with mesenchymal transition of mesothelial cells. J. Heart Lung Transplant. 2006; 25, 324-32.
28. Robinson K.A., Li J., Mathi son M. et al. Extracellular matrix scaffold for cardiac repair. Circul. 2005; 112: 1135-43.
29. Park H., Radisic M., Lim J.O. et al. A novel composite scaffold for cardiac tissue engineering. In Vitro Cell. Del’. Bioi. Anim. 2005; 41, 188-96.
30. Dellgren G., Eriksson M.J., Brodin L.A., Radegran K. Eleven years’ experience with the Biocor .tenttess aortic bioprosthesi; clinical and hemodynamic follow up with long term relative survival rate. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2002; 22: 912-21.
31. Rieder E., Kasimir M.T., Silberhumer G. et al. Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004; 127: 399-405.
32. Ketchedjian A., Jones A.L., Krueger P. et al. Recellularization of decellularized allograft scaffolds in ovine great vessel reconstruction. Ann. Thorac. Surg. 2005; 79, 888-96.
33. Chen R.N., Ho H.O., Tsai Y.T., Sheu M.T. Process development of an acellular dermal matrix [AOM] for biomedical applications. Biomateral. 2004; 25: 2679-86.
34. Gilbert T.W., Sellaro T.L., Badylak S.F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterial. 2006; 27: 3675-83.
35. Ott H.C., Matthiesen T.S., Goh S.-K. et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. J. Nature Med. 2008; 14(21: 214-21.
Поступила 18,12,2008
А
