Isolation Bac. Anthracis at different pH and soil humus content Текст научной статьи по специальности «История и археология»

HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy

BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMem C.3. I^M^Koro

Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies

ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online

doi: 10.32718/nvlvet8827 http://nvlvet.com.ua

UDC 619:616.981

Isolation Bac. anthracis at different pH and soil humus content

I. Rublenko, S. Rublenko

Bila Tserkva National Agrarian University, Bila Tserkva, Ukraine

Article info

Received 14.09.2018 Received in revised form

15.10.2018 Accepted 16.10.2018

Bila Tserkva National Agrarian University, Soborna sq., 8/1, Bila Tserkva, 09111, Ukraine. Tel.: + 38-097-398-57-83 E-mail: [email protected]

Rublenko, I., & Rublenko, S. (2018). Isolation Bac. anthracis at different pH and soil humus content. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies, 20(88), 147-151. doi: 10.32718/nvlvet8827

Anthrax is one of the diseases that cause great damage to livestock and at the same time is a dangerous disease for humans. This disease under different names is known from ancient times. The source of the pathogen is diseased animals. However, an important factor in the transmission of the pathogen is the burial place of animals that died from anthrax. The pathogen can be stored in the soil for more than 100 years. Anthrax is one of the diseases that cause great damage to livestock and at the same time is a dangerous disease for humans. This disease under different names is known from ancient times. The source of the pathogen is diseased animals. However, an important factor in the transmission of the pathogen is the burial place of animals that died from anthrax. In Ukraine there is burial of dead animals from anthrax. Most of the Siberian burial ground is registered in Vinnytsia, Kharkiv, Chernihiv, Ternopil, Lugansk and Kirovograd regions of Ukraine. In this regard, there is a need to .study the issues of epizootology and improve diagnostic techniques, measures for general and specific anthrax prevention. The pathogen can be stored in the soil for more than 100 years. The purpose of these studies was to select the Bacillus anthracis spores for the influence of pH and different humus content in the soil. The pH and soil humus content were determined, which was used in experiments at the Laboratory of Agrochemistry of the Institute of Bioener-getic Cultures and Sugar Beet at the National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine. The work was performed on the basis of the State Scientific-Control Institute of Biotechnology and strains of microorganisms. Used methodology in which soil sample - 2.5 grams grow. In studies, spores of the avirulence strain Bacillus anthracis were introduced into a sterile soil. Registered methods of separating the argument of anthracite from the soil are obsolete. The method allows distinguishing anthrax spores from soils with different pH and humus content. when 21.76 ± 0.94 spores were applied to sterile soil (which was 17.41 ± 0.75 s/gram), the amount of spores selected was 3.33 ± 0.27 spores/grams (19.13%). The amount of controversy in the experimental soil was lower (17.41 ± 0.75), compared with the amount of controversy submitted to the soil with a pH of 6.5 (P < 0.05), 6.7 (P < 0.05), 7.5 and 7.8, however, the number of allocated -higher - 3.33 ± 0.27 (19.1%). The introduction of 18.54 ± 1.29 spores/grams of soil (3.67% of humus content) amounting to 18% of the deductions. Isolation Bac. anthracis with different pH indicates that the most spores of the pathogen are released within the pH range of 6.7-7.5. The content of humus in the soil affects the number of selected spores. With a higher content of humus, fewer amounts of spores is released anthracis, optimum pH for spore selection - 7.0.

Key words: Siberian ulcer, Bacillus anthracis, spores, selection, method, pH, humus content.

Видшення Bac. anthracis при pi3HOMy рН та BMicry гумусу грунту

1.О. Рубленко, С.В. Рубленко

Бтоцерювський нацiональний аграрний утверситет, м. Бша Церква, Украгна

Cu6ipKa належить до числа захворювань, ят завдають великоi шкоди тваринництву i одночасно е небезпечним захворюванням для людей. Дане захворювання тд рiзнuмu назвами вiдоме з глибоког давнини. Джерелом збудника е хворi тварини. Однак важли-вим фактором передaчi збудника е мкця поховань тварин, загиблих вiд сuбiркu. Збудник може зберкаеться в tрунтi понад 100 ромв. В Украгт е також поховання тварин, загиблих вiд даного захворювання. Найбтьше таких захоронень зареестровано у Втницькш, Хартвськш, Черншвськш, Терноптьськш, Луганськй i Юровоградськш областях. Зареестроват методи видтення спор сuбiрськоi виразки з Грунту застарШ. У зв 'язку з цим кнуе необхiднiсть вивчення питань етзоотологп та вдосконалення методик дiaгностuкu, зaходiв загальног та спецuфiчноi профилактики сuбiркu. Метою даних до^джень було видтення спор

Bacillus anthracis при ennuei рН та pis-ного вмкту гумусу в tpynmi. Визначали рН та вмкт гумусу Грунту, який використовувався в docnidax в лаборатори агрохми 1нституту бюенергетичних культур i цукрових бурятв Нацюнальног академп аграрних наук Укра-ïhu. До^дження виконували на 6o3i Державного науково-контрольного тституту бютехнологп i штaмiв мiкpооpгaнiзмiв. Вико-ристовували методику, в як1й проби Грунту були по 2,5 грам, з piзним вмктом спор. У до^дженнях 3i стерильним Грунтом вносили спори aвipулентного штаму Bacillus anthracis. Методика дозволяе видтити спори сибipки з Гpунтiв з piзним рН i вмктом гумусу. При внесент 21,76 ± 0,94 спор до стерильного грунту (становило 17,41 ± 0,75 спор/грам грунту) ктьюсть видтених спор була -3,33 ± 0,27 спор/г (19,13%). Ктьтсть внесених спор у до^джуваному Гpунтi була нижчою - 17,41 ± 0,75, nоpiвняно з ктьюстю внесених спор у Грунт з рН 6,5 (Р < 0,05), 6,7 (Р < 0,05), 7,5, i 7,8. Проте ктьюсть видтених - вищою: 3,33 ± 0,27 (19,1%). Внесення 18,54 ± 1,29 спор/грам Грунту (при 3,67% вмкту гумусу) - ктьюсть 18% видтених внесених. Видтення спор Bac. anthracis з piзним рН свiдчить, що бтьше спор збудника видтяеться в межах рН 6,7-7,5. Вмкт гумусу в Гpунтi впливае на ктьюсть видтених спор. При бтьшому вмiстi гумусу видтяеться менша ктьюсть спор Bac. anthracis, а оптимальне рН для видтення - 7,0.

Ключовi слова: сибipкa, Bacillus anthracis, спори, видтення, методика, рН, вмкт гумусу.

Вступ

Сиб1рка належить до числа захворювань, яш наносить велик! збитки тваринництву i одночасно е небез-печним захворюванням для людей. Дане захворюван-ня тд рiзними назвами вщоме з глибоко1 давнини. У зв'язку з змшою ктмату, пов'язаними з цим природ-ними катактзмами (зокрема повенями, тдвищенням рiвня грунтових вод), а також у зв'язку з розширенням господарчо1 дiяльностi людини, стрiмким розвитком сфери земельного та водного природокористування (зокрема масштабного будiвництва) та шшого вико-ристання земл1 тдвищуеться ризик змши глиби юну-вання та розвитку збудника сибiрки у товщi грунпв. Збудник може збертатися у грунп понад 100 рошв. Внаслщок цього вщбуваеться поширення шфекцп на новi територп. Iсторiя зберегла даш виключно великих ешзоотш сибiрки серед тварин у XIV-XV столгг-т! у 1309 рощ ("был мор на люди и кони и на всякий скот"), 1375 ("на люди и кони и на скот был мор в Твери"), 1433, 1448 роках ("мор на коней и люди мерли"). Особливою подiею у свгговш юторп сибiрки стала заборона використання як бюлопчно1 збро1 цього збудника шсля пвдписанням Женевського протоколу. Проте це не зупинило поширення збудника сибiрки.

Сучасш шформацшш, дiагностичнi технологiï до-зволяють вщкривати можливiсть швидших та точш-ших методiв дослiдження сибiрки. Лабораторна д!аг-ностика сибiрки застосовуеться для виявлення збудника, визначення бiологiчних властивостей тощо. Даний процес складаеться з шлькох етапiв, кожен з яких мае своï вимоги, в!д яких залежить к1нцевий подсумок. Бактерiологiчний метод дiагностики грунту на наявнiсть спор сибiрки полягае у дослiдженнi ввд-повiдно затвердженоï iнструкцiï та методичних реко-мендацiй. Джерелом збудника е хворi тварини, з ор-гашзму яких збудник видiляеться у навколишне сере-довище. Проте важливим фактором передачi збудника е мiсця захоронень тварин, яш загинули вiд сибiрки. Для видiлення та його щентифжацп придiляеться значна увага серед дослщнишв у рiзних краïнах свiту (Yoong et al., 2006; Rouli et al., 2014; Kammanadiminti et al., 2014; Kasradze et al., 2018). На територiях рiзних краш розроблеш схеми, методи боротьби та профша-ктики iз сибiркою (Cieslac and Eitzen, 1999). Проте щорiчно виникають новi випадки захворювань не лише тварин, а й людей (Creel et al., 1995; Mongoh et al., 2005; Bellan et al., 2012). У чутливих до сибiрки травовдних тварин захворювання перебiгае переважно

у септичнiй формi. В Украш сибiрку рееструють переважно у великоï рогатоï худоби, зрiдка - у свиней. Небезпечне захворювання i для людей, особливо легенева форма.

На територп нашоï краши майже щорiчно (19942007, 2010, 2012, 2016, 2017 рр.) рееструються випадки сибiрки, особливо серед тварин (Rublenko and Skrypnyk, 2016; Derzhprodsposivsluzhba, 2017). Випадки захворювання серед людей найчаслше рееструють в аграрних та слаборозвинених крашах. В Украш в останнiй час спалахи сибiрки бувають р!дко, у виглядi спорадичних випадк1в раз на 1-2 роки. Актуальнють проблеми зумовлена, тим, що, враховуючи лггератур-нi даш, в Украш знаходиться вiд 9 до 11 тис. стацю-нарно-неблагополучних пунктiв, тому забезпечення бiологiчноï безпеки тварин, населення, збереження природного середовища Украши залишаеться одним iз важливих завдань у другому тисячолiттi. Найбшьше сибiркових захоронень зареестровано у Вшницькш, Харкiвськiй, Чернiгiвськiй, Тернопiльськiй, Лугансь-кш та Кiровоградськiй областях Украïни.

Проблема захворювання на сибiрку е актуальною не лише для Украши, а й для б!льшосп краш Свропи та всього свiту. Оск1льки захворювашсть залишаеться на високому рiвнi, щорiчно рееструються летальнi випадки, на л!кування хворих витрачаються велик! кошти, а виробники тваринницькоï продукцп несуть значш економiчнi збитки через загибель тварин та проведения протиетзоотичних i профшактичних заходiв. У зв'язку з! цим юнуе необхiднiсть вивчення питань ешзоотологп та удосконалення методик д!аг-ностики, заход!в загальноï та специфiчноï профшак-тики сиб!рки.

Метою даних дослщжень було видшення спор Bacillus anthracis за впливу рН та р!зного вмюту гумусу в грунт!.

MaTepia™ i методи дослiджень

Для видшення спор збудника сиб!рки ми викорис-тали таку методику: в!д кожноï проби вщбирали 2,5 г стерильного грунту. Визначали потенцшну кислот-шсть (рН) та вмют грунту в лаборатори агрох!ми 1н-ституту бюенергетичних культур i цукрових буряшв Нацiональноï академiï аграрних наук Украши. Проби грунту розм!щували у склянш колб!, додавали споро-ву завись i заливали 15 см3 розчину для екстракци (100 см3 дистильованоï води, 1,22 г сахарози, 1,0 см3, тритону Х-80). Шсля ручного струшування протягом 1 хв, витримували 40 хв у стан! спокою. Вщбирали

3 см3 рщини з поверхш надосадово1 рщини, додавали 6-8 см3 БСА/ФСБ (фшьтрованого 1% бичачого сиро-ваткового альбум1ну у 0,01 моль/см3 фосфатно-сольовому буфера рН 7,0). Зразки центрифугували за 5000 об/хв протягом 10 хв. Надосадову рщину злива-ли та знищували, а до осаду додавали 1,0 см3 БСА/ФСБ. Очищения спор в осад1 виконували шляхом використання 100% етилового спирту протягом 1 год за шмнатно1 температури (Rublenko et al., 2015; Skripnik et al., 2015).

Результати та 1х обговорення

Результати дослщжень свщчать, що найвищ1 пока-зники видшення збудника сиб1рки з грунту за р1зноГ потенщально! кислотносп ми отримали при рН - 7,0 (рис. 1). При використанш проб грунту 1з потенцш-ною кислотнютю - 6,5 та внесенш 20,32 спор/грам грунту встановили, що кшьшсть спор, що вид1ляеться - 17,8%. Це була найменша кшьшсть спор, що видшя-лася протягом всього дослщу. При додаванш до 2,5 грам грунту 25,4 спори - кшьшсть Гх видшялася 18,3%.

Рис. 1. Видшення спор Bacillus anthracis з грунту, при вшсп гумусу 3,67%

Осшльки при внесенш 21,76±0,94 спор до стерильного грунту (що становило 17,41 ± 0,75 спор/грам) кшьшсть видшених спор була 3,33 ± 0,27 спор/грам (19,13%). При внесенш спор у грунт 20,32 ± 0,87, при рН - 6,5 - шльшсть видшених спор сягала 3,61 ± 0,16 спор/1 грам грунту, що складало 17,8% вщ внесе-них. Пщвищення потенщально! кислотностi грунту 6,7 викликала видiлення не вiрогiдно б№шо! на 0,5% шлькосп спор i3 грунту (3,71 ± 0,25 спор/1 грам грунту, 18,3%). Видшення спор i3 потенцiальною кислот-нiстю грунту 7,0 призвело до видiлення бшьшо! шль-костi спор Bacillus anthracis. Варто зазначити, що кшьшсть внесених спор у дослщний грунт була ниж-чою (17,41 ± 0,75), у порiвняннi i3 кiлькiстю внесених спор до грунту з рН 6,5 (р < 0,05), 6,7 (Р < 0,05), 7,5, та 7,8, проте кшьшсть видшених - вища - 3,33 ± 0,27 (19,1%). Одночасно з цим, потенцшна кислотшсть грунту 7,5 призвела до нижчо! шлькосп видiлених спор з грунту на 0,7%, що складало 3,50 ± 0,07 спор, при внесенш 19,04 ± 1,36 спор/грам грунту.

Пщвищення потенцшно! кислотностi грунту в по-дальшому призвело до ще нижчих показнишв видь лення спор Bacillus anthracis. При внесенш 18,54 ± 1,29 спор/грам стерильного грунту, за 3,67% вмюту гумусу - кшьшсть iзольованих спор склала 3,34 ± 0,09 (18% видшених вщ внесених). Слщ вiдмiтити, що

iзоляцiя збудника Bac. anthracis з pi3H0i0 потеншаль-ною кислотнiстю, свщчить, що найбшьше спор збудника видшяеться в межах рН 6,7-7,5, а оптимальним е 7,0. Тож на видшення спор впливае потенцшна кислотшсть грунту. Найнижчий вщсоток видшених спор i3 грунту отримали при рН 6,5, а найвищий - при 7,0.

O^îm потенцiйноï кислотносп для розвитку збудника сибiрки у грунтi важливе значения вщграе вмiст гумусу. Дослщження проводили у зв'язку з тим, що територiя Украïни мае велику к1льк1сть чорноземiв з великою к1льк1стю гумусу. Результати дослщжень наведенi на рис. 2.

Нами було встановлено, що кшьшсть гумусу впливае на вщсоток видшення спор iз грунту. При най-меншш шлькосп гумусу у груш! (2,67%) i внесеннi 18,98 ± 0,57 спор/1 г грунту видмвся найвищий вщ-соток спор - 20,2 ± 0,66%. Збшьшення кiлькостi гумусу у грунт на 0,7% призвела до видшення не вiрогiд-но меншо1 шлькосл спор 3,63 ± 0,15 спор/1 грам грунту, що склало - 19,1 ± 0,49%. За вмюгу гумусу 3,67%, при внесенш 19,11 ± 0,66 спор/1грам, видшили ще менший вiдсоток спор - 18,0 ± 0,65%. Слщ вщш-тити, що використання грунту з найвищим вщсотком гумусу (4,4%) у дослщних зразках викликало найвищий вщсоток видшення спор - 17,8 ± 0,91.

Рис. 2. Кшьшсть видшених спор Bacillus anthracis при р1зному bmîctî гумусу, рН - 6,7

Ймов1рно, низька к1льк1сть видшення спор пов'язана з тим, що спори прилипають до гумусу i погано вщмиваються хiмiчними детергентами. Ockî-льки гумусу менше у пробах - детергенти краще вщ-мивають спори сибiрки. Тож використання грунту i3 найменшим вмiстом гумусу (2,67%) у дослщ призве-ло до видiлення найвищого вщсотка спор (20,2 ± 0,66%). Тобто з бшьш родючого грунту виднеться менша к1льк1сть спор Bac. anthracis, шж з грунту, який складаеться iз бiльшоï кiлькостi неоргатчних речовин.

Висновки

В Укрш'т iснують мюця захоронения тварин, що загинули вщ сибiрки. Зареестроваиi методи видiления спор сибiрки iз грунту застарiлi й виникае необхад-нiсть ïx удосконалення. Удосконалена нами методика дозволяе видшити спори сибiрки iз грунтiв iз рiзним рН та вмiстом гумусу. BMicT гумусу та рН у групп впливають на к1льк1сть видшених спор. При бшьшому BMicTi гумусу видшяеться менша кiлькiсть спор Bac. anthracis, оптимальне рН для видшення спор - 7,0 та 3,67% гумусу.

Перспективи подальших до^джень. Провести дослщження щодо видшення спор iз грунту, викорис-товуючи рiзнi детергенти.

References

Yoong, P., Schuch, R., Nelson, D., & Fischetti, V.A. (2006). PlyPH, a bacteriolytic enzyme with a broad pH range of activity and lytic action against Bacillus anthracis. Journal bacteriology, 4. 188, doi: 10.1128/JB.188.7.2711-2714.2006. Rouli, L., Bengue, V.V., Robert, C., Ndiaye, M., Seola, B.La, & Raoulf, D. (2014). Genomic analysis of three African strains of Bacillus anthracis demonstrates that they are part of the clonal expansion of an exclusively

pathogenic bacterium. New microbes infect., 2(6), 161-169. doi: 10.1002/nmi2.62.

Kammanadiminti, S., Patnaikuni, R.K., Comer, J., Kodihalli, S. et al. (2014). Combination therapy with Antibiotics and Anthrax Immune Globulin Intravenous (AIGIV) Is Potentially More effective than antibiotics Alone in Rabbit Model of Inhalational Anthrax. Journal PloS one., 9(9), e106393. doi: 10.1371/journal.pone.0106393.

Kasradze, A., Echeverria, D., Zakhashvili, K. et al. (2018). Rates and risk factors for human cutaneous anthrax in the country of Georgia: National surveillance data, 2008-2015. Journal One a peer-reviewed, open access, 13(2), e0192031.

doi: 10.1371/journal.pone.0192031.

Cieslac, T.J., & Eitzen, E.M. (1999). Clinical and epidemiological principles of anthrax. Emerg infect dis., 5, 552-555. doi: 10.3201/eid0504.990418.

Creel, S., Creel, N.M., Matovelo, J., Mtambo, M., Batamuzi, E., & Cooper, J. (1995). The effects of anthrax on endangered African wild dogs (Lycaon pictus). Journal of Zoology, 236(2), 199-209. doi: 10.1111/j. 1469-7998.1995.tb04488.x.

Mongoh, M.N., Dyer, N.W., Stoltenow, C.L., & Khaitsa, M.L. (2005). Risk factors associated with anthrax outbreak in animals in North Dakota, 2005: A retrospective case-control study. Public Health Rep., 123(3), 352-359. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/19006977.

Bellan, S.E., Cizauskas, C.A., Miyen, J., Ebersohn, K., Küsters, M., & Prager, K. (2012). Black-backed jackal exposure to rabies virus, canine distemper virus, and bacillus anthracis in etosha national park, namibia. Journal of Wildlife Diseases, 48(2), 371-381. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22493112.

Rublenko, I.O., & Skrypnyk, V.G. (2016). Analysis of the data of epizootic outbreaks of anthrax on the territory of Ukraine (1994-2016). Scientific Herald of

Veterinary Medicine. Collection of scientific works, 1(127), 87-95 (in Ukrainian).

Derzhprodsposivsluzhba (2017). Derzhprodsposivsluzhba vzhivae zahodi shhodo nedopushhennja rozpovsjudzhennja spalahiv sibirki. 05.07.2017 15:29 http://www.consumer.gov.ua/News/2280/Derzhprodsp ozhivsluzhba_vzhivae_zakhodi_shchodo_nedopushch ennya_rozpovsyudzhennya_spalakhiv_sibirki (in Ukrainian).

Rublenko, I.O., Skripnik, V.G., & Machuskiy, O.V. (2015). Improvement chniques vidilennya dispute an-

thrax from the soil bacteriological using method. Science. collection of veterinary medicine collection of veterinary medicine: sciences. prac. Bila Tserkva, 2 (122), 89-95 (in Ukrainian).

Skripnik, V.G. Rublenko, I.O., Garkavenko, T.O. et al. (2015). Laboratory dignostika sibirki anthrax tvarin, indication of the pathogen from pathologichnogo and biological material, raw material of animal origin and objects of the environment), Kiev, 78 (in Ukrainian).