CC BY
93
УДК 633.1:(577.16:582.29)
ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ АНТИБИОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗ ЛИШАЙНИКОВОГО СЫРЬЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕХАНОХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ
© В.В. Аньшакова1, Б.М. Кершенгольц2, В.И. Аньшаков3
1 Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова, ул. Белинского, 58, Якутск, 677000 (Россия), e-mail: [email protected] 2Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, пр. Ленина, 41,
Якутск, 677010 (Россия)
3Представительство Grace Gmbh&Co.KG, ул. Ямского Поля, 18, стр. 3, корп. 4, Москва, 125040 (Россия)
Разработана механохимическая технология получения биологически активных веществ антибиотического действия из слоевищ лишайников без участия растворителей в одну технологическую стадию. Это выгодно отличает технологичность предлагаемого подхода от классических технологий. Установлено, что механоактивация слоевищ лишайников с бикарбонатом натрия приводит к увеличению содержания водорастворимых форм биологически активных веществ и повышению их антибактериальной активности.
Ключевые слова: механохимия, биологически активные вещества, лишайники, антибактериальная активность.
Введение
Механохимическая активация является новой рациональной твердофазной технологией диспергирования сухого природного биосырья. Использование данной технологии обработки веществ основывается на физико-химических эффектах, общих для прикладной механохимии - от активации твердых веществ вследствие разупорядочения и образования дефектов, ускорения диффузионно-затруднённых стадий процессов в твердой фазе до осуществления твердофазных химических реакций непосредственно в ходе обработки. Большая часть биологически активных веществ (БАВ) в растительном сырье связана в комплексы различными связями физической и химической природы и лишь небольшая их часть может находиться в биодоступ-ной форме. Ударно-истирающее воздействие с небольшими добавками твердофазных химических реагентов (например бикарбоната натрия) сопровождается наряду с разрушением клеточных стенок изменением химического состава компонентов растительного сырья из-за разрыва ряда химических связей. Результатом успешной реализации механохимической обработки биосырья без участия растворителей в одну технологическую стадию является увеличение в продукте более полного спектра биоактивных веществ в биологически доступных (водорастворимых) формах. Наличие биодоступных форм биологически активных веществ, безусловно, способствует эффективному усвоению препарата, так как существует общая тенденция низкой усвояемости подавляющего большинства витаминно-микроэлементных комплексов, активных веществ фармпрепаратов, пищевых и кормовых, связанная с проблемами при их всасывании в кишечнике.
Ранее были получены предварительные данные, свидетельствующие о том, что интенсивная механическая активация растительного сырья, повышающая степень диспергирования, сопровождается увеличением выхода и разнообразия состава БАВ [1, 2], а также их активацией [3-5]. Несмотря на имеющиеся результаты в области механохимической переработки природного растительного сырья, из-за сложности состава выделяемых БАВ требуются более детальные исследования с привлечением комплекса физикохимических и биологических методов.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Цель работы - изучение возможностей интенсификации процессов выделения водорастворимых биологически активных веществ из лишайникового сырья с использованием твердофазной механохимической технологии и исследование атибактериальной активности полученного механоактивированного препарата.
Экспериментальная часть
Объектом исследования являлись слоевища лишайников рода Cladonia, произрастающие в Республике Саха (Якутия).
Механохимическую активацию проводили в воздушной среде в мельнице-активаторе планетарного типа АГО-2 (разработка Института химии твердого тела и механохимии СО РАН), которая представляет собой машину типа барабанных шаровых мельниц, где воздействие гравитационного поля на рабочее тело (мелющие шары) заменено центробежной силой. В конструкции мельницы с периодической загрузкой используются два барабана объемом по 100 мл, заполненные в приведенных опытах на 1/3 объема стальными шарами диаметром 8 мм (воздействующие тела), на 1/3 исследуемым веществом (ягель с 0,5% массовой добавкой NaHCO3) массой 20 г и 1/3 приходится на свободное воздушное пространство. Такая загрузка барабана-реактора соответствовала ударно-истирающему режиму работы, обеспечивая максимальное воздействие мелющих тел на объект исследования при скорости вращения барабанов 1500 об./мин. Во время работы барабаны охлаждали водой для исключения разогрева обрабатываемого материала. Предварительными опытами было установлено оптимальное время обработки - 2-3 мин.
Для исследования физико-химических и биологических свойств полученных БАВ, перешедших в результате механохимической реакции в биодоступную форму, использовали методы ИК-спектроскопии и стандартные методы определения антибактериальной активности препарата in vitro.
Результаты и обсуждение
Известно, что лишайниковое биосырье является источником природных веществ антибиотического действия (ПВАД) [6-9]. Для химического строения всех лишайниковых кислот характерно наличие двух остатков полизамещенных фенолов или фенолкарбоновых кислот, связанных друг с другом в различных комбинациях.
CH3
HO—^ ^—CO
OH
CH3
CH2CO(CH2)4CH3
.COO. ^ ,OH H3C.
COOH
HO
OH
O
II
COOH HO
(CH2)4CH3
OH
OH
O
COCH3
III
COCH3
O
I
Рис. 1. Простейшие представители лишайниковых кислот: леканоровая (I); физодовая (II); усниновая (III)
Леканоровая кислота относится к структурному типу депсидов, простейший представитель лишайниковых кислот структурного типа депсидонов - антибиотик физодовая кислота. К структурному типу дибензофурана относится широко распространенная в лишайниках усниновая кислота.
Использование механохимической стадии в технологическом цикле производства антибактериального препарата из слоевищ лишайников на этапе обработки сухого сырья с добавкой 0,5% по массе твердого МаНСО3 позволяют более полно извлекать лишайниковые кислоты из ягелевого сырья за счёт перевода их в водорастворимую фенолятную форму.
Методом ИК-спектроскопии исследовали два порошка ягеля - механоактивированного и контрольного. В качестве контрольного образца использовали ягель грубого помола с идентичной добавкой бикарбоната натрия 0,5% по массе. Анализ показал, что характер ИК-спектров в случае всех образцов ягеля идентичен (рис. 2).
Вместе с тем интенсивность всех наблюдаемых полос поглощения зависит от способа получения образца биопрепарата. Увеличение интенсивности поглощения в области валентных колебаний ОН-группы (3450-3350 см-1) механохимического ягеля свидетельствует о разрыве части прочных р-гликозидных связей в исходных нерастворимых полисахаридах, входящих в состав лишайникового сырья, и, как следствие, об образовании более биодоступных р-олигосахаридов.
Рис. 2. ИК-спектры образцов ягеля различного помола
Наличие в ИК-спектре ряда полос (1670-1630 см-1 - С=С-связи сопряженных систем; 1200-1270 см-1 -С-О-С- группы атомов; 1100-1000 см-1 - как пиранозные циклы, так и -С-ОС- группы атомов; 900 см-1 деформационные колебания С-Н), выше для механоактивированных образцов, что свидетельствует об их большей насыщенности функциональными группами и об увеличении содержания БАВ в исследуемом механохимическом препарате.
Ранее было показано, что полученные природные лишайниковые p-олигосахариды проявляют себя как комплексообразователи - биодетоксиканты с большой широтой терапевтического индекса, так как способны прочно связывать и легко транспортировать через различные мембранные комплексы экзогенные и эндогенные токсины во внутренних средах организма человека, в том числе эндотоксины малой и средней молекулярной массы, образующиеся при токсикозах беременности, воспалительных процессах любой этиологии, обострениях аллергических состояний и др., а также катионы тяжелых металлов, радионуклидов, токсические альдегиды и кетоны, канцерогены, шлаки [5].
С другой стороны, p-олигосахариды могут проявлять себя и как синергетная комплексообразующая компонента с ПВАД - лишайниковыми кислотами. Доказано, что комплексирование растительных метаболитов, например, гликозида корня солодки, арабиногалактана, с различными действующими веществами фармпрепаратов, как правило, приводит к желаемому снижению эффективной дозы последних [10, 11].
Ранее установлена высокая антибиотическая активность механохимических 45% водно-спиртовых экстрактов ягеля по отношению к восьми штаммам микрофлоры, в том числе условно-патогенной и патогенной [3, 4]. Для сравнения исследовалась антибиотическая активность отваров ягеля, которая практически отсутствовала, а также 45% водно-спиртового экстракта механически измельченного ягеля грубого помола. Последний обладал антибиотической активностью в пределах 10% от соответствующей активности спиртового раствора механохимического препарата.
Следует отметить, что применение спиртовых растворов имеет ряд противопоказаний: их нельзя назначать детям, лицам, имеющим алкогольную зависимость, и др. Нами проведены сравнительные исследования антибактериальной активности твердофазных контрольных и механообработанных слоевищ лищай-ников в экспериментах на следующих культурах бактериальных штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов по стандартам мутности культур на 5 и 10 единиц: 1) Staphylococcus aureus - 6538-p; 2) Escherichia coli -H-257; 3) Pseudomonas aeruginosa - 33105; 4) Klebsiella pneumoniae.
Использовались стандартные питательные среды: среда Эндо, молочно-желточно-солевой агар, среда Плоскирева, мясо-пептонный агар (МПА), которые были приготовлена по стандартной прописи [12] с добавлением в питательную среду контрольного и исследуемого образца количеством 5,0 мг/мл. Газонным методом был произведен посев культур микроорганизмов, и после культивации в термостате при 37,0 °С оценивалась интенсивность их роста. Результаты оценки приведены в таблице.
Таким образом, показана полная лизирующая способность механохимического препарата ягеля в отношении четырех условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов, включая Staphylococus aureus, Klebsiella pneumonia и других, тогда как ягель грубого помола показал либо едва заметную попытку к лизису, либо микроорганизмы лизировались частично.
Антибактериальное действие твердофазныx препаратов ягеля на культуры условно-патогенный и
патогенный бактериальныx штаммов
Название видов бактериальных штаммов Антибактериальное действие контрольного образца Антибактериальное действие меxано-активированного препарата
Staphylococcus aureus - 6538-p + ++++
Escherichia coli -H-257 + +++
Pseudomonas aeruginosa - 33105 + ++++
Klebsiella pneumoniae + ++++
^ + - слабый лизис; ++ - частичное лизирование; +++ - почти полный лизис; ++++ - полный лизис
Совокупность вышеизложенных фактов позволяет предположить, что такое резкое повышение антибиотической активности механоактивированного препарата связано с тем, что переход в фенолятную форму лишайниковых кислот увеличивает их биодоступность, и в определенной степени лишайниковые р-олигосахариды проявляют себя как синергетная компонента в комплексе с ПВАД - лишайниковыми кислотами, что и приводит к резкому повышению антибиотической активности механоактивированного препарата.
Заключение
Применение механохимической технологий обработки лишайникового сырья без участия растворителей с небольшой добавкой бикарбоната натрия в одну технологическую стадию имеет большие перспективы, поскольку позволяет осуществлять процессы получения твердофазных препаратов самых различных БАВ (витамино-минеральные комплексы, активные вещества антибиотического, цитостатического, иммуно-модуляторного и других направлений действия) доступными и экологически чистыми методами. Это выгодно отличает получаемые механохимические препараты от аналогов, произведенных с использованием классических технологий.
Список литературы
1. Королёв К.Г., Ломовский О.И., Рожанская О.А., Васильев В.Г. Механохимическое получение водорастворимых форм тритерпеновых кислот // Химия природных соединений. 2003. №4. С. 295-300.
2. Иванов А.А., Юдина Н.В., Ломовский О.И. Влияние механохимической активации на состав и свойства гу-миновых кислот торфов // Известия Томского политехнического университета. 2006. Т. 309, №5. С. 73-77.
3. Патент №2385159 (РФ) Способ получения препарата ягель-м, обладающего противотуберкулезным действием / Филиппова Г.В., Шашурин М.М., Кершенгольц Б.М., Журавская А.Н., Ломовский О.И., Павлов Н.Г., Шеин А.А. / 27.03.2010
4. Филиппова Г.В., Павлов Н.Г., Шашурин М.М., Кершенгольц Б.М. Влияние биологически активных веществ из слоевищ северных лишайников, экстрагированных различными методами, на биологические свойства микобактерий туберкулеза // Сибирский медицинский журнал. 2008. №3. С. 99-103.
5. Кершенгольц Б.М., Ремигайло П.А., Шеин А.А., Кершенгольц Е.Б. Природные биологически активные вещества из тканей растений и животных Якутии: особенности состава, новые технологии, достижения и перспективы использования в медицине // Дальневосточный медицинский журнал. Приложение №1, 2004. С. 25-29.
6. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. Новосибирск, 1991. 431 с.
7. Витовская М.Л., Виноградова Т.И., Заболотных Н.В., Сафонова М.Ю. Роль ислацета (экстракта из слоевищ цетрарии исландской) в комплексной терапии экс-периментального туберкулеза // Пролемы туберкулеза и болезней легких. 2005. №11. С. 44-47.
8. Сафонова М.Ю. Фармакогностическое и фармакологическое изучение слоевищ цетрарии исландской -СеШпа 1з1апШса (Ь.) Аск: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. СПб, 2002. 21 с.
9. Савич В.П., Купревич В.Ф., Литвинов М.А. и др. О новом антибиотике из лишайников - натриевой соли ус-ниновой кислоты // Споровые растения. М.;Л., 1956. Вып. 11. С. 5-37.
10. Душкин А.В., Метелева Е.С., Толстикова Т.Г., Толстиков Г.А., Поляков Н.Э., Медведева Е.Н., Неверова Н.А., Бабкин В.А. Механохимическое получение и фармакологическая активность водорастворимых комплексов арабиногалактана и лекарственных веществ // Известия РАН. Сер. Химическая. 2008. №6. С. 1274-1282.
11. Душкин А.В., Метелева Е.С., Толстикова Т.Г., Хвостов М.В., Долгих М.П., Толстиков Г.А. Комплексирова-ние фармаконов с глицирризиновой кислотой - путь создания лекарственных препаратов повышенной эффективности // Химия в интересах устойчивого развития. 2010. Т. 18. №4. С. 517-525.
12. МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. методические указания. (Утв. главным государственным санитарным врачом РФ 04.03.2004). М., 2004.
Поступило в редакцию 29 апреля 2010 г.
После переработки 17 января 2011 г.
