CC BY
99
УДК 57.088.1
Никиян А.Н., Татлыбаева Е.Б.
Оренбургский государственный университет Е-mail: [email protected]
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОй МИКРОСКОПИИ
при идентификации специфически маркированных молекул
и клеток микроорганизмов
Идентификация биологических молекул и микроорганизмов является важной задачей микробиологии, традиционно решаемой с помощью маркированных антител. Однако в большинстве случаев соответствующие методы основаны на обнаружении значительного количества взаимодействующих молекул и не позволяют выяснить их распределение по поверхности. Один из возможных путей решения состоит в использовании современного метода атомно-силовой микроскопии.
В настоящей работе методом атомно-силовой микроскопии обнаружены и изучены специфические комплексы, сформированные с участием наноразмерных меток, содержащие коллоидное золото или аморфный углерод, на поверхности бактериальных клеток Staphylococcus aureus и на поверхности иммунологического планшета. Установлены морфологические характеристики и карта распределения выявляемых комплексов по исследуемым поверхностям. В экспериментах с обнаружением единичных молекул определена чувствительность метода и проведено сравнение с иммуноферментным анализом. Полученные результаты указывают на высокую чувствительность предлагаемого метода и определенные преимущества углеродных меток по сравнению с золотыми метками, по причине их легкого обнаружения и однозначности в выявлении на полученных изображениях. Проведена идентификация микроорганизмов в модельных двухкомпонентных биологических системах и разработаны подходы к маркированию бактериальных клеток в сложных биологических смесях для направленного их выделения и последующего изучения.
Таким образом, использование атомно-силового микроскопа в сочетании с наноразмерными углеродными и золотыми метками, позволяет реализовать новый способ идентификации единичных молекул и микроорганизмов в ассоциациях сложного компонентного состава.
Ключевые слова: идентификация молекул, детектирование микроорганизмов, золотые и углеродные метки, атомно-силовая микроскопия
В микробиологии разработка быстрых и чувствительных методов распознавания биомолекул и бактерий остается достаточно актуальной и в ряде случаев решается путем специфического маркирования микроорганизмов с последующим микроскопическим исследованием. В случае использования световой микроскопии это достигается использованием иммунохимических или иммунофлюоресцен-тых меток [1], а при электронной микроскопии распознающие антитела конъюгируются с электронно-плотными частицами, например, коллоидным золотом [2]. На этом фоне метод атомно-силовой микроскопии для обнаружения микроорганизмов только лишь занимает своё место в ряду существующих видов микроскопии [3], [4]. Способы специфического маркирования объектов для атомно-силовой микроскопии разработаны, соответственно, в значительно меньшей степени.
Атомно-силовой микроскоп (АСМ), демонстрируя нанометровое латеральное и пространственное разрешение, позволяет исследовать не только клеточные и субклеточные структуры, но и отдельные молекулы без трудоемких
и повреждающих процедур пробоподготовки [5]. Указанные возможности АСМ позволяют развивать высокочувствительные методы обнаружения единичных комплексов на поверхностях микроорганизмов, что открывает широкие перспективы для анализа иммуно- и субстратспецифической активности. Критерием для выявления комплексов антиген-антитело может выступать оценка морфометрических характеристик визуализируемых молекул [6]. Для повышения надежности обнаружения единичных комплексов на поверхности бактериальных клеток, распознающие антитела конъюгируют с различными маркерами, в качестве которых могут выступать частицы, размеры которых находятся в пределах хорошей разрешающей способности микроскопа и имеют отчетливую структуру [6]. Это в свою очередь позволяет не только установить факт взаимодействия, но и определить локализацию составляющих реакции антиген-антитело, а также проводить их количественный анализ.
Целью работы являлась разработка АСМ метода для идентификации единичных молекул и клеток с помощью золотых и углеродных
Никиян А.Н., Татлыбаева Е.Б._
меток. Критерием обнаружения являлась непосредственная визуализация и количественное определение морфометрических характеристик комплексов антиген-антитело.
Процесс образования комплексов антиген-антитело (Аг-Ат) на первом этапе изучался в модели in vitro на дне лунок стандартных иммунологических планшетов. Специфическими маркерами для контроля реакции выступали: 1) протеин А, конъюгированный с коллоидным золотом (PrA-Au); 2) протеин G, конъюгированный с аморфным углеродом (PrG-C). Молекулы протеина А и G обладают неспецифическим сродством к Fc-фрагменту антитела и за счет наноразмерной метки имеют явно выраженную морфологию и стандартные размеры, хорошо различимы на АСМ-изображениях и легко идентифицируются по значению вертикального размера, что обеспечивает высокую надежность узнавания частиц антигена [7].
Исследования проводились с помощью атомно-силового микроскопа СММ-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия) с использованием кантилеверов общего назначения MSCT (Bruker, США), жесткостью 0,01 Н/м и радиусом кривизны зонда не более 15 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа. Методика приготовления образцов подробно описана в работах [8] и [9].
Для решения задачи идентификации молекулярных комплексов методом АСМ были последовательно изучены: используемые конъюгаты на подложке из слюды, что позволило количественно оценить их характерные морфологические особенности; поверхность лунок пластикового планшета для иммунологических реакций в отсутствии и с молекулами антигена адсорбированных на ней, а также инкубированных с антителами и конъюгатами антител. Антигены, адсорбированные на дне лунки иммунологического планшета, визуализируются в виде дискретных макромолекул со средним диаметром 75,3±2,1 нм и высотой 10,3±0,4 нм. Измеренные значения соответствуют литературным данным, согласно которым размер молекулы используемого в работе антигена (вирус краснухи) лежит в диапазоне 40-80 нм [10].
Использование атомно-силовоймикроскопии...
При инкубировании совместно со специфическими антителами иммуноглобулина G отмечалось увеличение диаметра (на 36 нм) и высоты (5 нм) наблюдаемых на подложке структур, идентифицированных в качестве молекул антигена. Увеличение размеров согласуется с результатами морфометрии единичных молекул иммуноглобулина G, полученными авторами [11]-[12]. Соразмерное укрупнение визуализируемых структур свидетельствует о формировании специфических комплексов антиген-антитело, обнаружение которых, однако, возможно лишь при измерении размерных характеристик большого числа структур для проведения статистического анализа и определения достоверных различий.
Инкубирование комплексов Аг-Ат в присутствии конъюгатов золота приводило к формированию маркированных комплексов на поверхности лунки иммунологического планшета (рисунок 1а). Так, обнаруживались структуры округлой формы, визуально сложно отличимые от немаркированных комплексов. Средний диаметр меченых комплексов составлял 190 нм, высота - 30 нм.
Несколько иная картина наблюдается в случае использования углеродных меток (рисунок 1б). Маркированные аморфным углеродом комплексы, в отличие от всех приведенных выше случаев, по причине значительного размера совершенно отчетливо визуализируются на подложке. Сопоставление кривых распределения диаметра и высоты исследуемых частиц на каждом этапе исследования, позволило проследить процесс формирования специфических комплексов, что подтверждает смещение размерных характеристик полученных комплексов.
Следующим этапом исследования являлось определение возможности специфического маркирования исследуемых микроорганизмов Staphylococcus aureus в in vivo условиях. Критерием идентификации являлась визуализация маркерных комплексов непосредственно на поверхности бактериальных клеток. Специфические комплексы, представленные конъюгата-ми иммуноглобулина G с коллоидным золотом (IgG-Au) и аморфным углеродом (IgG-С), равно как и все последующие объекты исследования в экспериментах in vivo, были исследованы методом АСМ на слюдяных подложках. Выбор
Фундаментальная наука Оренбуржья
клеток S. aureus в качестве модельных обусловлен тем, что данные бактерии представлены формами, имеющими достаточно однородную морфологию, кроме того, клеточная стенка бактерий содержит характерный для штаммов S. aureus протеин А, на долю которого приходится от 6% до 30% массы клеточной стенки [13]. Являясь поверхностным антигеном, протеин А обладает способностью к неспецифическому соединению с Fc-фрагментами антител, в связи с чем стафилококки были использованы в нашей работе в качестве лигандов антител, конъюгированных с наночастицами коллоидного золота [14].
Интактные клетки S.aureus визуализировались как морфологически однородные объекты округлой формы шириной 780 нм, с минимальным размером 550 нм и максимальным значением 1100 нм. Опытная часть образцов представляла инкубацию клеток S.aureus совместно с частицами IgG-Au. Результатом их взаимодействия являлась адсорбция частиц IgG-Au к поверхности бактериальных клеток S. aureus предположительно в участках, богатых протеином А. Морфометрический анализ частиц, обнаруживаемых на поверхности опытных клеток после воздействия антител, конъюгированных с наночастицами коллоидного золота, позволил установить их средний размер, который составил 127 нм. Сравнительный анализ морфологических параметров клеток опытной и контрольной групп указывал на достоверное увеличение размера и
значения среднеквадратичном шероховатости клеток опытной группы. Анализ более 200 меток позволил выявить неравномерное распределение конъюгатов вдоль поверхности бактерий, что можно объяснить дискретной локализацией протеина А в клеточной мембране.
Для подтверждения специфичности данных частиц в отношении клеток золотистого стафилококка в опытную среду был внесен дополнительный микроорганизм. В качестве дифференцирующего компонента была выбрана культура клеток Bacillus licheniformis, клетки которой отличаются по морфологическим и рецепторным свойствам от клеток золотистого стафилококка, т.е. по морфологическому типу представляют собой палочки длиной 2 мкм и шириной 0,9 мкм, не несущие на своей поверхности протеина А или иные Fc-рецепторы, что говорит об их неспособности к связыванию антител через Fc-фрагмент. Полученные в ходе АСМ визуализации результаты указали на предпочтительное (56,5 % частиц) связывание IgG к клеткам S. aureus. Около 24,7 % конъюгатов IgG-Au не были связанны с клеточной поверхностью или были локализованы на границе между S. aureus и B. licheniformis (12,3%). Некоторые наблюдаемые метки (6,3%) были найдены на поверхностях бацилл, что являлось нежелательным фактором для селективного маркирования и распознавания протеина А на поверхности клеток. Мы предполагаем, что подобное неспецифическое связывание может быть объяснено
а б
Рисунок 1. Комплексы «антиген-антитело», меченные коллоидным золотом (а) и аморфным углеродом (б).
Масштабная линейка соответствует 500 нм.
Никиян А.Н., Татлыбаева Е.Б._
электростатическим взаимодействием между отрицательно заряженной поверхностью клеток [15] и положительно заряженными частицами коллоидного золота [16]. Это обстоятельство частично ограничивает использование золотых частиц в клеточных суспензиях с отрицательным значением дзета-потенциала.
Алгоритм выполнения экспериментов с участием углеродных меток был аналогичен экспериментам с золотыми метками. При проведении исследований в двухкомпонентных смесях было отмечено чрезвычайно низкое количество частиц на дифференцирующем микроорганизме, что очевидно свидетельствовало о практически полном отсутствии неспецифи-
Использование атомно-силовоймикроскопии...
ческого связывания меток с поверхностью бацилл. По этой причине специфичность метода идентификации бактериальных клеток методом атомно-силовой микроскопии с участием углеродных меток значительно выше этого показателя для золотых наночастиц.
Таким образом, представленные в работе результаты указывают на возможность использования атомно-силового микроскопа в задачах детектирования и идентификации маркированных молекул и микроорганизмов. При этом, особое внимание требуется уделять выбору наноразмерных меток, от которых зависит чувствительность и специфичность предлагаемого подхода.
02.10.2015
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(проект №13-04-97054).
Список литературы:
1. Ramos-Vara J.A. Technical aspects of immunohistochemistry // Vet. Pathol. - 2005. - 42.- P. 405-426.
2. Electron Microscopy: Methods and Protocols, Kuo J ed. Humana Press. - 2007. - 608 p.
3. Binning G, Quate C.F, Gerber C. Atomic force microscope//Phys.Rev.Lett.- 1986. - 56(9). - P. 930-933.
4. Dufrene Y.F., Hinterdorfer P. Recent progress in AFM molecular recognition studies//Pflugers Arch - Eur.J.Physiol. - 2008. - 256. -P.237-245 D0I:10.1007/s00424-007-0413-1.
5. Heinisch J.J, Lipke P.N, Beaussart A, El Kirat Chatel S, Dupres V, Alsteens D, Dufrene Y.F.//J.Cell Sci. - 2012. - 125. - P. 41894195. - DOI: 10.1242/jcs.106005.
6. Maluchenko N.V., Agapov I.I., Tonevitsky A.G. et al. Detection of immune complexes using atomic force microscopy//Biofizika. -2004. - V.49. - № 6. - Р. 1008-1014.
7. Quist, A. P. Direct measurement of single immunocomplex formation by atomic force microscopy/ A. P. Quist, A. A. Bergman, C. T. Reimann // Solution for a nanoscale world. - 2004. - № 8. - P. 4.
8. Nikiyan H., Tatlybaeva E., Rayev M. and Deryabin D. Applying Nanosized Gold and Carbon Immunolabels for the Quantitative Detection of Specific Ag-Ab Complexes by Using Atomic Force Microscopy//Current Nanoscience.- 2015. - V.11. - P. 615620.
9. Tatlybaeva E.B., Nikiyan H.N., Vasilchenko A.S. and Deryabin D.G. Atomic force microscopy recognition of protein A on Staphylococcus aureus cell surfaces by labeling with IgG-Au conjugates//Beilstein J. Nanotechnol. - 2013. - 4. - P.743-749. D0I:10.3762/bjnano.4.84.
10. Edlich, R.F., Winters, K.L., Long, W.B., Gubler, K.D. Rubella and congenital rubella (German measles)// Journal of Long-Term Effects of Medical Implants.- 2005.- 15(3). - P.319-328.
11. Zhang, P.C., Bai, C., Ho, P.K., Dai, Y., Wu, Y.S. Observing interactions between the IgG antigen and anti-IgG antibody with AFM // IEEE Eng. Med. Biol. Mag. - 1997.- 16(2). - P.42-46.
12. Chen Y., Cai J., Xu Q., Chen Z.W. Atomic force bio-analytics of polymerization and aggregation of phycoerythrin-conjugated immunoglobulin G molecules//Mol. Immunol. - 2004. - 41(12). - P. 1247-1252. DOI 10.1016/ j.molimm.2004.05.012.
13. Forsgren A, Sjoquist J. "Protein A" from S. aureus. I. Pseudo-immune reaction with human gamma-globulin// J.Immunol.- 1966. -97(6). - P. 822-827.
14. DeDent A.C., McAdow M. and Schneewind O. Distribution of Protein A on the Surface of Staphylococcus aureus//J.Bacteriol.-2007.- V.189.- №12.- P. 4473-4484.
15. Dickson J. S., Koohmaraie M. K. Cell surface charge characteristics and their relationship to bacterial attachment to meat surfaces // Appl.Environ.Microbiol. - 1989. - 55(4). - P.832.
16. Leff D.V., Brandt L., Heath J.R., Synthesis and Characterization of Hydrophobic, Organically-Soluble Gold Nanocrystals Functionalized with Primary Amines //Langmuir.- 1996. - 12 (20). - P. 4723-4730. - DOI 10.1021/la960445u.
Сведения об авторах:
Никиян Айк Николаевич, доцент кафедры биофизики и физики конденсированного состояния Оренбургского государственного университета, кандидат физико-математических наук, доцент
e-mail: [email protected] Татлыбаева Елена Батыровна, aспирант кафедры биохимии и микробиологии Оренбургского государственного университета, e-mail: [email protected] 460018, г. Оренбург, пр-т Победы, 13
