CC BY
192
А. В. Коканина (асп., м.н.с)1, М. Ю. Марченко (студ., инж.)1, А. В. Барков (к.вт.н., с.н.с.)1, М. И. Леонтьева (м.н.с)2, А. В. Автономова (к.б.н., с.н.с.)2,
В. А. Винокуров (д.х.н., проф., зав. каф.)1, Л. М. Краснопольская (д.б.н., зав.лаб.) 1,2
Использование базидиальных грибов с целью повышения эффективности рекультивации нефтезагрязненных почв
1 Российский государственный университет нефти и газа им. И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119331, г. Москва, Ленинский пр., 65; тел. (499) 2339589, e-mail: [email protected] 2Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, лаборатория биологически активных соединений 119021, Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11; тел. 499) 2552391, e-mail: [email protected]
A. V. Kokanina1, M. U. Marchenko1, A. V. Barkov 1, M. I. Leonteva2,
A. V. Avtonomova2, V. A. Vinokurov1, L. M. Krasnopolskaya1,2
Use of basidiomycetes to improve remediation of oil-contaminated soil
Gubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskii pr, 119331, Moscow, Russia; рh. (499) 2339589, e-mail: [email protected] 2Gauze Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences
11, Bol'shaya Pirogovskaya Str, 119992, Moscow, Russia; рh. (499) 2552391, e-mail: [email protected]
Изучена способность отдельных штаммов базидиальных грибов использовать в процессе жизнедеятельности в качестве источника углерода компоненты нефти. Установлено, что отобранные в результате скрининга штаммы грибов активно колонизируют нефтезагрязненный субстрат. В условиях модельного эксперимента показана способность утилизации углеводородов штаммом базидиомицета, принадлежащего роду ТтатеЬев, до 39% от контрольного уровня содержания нефти в почве, и штаммом базиди-ального гриба рода ¥отИор&1& — до 22% соот-ветственно.Способность штаммов базидиальных грибов сохранять высокую нефтеокисляющую активность в присутствии естественной почвенной микрофлоры подтверждает возможность их использования в технологии рекультивации нефтезагрязненных почв как в качестве самостоятельного метода биоремедиации, так и в сочетании с другими способами очистки нефтеза-грязненных почв.
Ability of definite strains of basidiomycetes to use oil components as the source of carbon in their life-sustaining activity is shown. It is shown that the fungi strains selected in the screening actively form colonies on oil-polluted substrates. Ability to utilize hydrocarbons is shown in a model experiment for the following strains: basidiomycete belonging to the genus Trametes utilizes up to 39% with respect to control level of oil content in the soil and basidiomycete genus Fomitopsis utilizes up to 22%, respectively. Ability of basidiomycetes strains to maintain high oil oxidizing activity in the presence of natural soil microflora confirms their potential to be used in techniques of recultivation of oil-polluted soil both as a self-consistent method of bioremediation and in combination of other techniques of oil-polluted soil cleaning.
Key words: basidiomycetes; bioremediation; oil-polluted soil.
Ключевые слова: базидиомицеты; биоремедиация; нефтезагрязненная почва.
Дата поступления 20.05.10
В мире ежегодно добывается более 4.0 млрд т сырой нефти. При добыче, транспортировке и переработке теряется около 50 млн т нефти и нефтепродуктов. В результате значительные территории суши и обширные акватории загрязняются углеводородами нефти 1. В России добыча нефти составляет 400—450 млн т/год 2, при этом на каждый км2 почвы в зоне месторождений и трасс нефтепроводов приходится до 0.02 т разлитой нефти в год 3.
Технологии рекультивации нефтезагряз-ненных земель включают в себя комплекс мероприятий, при реализации которых должны достигаться фоновые значения показателя по нефтепродуктам в почве. Биологические методы восстановления нефтезагрязненных земель играют важную роль в комплексе мер по рекультивации. Современные микробиологические методы рекультивации основаны на применении штаммов высокоэффективных нефтеокисляющих микроорганизмов 4. В настоящее время на российском рынке присутствуют препараты, созданные на основе одного или нескольких штаммов бактерий, а также их консорциума с дрожжами. Новым направлением в создании биопрепаратов для ремедиации нефтезгрязненных почв является использование ксилотрофных базидиомицетов, разлагающих в природе лигнин как источник углерода и энергии, а также способных деградировать широкий спектр поллютантов 5.
Ряд авторов отмечает, что устойчивый и доминирующий мицелий в почве могут образовывать только ксилотрофные грибы, а также некоторые почвенные базидиомицеты. Внеклеточная неспецифическая окислительная ферментная система, продуцируемая этими грибами, позволяет им минерализовать даже комплексные смеси поллютантов до СО2 и Н2О. Репрессии синтеза ферментов не происходит, когда концентрации веществ снижаются до уровня, который неэффективен для их индукции, и, следовательно, грибы могут эффективно деградировать даже низкие концентрации поллютантов. Поэтому считают, что базиди-альные грибы обладают значительным потенциалом для использования в биоремедиацион-ных технологиях, особенно для соединений, которые трудно разлагаются бактериями 6.
В отличие от бактерий, высшие грибы могут минерализовать полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) с 4 и более кон-
7
денсированными ароматическими кольцами . Грибы имеют большее сродство к полиарома-тическим углеводородам, а почвенные микро-
организмы минерализуют образующиеся вторичные метаболиты 8 9. Процесс деструкции ПАУ в этом случае происходит более полно, воздействие грибов делает доступными для
бактерий углеводороды с большим количе-
10
ством ароматических колец .
Способность базидиомицетов окислять ПАУ связывают с синтезом комплекса внеклеточных ферментов. Образование этих ферментов индуцируется в почвах, богатых органическим веществом (солома, опилки, щепа, лузга), тогда как бактериальная деградация ПАУ в почве, богатой органическим веществом, замедляется. Увеличенная скорость трансформации ПАУ грибами может, таким образом, стать
заметной на фоне более низкой скорости бак-
11
териальной деградации .
В связи с этим целью работы является изучение возможности применения базидиаль-ных грибов с целью повышения эффективности рекультивации нефтезагрязненных почв.
Экспериментальная часть
В работе были использовали культуры ксилотрофных базидиальных грибов из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИНА им.Г. Ф. Гаузе РАМН. Для скрининга ксилотрофных базидио-мицетов, способных колонизировать нефтеза-грязненный субстрат, было использовано 15 штаммов, относящихся к видам: Agrocibe aegerita, Flammulina velutipes, Fomitopsis pinicola, Ganoderma lucidum, Hypsizygus ulmarius, Lyophyllum shimedji, Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor.
Рабочие культуры грибов культивировали на картофельно-глюкозном агаре (КГА) в течение 5 дней при 27 0С. В качестве субстрата для скрининга использовали стерильные опилки лиственных деревьев, помещенные в чашки Петри ровным слоем толщиной 5—7 мм. В асептических условиях в чашки вносили 3 мл стерильной нефти таким образом, чтобы площадь нефтезагрязненного субстрата составляла не более j поверхности опилок. В центр чашки, поверх свободного от нефти субстрата, помещали фрагмент КГА (5П5 мм) с мицелием исследуемых базидиомицетов. Чашки инкубировали в темноте при 27 0С в течение 2 недель в аэробных условиях. Скрининг штаммов проводили по их способности колонизировать субстрат. В процессе инкубации проводили визуальный контроль скорости роста. Использовали систему оценки результатов эксперимента
по следующим критериям: способность к росту по поверхности пропитанного нефтью лигно-целлюлозного субстрата, интенсивность перехода с лигноцеллюлозного субстрата на нефтяное пятно, активность развития на нем воздушного мицелия.
Предварительную оценку способности ба-зидиомицетов утилизировать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода осуществляли экспресс-методом, культивируя грибы на песке, пропитанном нефтью. С целью удаления органических и растворимых минеральных веществ песок просеивали через сито с диаметром ячеек 1 мм, промывали водопроводной и дистиллированной водой, сушили при 120 оС до постоянного веса. Высушенный песок прокаливали в муфельной печи при температуре 500 оС в течение 2 ч. В чашки Петри вносили по 60 г песка и стерилизовали их автоклавированием при 1атм в течение 90 мин.
Перед посевом песок увлажняли, внося в каждую чашку по 3 мл стерильного минерального раствора следующего состава, г/л: MgSO4-7H2O - 0,3; КН2РО4- 3; NaNO3- 1; вода водопроводная — до 1000 мл.
При постановке эксперимента в чашки с увлажненным песком (60 г) вносили по 3.5 мл (3 г) стерильной нефти. Таким образом, массовая доля нефти в грунте составляла 5%. Контролем служили чашки без нефти.
Посевной материал помещали в центр чашек. Чашки культивировали при 27 оС в термостате. Для предотвращения пересыхания субстрата в термостат помещали емкость с водой. Каждый из вариантов эксперимента выполняли в 3 повторностях. Способность бази-диомицетов развиваться на нефтезагрязнен-ном песке оценивали по площади колонизации субстрата. Поверх чашки накладывали измерительную сетку с размером ячейки 5X5 мм и вели подсчет ячеек, соответствовавших площади колонизированной поверхности. За каждую ячейку, в которой наблюдался рост поверхностного мицелия, начисляли условный балл.
Количественную оценку способности ба-зидиомицетов утилизировать углеводороды нефти проводили на модели стерильной и нестерильной нефтезагрязненной почвы. Посевной материал грибов F. pinícola и T. versicolor получали путем твердофазного культивирования штаммов на соломе. Пшеничную солому измельчали до размеров 3—5 мм и помещали в плоскодонные конические колбы по 20 г в каждую, таким образом, чтобы высота слоя
соломы составляла не более, чем 3 см. Солому увлажняли 150 мл минерального раствора. Субстрат стерилизовали автоклавированием при 120 оС в течение 90 мин. Перед засевом в колбы вносили по 5 мл стерильного раствора с содержанием глюкозы 40% мас. Колбы засевали фрагментами музейных культур грибов на агаризованной среде, культивировали в темноте 14 сут при 27 оС. При зарастании всей видимой поверхности субстрата мицелием грибов солому в колбах аккуратно перетряхивали.
В качестве модели грунта использовали среднепахотную почву Московской области, значение рН водной вытяжки которой составляло 6.5. Почву просеивали через сито с диаметром ячеек 1 мм и помещали по 40 г в чашки Петри. В опытах использовали как нестерильную почву, содержащую естественную микробиоту, так и стерилизованную автоклавирова-нием при 1 атм в течение 1.5 ч. Перед внесением посевного материала почву в чашках увлажняли стерильной водопроводной водой.
При постановке эксперимента в чашки с увлажненной почвой вносили по 2.3 мл (2 г) нефти. Таким образом, массовая доля углеводородов в грунте составляла 5%. Контролем служили чашки без нефти. Посевной материал вносили в количестве 0.1 г (по сухому весу), после чего перемешивали субстрат шпателем. Контролем служили чашки с почвой, нефтью и стерильной соломой, взятой в количестве 0.1 г (по сухому весу). Эксперимент выполняли в трех повторностях.
Длительность эксперимента составляла 21 день при температуре окружающего воздуха 25—27 оС, влажность почвы поддерживали на уровне 40—50 % от полной влагоемкости. Каждый из вариантов эксперимента был выполнен в 3 повторностях. Остаточное содержание нефтепродуктов в почве определяли грави-
13
метрическим методом .
Для изучения явления адгезии бактериальных клеток к поверхности гиф базидиоми-цетов готовили суспензии из смывов культур отобранных штаммов с поверхности КГА. Навеску в 1 г коммерческого нефтеокисляющего биопрепарата «Родер» суспензировали в 100 мл стерильной водопроводной воды и культивировали 3 ч при 37 оС. Смешивали по 10 мл взвеси базидиомицетов и бактерий, выдерживали 1 сут при 28 оС. После экспозиции трехкратно промывали физиологическим раствором и исследовали методом фазово-контрастной световой микроскопии на микроскопе 01ушрш СХ 41.
Результаты визуального контроля скорости роста, интенсивности развития воздушного мицелия и способности культур базидиальных грибов колонизировать нефтяное пятно выражали в следующей системе условных баллов (табл.1). Оценка в 1 балл соответствовала отсутствию видимого роста мицелия на лигно-целлюлозном субстрате с нефтяным загрязнением. Слабый рост воздушного мицелия на лигноцеллюлозном субстрате оценивали в 2 балла. Активное развитие воздушного мицелия на лигноцеллюлозном субстрате, но медленный рост на нефтяном загрязнении оценивали в 3 балла. Активное развитие и быстрый переход воздушного мицелия с лигноцеллю-лозного субстрата на нефтяное пятно соответствовали 4 баллам. Максимальная оценка в 5 баллов соответствовала интенсивному развитию воздушного мицелия с покрытием всей поверхности, заполненной нефтью.
Таблица 1
Оценка роста и развития воздушного мицелия базидиальных грибов на нефтезагрязненном субстрате
Штамма Оценка, условные баллы
A. aegerita 2
F. velutipes 2
F. pinicola 5
G. lucidum 1 4
G. lucidum 2 1
H. ulmarius 3
L. shimedji 2
P. ostreatus 1 4
P. ostreatus 2 4
P. ostreatus 3 2
P. ostreatus 4 3
P. ostreatus 5 2
P. ostreatus 6 3
P. ostreatus 7 2
T. versicolor 5
Обсуждение
В ходе эксперимента выявили наиболее перспективные культуры грибов, которые быстро переходили с лигноцеллюлозного субстрата на нефтяное пятно и активно развивали на нем воздушный мицелий. Для дальнейших исследований отобрали штаммы T. versicolor и F. pinicola.
Анализ отобранных грибных культур методом фазово-контрастной микроскопии подтвердил их принадлежность к классу базидио-мицетов: под микроскопом отчетливо были видны характерные для базидиомицетов образования на гифах мицелия — пряжки.
При изучении возможности отобранных штаммов использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и энергии оба штамма базидиомицетов проявили выраженную активность по колонизации поверхности нефтезагрязненного субстрата. Рост мицелия наблюдали уже на 2 сут с момента засева штаммов. Однако скорость развития мицелия у штаммов была различной. Штамм T. versicolor более быстро колонизировал неф-тезагрязненный субстрат, нежели штамм F. pinicola. Результаты экспериментов, выраженные в единицах поверхности субстрата, колонизированной воздушным мицелием, представлены в табл. 2.
Таблица 2
Динамика роста штаммов грибов F. pinícola и T. versicolor, баллы
Время, сутки T. versicolor F. pinicola
контроль опыт контроль опыт
1 6.5 7.0 5.6 6.5
3 7.4 8.3 6.2 7.0
5 7.4 8.5 7.0 7.5
7 7.4 9.5 7.0 9.0
9 7.9 10.0 7.3 9.3
12 7.6 10.5 7.2 9.8
15 7.6 11.0 7.1 9.7
17 7.6 11.0 7.1 9.7
19 7.6 11.0 7.1 9.6
21 7.0 11.0 7.1 9.6
Увеличения площади, колонизированной грибом F. pinicola, в контроле не наблюдали с 13 дня, в то время как в опыте гриб колонизировал новую поверхность до 15 дня включительно. Начиная с 15 дня в контроле наблюдали снижение площади колонизированного субстрата. В опыте вплоть до 15 дня площадь колонизированной поверхности не уменьшалась и сохраняла свое значение до 18 дня. Максимальная колонизированная грибом в контроле площадь составила 7.2 балла. В опыте — 9.8 баллов. Разница между контолем и опытом составила 2.6 балла.
Увеличения площади колонизированной грибом T. versicolor в контроле не наблюдали с 9 дня, в то время как в опыте гриб колонизировал новую поверхность до 15 дня включительно. Начиная с 12 дня в контроле наблюдали снижение площади колонизированного субстрата, что объясняли тем, что гриб исчерпал запас минеральных веществ, которые использовал в первые дни роста, и стал умирать. В опыте вплоть до 21 дня площадь колонизированной повехности не уменьшалась. Максимальная колонизированная грибом в контроле площадь составила 7.9 балла. В опыте — 11 баллов. Разница между контролем и опытом составила 3.1 балла. Таким образом, большую активность проявил штамм T. versicolor. Разница в активностях штаммов незначительна. Результаты эксперимента наглядно демонстрируют способность обоих штаммов утилизировать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода.
Следующий эксперимент был направлен на определение углеводородокисляющей активности отобранных штаммов базидиомице-тов, выраженной количественно. Гравиметрическое измерение остаточного содержания нефти в почве по истечении 3 недель с момента внесения в грибную культуру базидиомицетов дало следующие результаты (табл.3).
В случае штамма F. pinicola остаточное содержание нефти составило 0.027 г/г почвы и в случае штамма T. versicolor — 0.021 г/г почвы при контрольном значении — 0.035 г/г почвы. Начальное значение содержания нефти в почве составило 0.05 г/г почвы. Количество утилизируемой нефти штаммом F. pinicola составило 46.00% мас. по отношению к начальному содержанию нефти в почве и 22.12% мас. с учетом испарившейся фракции. Для штамма T. versicolor эти цифры составляют 58.00 и 39.42% мас. соответственно.
Отобранные штаммы базидиомицетов проявляли высокую углеводородокисляющую активность и в нестерильных условиях В случае штамма F. pinicola остаточное содержание нефти составило 0.028 г/г почвы и в случае штамма T. versicolor — 0.022 г/г почвы при контрольном значении — 0.035 г/г почвы. Начальное значение содержания нефти в почве составило 0.05 г/г почвы. Количество утилизируемой нефти штаммом F. pinicola составило 44.00% мас. по отношению к начальному содержанию нефти в почве и 20.75% мас. с учетом испарившейся фракции. Для штамма T. versicolor эти цифры составляют 56.00 и 37.74 % мас. соответственно (табл.4).
В результате исследования адгезии клеток углеводородокисляющих бактерий обнаружено, что бактерии с теми же морфологическими характеристиками, что и в суспензии бактериального препарата, фиксируются на поверхности гифы. Большинство бактериальных клеток располагалось вдоль гиф базидиомицетов, увеличивая поверхность контакта. Вместе с тем, некоторые бактериальные клетки фиксировались на мицелии полюсами, располагаясь перпендикулярно гифам (рис. 1). Описанное явление позволяет предположить, что базидио-мицеты могут использоваться в составе нефтеокисляющих препаратов в ассоциации
Таблица 3
Результаты деструкции углеводородов грибами в стерильной почве
Штамм Содержание нефти в почве, г/г почвы Деструкция нефти, сравнение с контролем, % Деструкция нефти, пересчет на начальное содержание, %
F.pinicola 0.027 22.86 46.00
T.versicolor 0.021 40.00 58.00
Контроль 0.035 0.00 30.00
Рис. 1. Адгезия бактериальнъх клеток на поверхности гиф T. versicolor. Фазово-контрастная микроскопия (х1000)
Таблица 4
Результаты деструкции углеводородов грибами в нестерильной почве
Штамм Содержание нефти в почве, г/г почвы Деструкция нефти, сравнение с контролем, % Деструкция нефти, пересчет на начальное содержание, %
F. pinícola 0.028 20.75 44.00
T. versicolor 0.022 37.74 56.00
Контроль 0.035 0.00 29.33
с бактериями, увлекая их на своей поверхности в глубьлежащии слои почвы и создавая естественные магистрали для проникновения туда воды и воздуха.
Таким образом, отобранные в результате первичного скрининга штаммы грибов проявляют высокую активность и интенсивность роста на нефтезагрязненном субстрате. Нарастание воздушного мицелия возможно не только на субстрате, пропитанном нефтью, но и непосредственно по поверхности нефтяной пленки.
Выявлена способность отобранных штаммов базидиальных грибов расти на почве, используя углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Штамм Trametes versicolor развивался на нефтеза-
грязненном субстрате интенсивнее, чем штамм Fomitopsis pinicola. Установлено, что развитие мицелия происходит как по поверхности, так и в объеме нефтезагрязненного субстрата.
Показано заметное снижение остаточных углеводородов нефти базидиальными грибами в стерильной и нестерильной почве в условиях модельного эксперимента. Установлено, что фактор стерильности почвы не оказывает действенного влияния на работоспособность обоих штаммов. Количество утилизированной нефти штаммом Trametes versicolor достигало 39.4% в стерильной и 36.5% в нестерильной почве от контрольного уровня содержания нефти в почве, штаммом Fomitopsis pinicola — 22.1 и 20.8 %, соответственно.
Способность штаммов базидиальных грибов сохранять высокую нефтеокисляющую активность в присутствии аборигенной почвенной микрофлоры подтверждает возможность их использования для деградации нефти как в качестве самостоятельного метода биоремедиации, так и в сочетании с другими методами очистки нефтезагрязненных почв.
Литература
1. Орлов Д. С. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении: Учеб. пособие для хим., хим.-технол. и биол. спец. вузов/ Д. С. Орлов, Л. К. Садовникова, И. Н. Лоза-новская.— М.: Высш. шк., 2002.— 334 с.
2. Технология переработки нефти. В 2-х частях. Часть первая. Первичная переработка нефти / Под ред. О. Ф. Глаголевой и В. М. Капустина.-М.: Химия, КолосС, 2005.— 400 с.
3. Абросимов А. А. Экология переработки углеводородных систем: Учебник / под ред. д-ра хим. наук, проф. М. Ю. Доломатова, д-ра техн. наук, проф. Э. Г. Теляшева.— М.: Химия, 2002.- 608 с.
4. Международный региональный семинар «Охрана окружающей среды: Современные исследования по экологии и микробиологии» // Физиология и биохимия культурных растений.-Ужгород, 1997.- № 5.
5. Reddy C.A. // Current .Opinionin Biotechnology.— 1995.— V. 6.— P. 320.
6. Aust S. D., Benson J. T. // Environ. Health Perspect.- 1993.- V. 101, № 3.- Р. 232.
7. Sack U., Heinze T. M., Deck J., Cerniglia C. E., Martens R., Zadrasil F., Fritsche W. // Appl. Environ. Microbiol.- 1997.- V. 63, № 10.-P. 3919.
8. Anderson B. E., Henrysson T. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1996.- V. 46, № 5.-P. 647.
9. Brodkorb T. S., Legge R. L. // Appl. Environ. Microbiol.- 1992.- V. 58, № 9.- P. 3117.
10. Davis M. W., Glaser J. A., Evans J. W., La-mar R. T. // Environ. Sci. Technol.- 1993.- V. 27, № 12.- Р. 2572.
11. Marques-Rocha F. J., Hernandez-Rodriquez V., Lamela M.A.T. // Water, Air and Soil Pollution.- 2001.- V. 128, № 3-4.- Р. 313.
12. Позднякова Н. Н., Никитина В. Е., Турковс-кая О. В. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы комплексом гриб Pleurotus ostreatus -почвенная микрофлора.- Интститут биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 2008.
13. Методические указания. Определение массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим методом. РД 52.18.647-2003.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
