CC BY
110
УДК 579.262: 579.64:631.46
Вершинина З.Р., Нигматуллина Л.Р., Лавина А.М., Баймиев Ал.Х.
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН E-mail: [email protected]
ИСКУССТВЕННЫЕ СИМБИОТИЧЕСКИЕ АССОЦИАЦИИ ТОМАТА, ТРАНСГЕННОГО ПО ГЕНУ ЛЕКТИНА PSL
Были получены трансгенные по гену psl растения томата сорта Белый налив 241. Усиленная, благодаря выделению лектина на поверхности, колонизация корней этих растений ризобиями R. leguminosarum, обладающими фунгистатической активностью, способствовала защите от фи-топатогенных грибов F. oxysporum f.sp lycopersici.
Ключевые слова: трансгенный томат, лектин гороха, ризобии, фунгистатическая активность
Томат (Ьусорегасоп езсик^ит) является важнейшей сельскохозяйственной культурой, однако подверженность различным заболеваниям грибковой природы способствует значительному снижению урожайности данных растений. Фузариозное увядание томатов - довольно распространенное заболевание, борьба с которым обычно включает использование ряда опасных пестицидов. Альтернативным решением проблемы является использование микроорганизмов, обладающих противогрибковыми свойствами, например, таких как ризобии. Существуют данные, что эти бактерии могут вступать в ассоциативные взаимоотношения с небобовыми культурами, колонизируя корни и способствуя повышению урожайности за счет различных механизмов, в том числе защищая от фитопатогенных грибов [1].
Колонизация «полезными» ризобиями корней небобовых растений в условиях агро-экосистемы недостаточно устойчива, и искусственно внесенные штаммы не выдерживают конкуренции и обычно полностью замещаются более агрессивной аборигенной микрофлорой. На сегодняшний день эксперименты по приданию растениям способности контролировать бактериальный состав своей ризосферы проводятся в нескольких направлениях, в том числе и по созданию трансгенных растений, экспрессирующих гены, продукты которых способствуют прилипанию ризобий к корням [2, 3]. К таким генам относятся гены лек-
тинов бобовых растений, продукты которых прикрепляют ризобии к корневым волоскам и оказывают опосредованное влияние на процессы, протекающие на разных этапах формирования симбиоза. Ранее уже были получены положительные результаты по колонизации данными бактериями композитных небобовых растений с корнями, трансгенными по гену лектина гороха посевного psl [4, 5, 6].
Целью данной работы являлось получение трансгенных растений томата сорта Белый налив 241, экспрессирующих ген psl, и изучение их колонизации штаммом клубеньковых бактерий R. leguminosarum, обладающим фунгис-татической активностью, в присутствии фи-топатогена томата Fusarium oxysporum f.sp lycopersici.
Материалы и методы
Для получения трансгенных растений томата был использован штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0, трансформированный плаз-мидой pCAMBIA1301(psl), Т-ДНК которой включает в себя гены psl [7], gus с каталазным интроном и селективный ген устойчивости к гигромицину hptII (рис. 1).
Опыты по трансформации осуществляли согласно статье [8]. Gus- и ПЦР анализы проводили согласно статье [5]. Иммуногистохими-ческий анализ локализации лектина гороха посевного на поверхности корней осуществляли согласно статье [9]. Фунгистатическую актив-
Рисунок 1. Схема области Т-ДНК векторной конструкции pCAMBIA1301(psl): psl - целевой ген, кодирующий лектин гороха посевного; gus - ген ß-D-глюкуронидазы; hptII - ген гигромицинфосфотрансферазы II E. coli; 35S - конститутивный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; RB и LB - левая и правая
последовательности, ограничивающие Т-область
Естественные науки
ность, адгезию бактерий R. leguminosarum (меченых GFP) на поверхности корней и совместную обработку растений патогенным грибом Fusarium oxysporum f.sp lycopersici и штаммом ризобий, обладающим фунгистатической активностью, проводили согласно статье [6]. Все визуальные исследования осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager.Ml (Carl Zeiss, Германия).
Результаты и обсуждение
После 5 месяцев селекции было получено 7 растений томата, устойчивых к гигромицину. Трансгенность растений-регенерантов была подтверждена гистохимическим gus-анализом, а также ПЦР на наличие в геноме и экспрессию на уровне мРНК гена лектина psl. Эффективность агробактериальной трансформации растений томата сорта Белый налив 241 штаммом Agrobacterium tumefaciens AGL0 конструкцией pCAMBIA1301(psl) составила 2%. Иммунохи-мический анализ с использованием антител, специфичных в отношении лектина гороха посевного PSL, доказал наличие этого лектина на поверхности корней трансгенных растений томата и отсутствие у контрольных растений (рис. 2А, Б). С помощью визуальных микроскопических исследований было обнаружено, что на корнях трансгенных растений наблюдается увели-
чение числа адсорбированных ризобий, что не проявляется на корнях контрольных растений (рис. 2В, Г).
Антагонистическая активность R. leguminosarum по отношению к F. oxysporum составила около 75% (рис. 3А). Полученный результат вместе с повышенной адгезией бактерий к трансгенным корням явились предпосылками для создания искусственной симбио-тической системы, повышающей устойчивость растений томата к фитопатогену F. oxysporum.
Было выяснено, что обработка трансгенных по гену psl корней ризобиями снижает количество гиф гриба F.oxysporum на поверхности корней растений томата (рис.ЗЕ). Такой же эффект, но в гораздо меньшей степени, наблюдается на корнях контрольных растений, на которых колонизация ризобий происходит менее интенсивно (рис.7Г).
Как показали исследования последних лет, отдельные штаммы Rhizobium и Bradyrhizobium могут быть использованы в качестве агентов для биоконтроля грибов из рода Fusarium, заражающих томат [10, 11]. Однако чтобы защита была достаточно эффективной необходимо обеспечить высокую степень колонизации ризобиями прикорневой зоны, что вполне достижимо, если использовать в качестве трансгенов лектины, которые,
Рисунок 2. А-Б. Анализ иммунолокализации лектина PSL на поверхности корней томата: А) контрольные нетрансгенные корни; Б) корни трансгенных растений. В-Г. Адгезия ризобий на поверхности корней: А) контрольные нетрансгенные корни; Б) корни трансгенных растений (bars А-Г =1мм)
Рисунок 3. А. Ингибирование R. leguminosarum роста колоний F. oxysporum f.sp. lycopersici. Б-Е. Заражение растений томата F. oxysporum: Б) не инокулированные контрольные растения; В) контрольные растения + F. oxysporum; Г) контрольные растения + F. oxysporum+R. leguminosarum 116; Д) трансгенные растения + F. oxysporum; Е) трансгенные растения + F. oxysporum+ R. leguminosarum 116 (bar Б-Е =1мм)
Вершинина З.Р. и др.
Искусственные симбиотические ассоциации томата..
выделяясь в ризосферу, будут взаимодействовать с полисахаридами клеточных стенок ри-зобий, тем самым прикрепляя бактерии к корням. В результате этого численность микросимбионтов возрастает в ризосфере на несколько порядков, что было уже подтверждено в более ранних работы на модельных «композитных» растениях с трансгенными по гену лектина корнями [5, 6]. В данной работе схожие результаты были получены для растений
томата, агробактериально трансформированных геном рэ1.
Заключение
Показана возможность образования устойчивого ассоциативного симбиоза между растением томата сорта Белый налив 241, трансгенным по гену лектина гороха посевного рэ1, и штаммом И. ^иштоБагиш, обладающим фун-гистатической активностью.
19.09.2014
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ-Поволжье № 14-04-97005
Список литературы:
1. Arfaoui A., Sifi B., Hassni M.E., Hadrami I.E., Boudabous A., Cherif M. Biochemical analysis of chickpea protection against Fusarium wilt afforded by two Rhizobium isolates // Plant Pathol. J. - 2005. - V.4. - P. 35-40.
2. Tirichine L., Jensen J.S., Sandal N., Madsen L.H. Spontaneous nodulation in plants. Patent No.: US 8273955. - 2012.
3. Untergasser A., Bijl G.J., Liu W., Bisseling T., Schaart J.G., Geurts R. One-step Agrobacterium mediated transformation of eight genes essential for Rhizobium symbiotic signaling using the novel binary vector system pHUGE // PLoS One. - 2012. - V.7. e47885. doi: 10.1371/journal.pone.0047885.
4. Sreevidya V.S., Srinivasa Rao C., Sullia S.B., Ladha J.K., Reddy P.M. Metabolic engineering of rice with soybean isoflavone synthase for promoting nodulation gene expression in rhizobia // J. Exp. Bot. - 2006. - V. 57. - P. 1957-1969.
5. Vershinina Z. R., Baymiev An. K., Blagova D. K., Chubukova O. V., Baymiev Al. K., Chemeris A. V. Artificial colonization of non-symbiotic plants roots with the use of lectins // Symbiosis. - 2012. - V. 56 (1). - P. 25-33.
6. Благова Д.К., Вершинина З.Р., Оркодашвили А.М., Баймиев Ал.Х. Создание новых ассоциативных симбиозов между томатом и ризобиями // Вестник БГАУ. - 2013. - № 2. - С. 7-10.
7. Gatehouse J.A., Bown D., Evans I.M., Gatehouse L.N., Jobes D., Preston P., Croy R.R.D. Sequence of the Seed Lectin from Pea // Nucleic Acids Res. - 1987. - V. 15. - P. 7642.
8. Серенко. Е.К., Овчинникова. В.Н., Куренина. Л.В., Баранова. Е.Н., Гулевич. А.А., Майсурян. А.Н., Харченко. П.Н. Получение трансгенных растений томата с геном Fe-зависимой супероксиддисмутазы // Доклады РАСХН. - 2009. -№.4. -С. 12-14.
9. Diaz C.L., Van Spronsen P.C., Bakhuizen R., Logman G.J.J., Lugtenberg B.J.J., Kijne J.W. Correlation between infection by Rhizobium leguminosarum and lectin on the surface of Pisum sativum L. roots // Planta. - 1986. - V. 168. - P. 350-358.
10. Perveen S., Ehteshamul-haque S., Ghaffar A. Biological control of soilborne root infecting fungi in tomato and okra // Pak. J. Bot. - 1994. - V. 26 (1). - P. 181-186.
11. Parveen G., Ehteshamul-Haque S., Sultana V., AraJ., Athar M. Suppression of root pathogens of tomato by rhizobia, Pseudomonas aeruginosa and mineral fertilizers // Int. J. Vegetable Sci. - 2008. - V. 14. -P. 205-215.
Сведения об авторах:
Вершинина Зиля Рифовна, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, кандидат биологических наук, е-mail: [email protected]
Нигматуллина Лилия Ралисовна, аспирант лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, е-mail: [email protected]
Лавина Анна Михайловна, аспирант лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, е-mail: [email protected]
Баймиев Алексей Ханифович, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, доктор биологических наук, е-mail: [email protected]
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71
