CC BY
66
УДК 543.544
Вестник СПбГУ. Сер. 4. Т. 2 (60). 2015. Вып. 2
Е. А. Колобова, Л. А. Карцова, Е. А. Бессонова
ИОННЫЕ ЖИДКОСТИ НА ОСНОВЕ ИМИДАЗОЛА В КАЧЕСТВЕ МОДИФИКАТОРОВ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ БИОГЕННЫХ АМИНОВ И СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ*
Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7—9
Выявлено влияние ионных жидкостей (ИЖ) в качестве псевдостационарной фазы на параметры миграции гидрофильных (катехоламины) и гидрофобных (стероидные гормоны) аналитов в условиях капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). Установлено, что введение ИЖ на основе имидазола (С12MImCl, Ci6MImCl) в буферный электролит (фосфатный буфер (рН = 2,0)) приводит к росту эффективности в 2—3 раза при определении катехоламинов в условиях КЗЭ и селективности разделения в режиме МЭКХ. Показано, что применение внутрикапиллярно-го концентрирования — стэкинга с усилением поля — с использованием ионной жидкости Ci6MImCl в составе рабочего буфера позволило сконцентрировать адреналин, норадрена-лин, дофамин, норметанефрин в 10—14 раз. Предложен способ электрофоретического разделения кортикостероидов с применением C16MImCl в качестве псевдостационарной фазы. Библиогр. 8 назв. Ил. 2. Табл. 2.
Ключевые слова: ионные жидкости, капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ), мицел-лярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ), псевдостационарная фаза, экстракция, стероидные гормоны, биогенные амины.
E. A. Kolobova, L. A. Kartsova, E. A. Bessonova
IONIC LIQUIDS BASED ON IMIDAZOLE AS MODIFIERS OF ELECTROPHORETIC SYSTEMS DURING DETERMINATION OF BIOGENIC AMINS AND STEROID HORMONS
St. Petersburg State University, 7—9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russian Federation
The influence of ionic liquids (ILs) as pseudo-stationary phase (PSP) on migration parameters of hydrophilic (catecholamines) and hydrophobic (steroid hormones) analytes in capillary zone electrophoresis (CZE) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) was determined. It was established that the addition of IL based on imidazole (Ci2MImCl, Ci6MImCl) to the buffer electrolyte (phosphate buffer, pH = 2.0) resulted in efficiency increasing by a factor of 2—3 in the determination of catecholamines in CZE and separation selectivity in MEKC mode. It was shown that the use of on-line preconcentration — field amplified sample stacking — with the use of ionic liquid Ci6MImCl as a component of buffer electrolyte allowed to increase the concentration of epinephrine, norepinephrine, dopamine, normetanephrine up to 10—14 times. Therefore, a method for electrophoretic separation of corticosteroids using Ci6MImCl as the pseudo-stationary phase has been proposed. Refs 8. Figs 2. Tables 2.
Keywords: ionic liquids, capillary zone electrophoresis (CZE), micellar electrokinetic chromatography (MEKC), the pseudo-stationary phase, extraction, steroid hormones, biogenic amines.
Введение. Ионные жидкости (ИЖ) — это соли, температура плавления которых ниже 100°С [1—3]. Однако существуют соединения, состоящие из ионов, жидкие при комнатной температуре или обладающие температурой плавления ниже температуры
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект ННИО 14-03-00735-а.
кипения воды — «room temperature — ionic liquids» (RTILs) [1-3]. Как правило, их молекулы состоят из объёмного органического катиона (имидазолиевый (Im), пиридиниевый (Pyr) или пирролидиниевый, аммониевый или фосфониевый) и органического (трифто-рацетат, трифлат (CFsSO^), ацетат (CH3CO^)) или неорганического (бромид, хлорид, нитрат, перхлорат, тетрафторборат, гексафторфосфат, тиоцианат (NCS~)) аниона [1].
Имидазолий Пиридиний Пирролидиний Пиперидиний Гуанидиний
В последние годы отмечен активный интерес к использованию ИЖ в методах разделения [4-8]. Возможность варьировать природу составляющих ионов позволяет регулировать свойства ИЖ [2, 3], что открывает перспективы их использования в качестве добавок в составе подвижных фаз в жидкостной хроматографии [4, 5] и рабочих буферов в капиллярном электрофорезе (КЭ) [6, 7]. Особый интерес представляют ИЖ с длинным углеводородным радикалом. Они, подобно поверхностно-активным веществам (ПАВ), при определённой концентрации могут образовывать мицеллы [8], что обеспечивает одновременное определение гидрофобных и гидрофильных анали-тов [6, 7].
В качестве модельных нами выбраны гидрофобные (кортикостероиды) и гидрофильные соединения (катехоламины). Предполагалось изучить влияние ИЖ на основе имидазола на электрофоретические параметры миграции выбранных аналитов в условиях КЗЭ и МЭКХ.
Экспериментальная часть. Материалы и реагенты. Соляная кислота (ос.ч.), гидроксид натрия (ч.д.а.), ортофосфорная кислота (х.ч.), дигидрофосфат натрия дву-хводный (х.ч.), 1-додецил-3-метилимидазолий хлорид (C^MImCl) (Acros organics), борная кислота («реахим», ос.ч), 3-метил-1-цетилимидазолий хлорид (Ci6MImCl), цетил-триметиламмоний бромид (ЦТАБ) (Acros organics), ацетонитрил («криохром», сорт 0), дистиллированная вода, кортизол (F) («Sigma-Aldrich»), кортизон (E) («Sigma-Ald-rich»), кортикостерон (B) («Sigma-Aldrich»), 11-дезоксикортизол (S) («Sigma-Aldrich»), адреналин (AD) («Sigma-Aldrich»), норадреналин (NA) («Sigma-Aldrich»), дофамин (DA) («Sigma-Aldrich»), норметанефрин (NM) («Sigma-Aldrich»).
Оборудование. Системы капиллярного электрофореза «Капель-105М» со спектро-фотометрическим детектором («Люмэкс», СПб) и «Agilent 7100» с диодно-матричным детектором («Agilent Technologies», США). Кварцевые капилляры с внешним поли-имидным покрытием: общая длина капилляра — 50 см, эффективная длина капилляра — 60 см; внешний диаметр — 360 мкм, внутренний диаметр — 50 мкм. Центрифужный испаритель «Concentrator Plus» («Eppendorf», Германия); шейкер «Multi-vortex V-32» фирмы «Biosan»; рН-метр «HI 2210-2216» («Hanna»).
Микрошприцы на 20, 200, 1000 мкл (Biohite); колбы мерные стеклянные 25, 50, 100 и 250 мл, микропробирки типа эппендорф на 1,5 мл, стеклянные виалы с полипропиленовыми крышками объёмом 1,5 мл, полипропиленовые виалы с полипропиленовыми крышками объёмом 250 мкл.
Приготовление стандартных и рабочих растворов. Навески (0,050 г) стероидных гормонов (F, E, B, S) вносили в мерные колбы объёмом 50 мл, растворяли в 40 мл ацетонитрила и доводили раствор до метки ацетонитрилом.
Навески катехоламинов (0,050 г) (AD, МЛ, DA, ММ) вносили в мерные колбы объёмом 50 мл, растворяли в 40 мл 0,1М раствора соляной кислоты и доводили раствор до метки 0,1М раствором соляной кислоты.
Рабочие растворы готовили разбавлением стандартных в 50 раз дистиллированной водой или буферным электролитом.
Условия электрофоретического разделения аналитов. Температура капилляра: 20°С. Гидродинамический ввод пробы: 60-1000 мбар-с; напряжение: ±20 кВ; УФ-детектирование: 220 нм (для биогенных аминов) и 242 нм (для кортикостероидов). Варьировали рН (2,0; 9,3) и концентрацию (10-75 мМ) буферного электролита, концентрации С12М1тС1, С1бМ1тС1, ЦТАБа, в-циклодекстрина (3-150 мМ).
В качестве маркера ЭОП использовался 3%-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО) в соответствующем буферном электролите. Перед началом работы капилляр промывали 0,5М раствором НС1 в течение 10 мин, дистиллированной водой 5 мин, 0,5М раствором МаОН 10 мин, снова дистиллированной водой 5 мин и буферным электролитом в течение 15 мин. Между опытами капилляр промывали буферным электролитом в течение 3 мин.
Обсуждение результатов. В сфере наших интересов ионные жидкости на основе имидазола с алкильными радикалами С12 и С16. Подобно ПАВ, при определённых концентрациях они могут образовывать мицеллы, формируя псевдостационарную фазу; присутствие положительно заряженной имидазольной группы в составе их молекул могло бы способствовать динамической модификации отрицательно заряженных стенок кварцевого капилляра, предотвращая сорбцию основных аналитов. Это и предполагалось проверить.
В работе исследовано влияние ионных жидкостей С12М1тС1 и С1бМ1тС1 на элек-трофоретические параметры миграции биогенных аминов при разных значениях рН (2,0; 9,3) буферного электролита.
Введение ионной жидкости С12 М1тС1 в рабочий буфер способствовало динамической модификации стенок кварцевого капилляра, что подтверждалось наличием обращенного электроосмотического потока (ЭОП). До достижения критической концентрации мицеллообразования (ККМ) скорость ЭОП увеличивалась, а затем — уменьшалась за счёт формирования мицелл (рис. 1).
35 30
И 25
и
^ 20
° 15 £
10 5
0 ККМ 0,02 0,04
0,06 0,08 0,1 С(С12М1шС1), М
0,12 0,14
Рис. 1. Зависимость скорости электроосмотического потока от концентрации ИЖ
в буферном электролите: система капиллярного электрофореза «Капель-105»; кварцевый капилляр Ьобщ./^эфф. = 60/50 см, внутренний диаметр — 50 мкм; ввод пробы — 5 с X 30 мбар; маркер ЭОП—ДМСО; буферный электролит: 10 мМ фосфатный буферный раствор, рН = 2,0
1 1 1 л
1 1 1 1 1 1 2 1 1
3 1
1 1 1 1 1
■ . . 1 ■ ■ . 1 . . . ■ . .
7 8
Время, мин
17 18 19 20 21 Время, мин
Рис. 2. Электрофореграмма смеси биогенных аминов в отсутствие ионной жидкости при напряжении +20 кВ (а), с добавлением 150мМ С12 М1тС1 в состав буферного электролита при напряжении —20 кВ (б):
буферный электролит — 10мМ фосфатный буфер, рН = 2,0; УФ-детектирование — 220 нм; 1 — дофамин; 2 — норадреналин; 3 — норметанефрин; 4 — адреналин
б
а
9
Биогенные амины в кислой среде заряжены положительно и в условиях КЗЭ мигрируют по направлению к катоду за счёт собственных электрофоретических подвиж-ностей (рис. 2, а).
При введении ионной жидкости С12М1тС1 в состав рабочего буфера в концентрации, меньшей ККМ, наблюдалась динамическая модификация стенок кварцевого капилляра, сопровождаемая увеличением эффективности в случае катехоламинов в 2-3 раза (табл. 1). При концентрации ионной жидкости, превышающей значение ККМ, реализуется режим мицеллярной электрокинетической хроматографии. В этом случае увеличивается селективность разделения катехоламинов (рис. 2, б, табл. 1).
Фактор разрешения (Е3) рассчитывался по формуле
с 0*Д1 _ £д2 — --;-,
Ы2 + т1
где Ьт — время миграции первого компонента; Ьва — время миграции второго компонента; и>1 — ширина пика первого компонента у основания; и>2 — ширина пика второго компонента у основания.
Полученные величины сопоставлены с соответствующими значениями традиционно используемого катионного детергента — цетилтриметиламмония бромида (табл. 2).
Таблица 1
Значения эффективности (N) для катехоламинов при различной концентрации ионной жидкости (Сl2MImCl) в составе рабочего буфера (10мМ фосфатный буфер, рН = 2,0)
Аналиты Эс зфективность (N), т. т./м
при отсутствии ИЖ 9мМ Ci2MImCl 150мМ Ci2MImCl
AD 32 400 109 300 16 300
NM 130100 212 400 55 600
NA 94 000 125 100 36100
DA 141 400 329 800 61100
Таблица 2
Значения факторов разрешения (Яя) разделения аминокислот с использованием разных детергентов в составе фосфатного буфера (10мМ, рН = 2,0)
Аминокислоты Фактор разрешения (Rs)
при отсутствии ИЖ ЗмМ CieMImCl 150мМ Ci2MImCl 6мМ ЦТАБ
AD/NM 1,07 2,16 1,08 1,04
NM/NA 1,03 2,52 1,15 1,03
NA/DA 1,03 7,11 3,26 1,10
Ионные жидкости Ci6MImCl и C12MImCl могут образовывать мицеллы при концентрации выше 0,8мМ и 12—15мМ соответственно (ККМцтаб = 1,2мМ). При одинаковой концентрации ИЖ в буферном электролите, количество мицелл, образованных молекулами Ci6MImCl, больше, поэтому факторы разрешения выше. При введении ЦТАБ в концентрации большей ККМ в состав буферного электролита наблюдалось уширение пиков аналитов и уменьшались факторы разрешения.
Для снижения пределов обнаружения аналитов использовали возможности on-line концентрирования — стэкинга с усилением поля (field-amplified sample stacking, FASS), который основан на различии в электропроводности раствора пробы и буферного электролита. Гидродинамически вводили в кварцевый капилляр больший объём пробы из раствора с меньшей электропроводностью, чем электропроводность буферного электролита. При включении напряжения положительно заряженные биогенные амины элек-трофоретически мигрируют к катоду с локальной большей скоростью в зоне пробы и концентрируются в конце этой зоны на границе раздела с буферным электролитом. Навстречу им движется отрицательный ЭОП, способствуя дополнительному концентрированию аналитов.
Эффективность концентрирования биогенных аминов оценивали по факторам эффективности концентрирования (SEF — stacking efficiency factors) по формуле
SEFh = Д,
где Hstack — высота пика при стэкинге; H — высота пика при обычном вводе (2 с, 30 мбар); Д — фактор разбавления.
Максимальные факторы концентрирования наблюдались при введении пробы в течение 10 с под давлением 50 мбар. Факторы концентрирования биогенных аминов в условиях стэкинга с усилением поля составили: SEFh (адреналин) — 12,8; SEFh (нор-метанефрин) — 11,7; SEFh (норадреналин) — 11,2; SEFh (дофамин) — 10,1. При даль-
нейшем увеличении времени ввода пробы наблюдался дестэкинг, вызывающий размывание зоны пробы.
Исследована возможность использования ИЖ С12MImCl и CieMImCl в качестве псевдостационарной фазы при определении нейтральных аналитов — стероидных гормонов, которые в условиях КЗЭ мигрируют вместе с ЭОП.
После серии предварительных электрофоретических экспериментов по варьированию значений рН (2,0; 9,3) и концентрации буферного электролита (от 10мМ до 150мМ фосфатного и боратного буферного раствора), а также концентраций ионной жидкости CieMImCl (3-75мМ) и в-циклодекстрина (1-9,0мМ) в составе буферного электролита найдены оптимальные условия разделения кортикостероидов: 15мМ CieMImCl, 8,5мМ раствор в-циклодекстрина.
Выводы. Таким образом, установлено, что введение ионных жидкостей на основе имидазола (C12MImCl, CieMImCl) в буферный электролит (фосфатный буфер (рН = 2,0)) приводит к росту эффективности в 2-3 раза при определении биогенных аминов в условиях КЗЭ и селективности разделения в режиме МЭКХ. Показано, что применение стэкинга с усилением поля с использованием CieMImCl в составе буферного электролита позволило сконцентрировать адреналин, норадреналин, дофамин, нор-метанефрин в 10-14 раз. Предложен вариант электрофоретического разделения кортикостероидов в условиях МЭКХ с использованием ионной жидкости CieMImCl в качестве псевдостационарной фазы.
Литература
1. BerthodA., Ruiz-Angel M. J., Carda-Broch S. Ionic liquids in separation techniques //J. Chromatogr. (A). 2008. Vol. 1184. N 1-2. P. 6.
2. YangQ., Dionysiou D. D. Photolytic degradation of chlorinated phenols in room temperature ionic liquids // J. Photochem. Photobiol. (A). 2004. Vol. 165. P. 229.
3. Huddleston J. G., VisserA. E., Reichert W. M. et al. Characterization and compassion of hydrophilic and hydrophobic RTILs incorporating the imidazolium cation // Green Chem. 2001. Vol. 3. P. 156.
4. HeL., Zhang W., Zhao L. et al. Effect of 1-alkyl-3-methylimidazolium-based ionic liquids as the eluent on the separation of ephedrines by liquid chromatography //J. Chromatogr. (A). 2003. Vol. 1007. P. 39.
5. Zhang W., HeL., Gu Y. et al. Effect of ionic liquids as mobile phase additives on retention of catecholamines in reversed-phase high-performance liquid chromatography // Analytical Lett. 2003. Vol. 36. P. 827.
6. YanesE. G., GratzS. R., BaldwinM. J. et al. Capillary electrophoretic application of 1-alkyl-3-meth-ylimidazolium-based ionic liquids // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 3838.
7. NiuJ., QiuH., LiJ. et al. 1-Hexadecyl-3-methylimidazolium ionic liquid as a new cationic surfactant for separation of phenolic compounds by MEKC // J. Chromatogr. (A). 2009. Vol. 69. P. 1093.
8. Jungnickel C., LuczakJ., RankeJ. et al. Micelle formation of imidazolium ionic liquids in aqueous solution // Colloids and Surfaces (A). 2008. Vol. 316. P. 278.
References
1. Berthod A., Ruiz-Angel M.J., Carda-Broch S. Ionic liquids in separation techniques. J. Chromatogr. (A). 2008. Vol. 1184. N 1-2. pp.6.
2. Yang Q., Dionysiou D.D. Photolytic degradation of chlorinated phenols in room temperature ionic liquids. J. Photochem. Photobiol. (A). 2004. Vol. 165. pp.229.
3. Huddleston J.G., Visser A.E., Reichert W.M. et al. Characterization and compassion of hydrophilic and hydrophobic RTILs incorporating the imidazolium cation. Green Chem. 2001. Vol. 3. pp.156.
4. He L., Zhang W., Zhao L. et al. Effect of 1-alkyl-3-methylimidazolium-based ionic liquids as the eluent on the separation of ephedrines by liquid chromatography. J. Chromatogr. (A). 2003. Vol. 1007. pp.39.
5. Zhang W., He L., Gu Y. et al. Effect of ionic liquids as mobile phase additives on retention of catecholamines in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Analytical Lett. 2003. Vol. 36. pp.827.
6. Yanes E.G., Gratz S.R., Baldwin M.J. et al. Capillary electrophoretic application of 1-alkyl-3-meth-ylimidazolium-based ionic liquids. Anal. Chem. 2001. Vol. 73. pp.3838.
7. Niu J., Qiu H., Li J. et al. 1-Hexadecyl-3-methylimidazolium ionic liquid as a new cationic surfactant for separation of phenolic compounds by MEKC. J. Chromatogr. (A). 2009. Vol. 69. pp.1093.
8. Jungnickel C., Luczak J., Ranke J. et al. Micelle formation of imidazolium ionic liquids in aqueous solution. Colloids and Surfaces (A). 2008. Vol. 316. pp.278.
Статья поступила в редакцию 17 января 2015 г.
Контактная информация
Колобова Екатерина Алексеевна — аспирантка; e-mail: [email protected]
Карцова Людмила Алексеевна — доктор химических наук, профессор; e-mail: [email protected] Бессонова Елена Андреевна - кандидат химических наук, доцент; e-mail: [email protected]
Kolobova Ekaterina Alekseevna — post-graduate student; e-mail: [email protected] Kartsova Luidmila Alekseevna - Doctor of Chemistry, Professor; e-mail: [email protected]
Bessonova Elena Andreevna - Candidate of Chemistry, Associate Professor; e-mail: [email protected]
