CC BY
182
© ЗАХАРОВА И.Б., ВИКТОРОВ Д.В., 2015 УДК 579.84/.86:579.255
Захарова И.Б., Викторов Д.В. ИНТЕГРАТИВНЫЕ КОНЪЮГАТИВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ МИКРООРГАНИЭМОВ (ICEs)
Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 400131, Волгоград
Интегративные конъюгативные элементы (ICEs) - обширная группа мобильных генетических элементов, обнаруженных у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Данные генетические элементы реплицируются, находясь в интегрированном в хромосому хозяина состоянии, однако сохраняют способность к вырезанию из хромосомы и конъюгативному переносу. Имея набор генов систем конъюгативного переноса, контроля удаления и интеграции в хромосому, ICEs непосредственно участвуют в процессах горизонтального переноса генетических детерминант, увеличивающих адаптивный потенциал бактериальных видов, а также выступают в качестве мобилизующего фактора для других генетических элементов.
Ключевые слова: интегративные конъюгативные элементы; ICEs; горизонтальный генетический перенос.
Интегративные конъюгативные элементы - ICEs (Integrative Conjugative Elements), также употребляется термин «constin» (conjugative self-transmissible integrating element) - являются одним из трех известных типов мобильных генетических элементов, способных к самостоятельному переносу, и имеют определенное сходство как с плазми-дами, так и с бактериофагами. Подобно конъюгативным плазмидам, ICEs перемещаются при помощи конъюгации, но в отличие от плазмид не способны к самостоятельной репликации. Подобно умеренным бактериофагам, интегрируют в хромосому хозяина и реплицируются вместе с ней [1, 2]. К сегодняшнему дню различные типы ICEs обнаружены как у грамотрицательных, так и у грамполо-жительных бактерий. Имея в своем составе набор генов конъюгативного переноса и систем контроля удаления из хромосомы и интеграции в нее, ICEs могут выступать в качестве мобилизующего фактора для других генетических элементов, тем самым способствуя горизонтальному переносу детерминант вирулентности, устойчивости к антибиотикам и других генов [3].
Возрастающее число сведений об идентификации различных типов ICEs в последнее время связано прежде всего с пополнением генетических баз данных сведениями о полногеномных сиквенсах различных микроорганизмов [4-6]. Классификация данных генетических элементов сегодня находится в процессе становления; не все из идентифицированных ICEs отнесены к определенным филогенетическим семействам, наиболее детально охарактеризованным из которых является семейство элементов SXT/R391 Vibrio cholerae. Отметим также, что такие генетические элементы, как pSAM2 и Tn916, описанные более 10 лет назад и классифицируемые ранее как плаз-миды и конъюгативные транспозоны соответственно, в настоящее время также относят к ICEs.
Обнаружение и распространенность ICEs
SXT-элемент, ICE размером порядка 100 т.п.н., впервые был обнаружен в штамме M010, одном из первых клинических изолятов V cholerae 0139 из Мадраса (Индия). Штаммы данной серогруппы V. cholerae явились причиной эпидемических вспышек холеры на юго-востоке Индии в конце 1992 г., быстро распространи-
Для корреспонденции: Викторов Дмитрий Викторович, [email protected].
лись по всей Азии и на время вытеснили V. cholerae 01 как основную причину холеры в Индии и Бангладеш. Обнаруженный в M010 ICE был назван SXT, а позднее переименован в SXTM010 [7, 8].
SXT кодирует резистентность к нескольким антибиотикам, включая триметоприм и сульфометаксазол, для которых часто используют совместную аббревиатуру «SXT», по которой и назвали первый идентифицированный ICE. В 2006 г. V. Burrus и соавт. предложили оставить устоявшиеся названия неизменными, а для вновь описываемых элементов данного типа использовать универсальную номенклатуру: префикс ICE, аббревиатура вида происхождения элемента, 3 буквы названия страны выделения и количество кластеров генов резистентности [9], например ICEVchMexl - ICE, выделенный из холерного вибриона в Мексике.
С начала 90-х годов прошлого века V. cholerae, содержащие SXT-подобные ICEs, получили широкое распространение в странах Азии. В настоящее время большинство, если не все, азиатские штаммы V cholerae содержат данные элементы [10, 11]. Кроме того, было выявлено, что азиатские нетоксигенные изоляты V. cholerae [12] и штаммы Vfluvialis [13] также содержат SXT-подобные ICEs.
В дальнейшем SXT-элементы были обнаружены в штаммах холерного вибриона, выделенных и в других регионах мира. Так, в штамме V. cholerae, выделенного из сточных вод в Мексике, обнаружен SXT-подобный ICE, ICEVchMex1[14]. А. Dalsgaard и соавт. в 2001 г. выявили SXT-подобные ICE в клинических изолятах V. cholerae из Мозамбика и Южной Африки [15], причем эти ICEs были сходны с SXT-элементами штаммов из Бангладеш, Вьетнама [10] и Лаоса [11] и кодировали устойчивость к тетрациклину. В Европе у целого ряда видов вибрионов (V scophthalmi, V splendidus, V alginolyticus), а также Shewanella haliotis и Enterovibrio nigricans, выделенных из проб морской воды в 2001-2010 гг. в северо-западной части Пиренейского полуострова, также были обнаружены SXT-подобные ICEs [16]. К настоящему времени во всем мире выявлено более 35 SXT-подобных элементов в изолятах V. cholerae различных серогрупп и по меньшей мере в 9 других видах рода Vibrio [17].
Кроме видов рода Vibrio, SXT-подобные ICEs были обнаружены у Photobacterium damselae, Shewanella putre-faciens, Providencia alcalifaciens [7, 18, 19], Enterococcus faecalis [20], Salmonella spp. [21]. В штаммах Actinobacter spp., выделенных в Канаде и США, обнаружены AICEs -одна из разновидносей ICEs [22].
В. Hochhut и соавт. [7] установили, что SXT генетически и функционально связан с элементом R391, принадлежащим к IncJ-группе несовместимости. R391, кодирующий устойчивость к канамицину (Km) и ртути (Hg), был обнаружен в южноафриканских штаммах Providencia rettgeri (ранее известный как Proteus rettgeri), выделенных в 1967 г. Было установлено, что, у SXT и R391 int гены, необходимые для интеграции и вырезания ICEs, почти идентичны [7]. Сравнение регионов конъюгативного переноса в геномах SXTM010 и R391 продемонстрировало тесную связь данных элементов [23].
Во всех известных случаях распространения SXT между различными видами и родами бактерий, до сих пор не ясно, какой вид (или род) является донором, а какой - реципиентом.
Элемент pJY1 группы IncJ был обнаружен в клиническом изоляте V. cholerae 01 на Филиппинах почти за 20 лет до появления V. cholerae О139 [24]. Интересно, что pJY1, как SXTM010 и ICEVchInd1, опосредует устойчивость к сульфаметоксазолу, хлорамфениколу и стрептомицину (устойчивость к триметоприму не исследовалась); предполагается, что данная структура может быть непосредственным предшественником SXT.
Хотя SXTM010, ICEVchInd1, ICEVchHKo1, R391 и другие ICEs не являются полностью идентичными, они имеют одну особенность, которая позволяет объединить их в одно функциональное семейство SXT/R391. Все эти ICEs кодируют высокогомологичные интегра-зы и встраиваются в хромосомный ген prfC [7, 8, 10]. Сравнение полных нуклеотидных последовательностей SXTM010 (99.5 т.п.н.) и R391 (89 т.п.н.) показало высокую консервативность групп генов, кодирующих их регуляцию, интеграцию/вырезание и функции конъюгативного переноса [25].
Передача элементов семейства sxT/R391 и ее регуляция
В передаче ICEs выделяют 3 этапа: вырезание из хромосомы хозяина и формирование внехромосомного циркулярно-замкнутого интермедиата, конъюгативный перенос его к новому хозяину, интеграция переданной молекулы в хромосому нового хозяина.
SXT-элемент интегрирует в 5'-конец prfC-гена, расположенного на большой хромосоме холерного вибриона и кодирующего GTP-связывающий белок, участвующий в терминации белкового синтеза (RF3) [26]. Интеграция SXT нарушает последовательность на 5'-конце prfC и предоставляет новую 5'-кодирующую последовательность и промотор, который включает экспрессию функционального RF3. Интеграция в хромосому происходит с помощью сайтспецифической рекомбинации, происходящей между attP-последовательностью элемента SXT и attB-последовательностью хромосомы реципиента (рис. 1). Оба сайта, attP и attß, представляют собой последовательности из 17 п.н. (различающихся по 4 нуклеотидам), внутри которых определено несколько потенциальных сайтов разрезания при рекомбинации. Интегрированный sXT фланкирован последовательностями из 17 п.н., образующими сайты attL и attR, специфически узнаваемыми при вырезании sXT. Интеграция и вырезание sXT из хромосомы происходит при участии тирозиновой интегразы Int, которая принадлежит к семейству сайтспецифических рекомбиназ. Наиболее близка она к интегразе бактериофага ф80. Механизмы этих процессов родственны процессам сайтспецифиче-ской рекомбинации ламбдоидных бактериофагов [9].
Вырезание SXT происходит путем рекомбинации между короткими последовательностями attL и attR, которые почти идентичны и расположены по обе стороны от встроенного элемента. Этот акт рекомбинации приводит к формированию attP на вырезанной кольцевой молекуле SXT и attB на хромосоме. Интеграза необходима, но не достаточна для эффективной рекомбинации между attL и attR; также для вырезания SXT необходим другой белок - Xis. Xis действует как фактор направленности рекомбинации, способствует вырезанию SXT и подавляет его интеграцию [8].
Внехромосомный циркулярно-замкнутый интер-медиат SXT является субстратом для конъюгативного
Стимуляция SOS-ответа / \
( RecA >
Неактивный репрессор SetR \ /Активный репрессор SetR
Расщепление
SetR
и /
Активатор SetC и SetD
Рис. 1. Модель регуляторного пути, по которому SOS-ответ увеличивает передачу SXT (по [29]). Ко-протеазная активность белка ЯесА активируется во время SoS-ответа. Активированный ЯесА (ЯесА*) вызывает аутораспад репрессию s086, экспрессию setD и setC. Повышенные уровни БеС и SetD приводят
к самоактивации setD и setC, а также к активации (га- и Ш-локусов.
переноса. Гены (га образуют 4 кластера, охватывающие более 25 т.п.н. Первый кластер содержит последовательности, необходимые для инициирования передачи и процессинга ДНК, в том числе ориджин передачи (огТ), никазу и белок связывания [23].
Как и многие конъюгативные плазмиды, 8ХТ несут в своем составе систему исключения еехБ, которая кодирует небольшие внутримембранные белки и ингиби-рует передачу этих элементов между донорскими клетками [27]. Экспрессия еехБ необязательна для передачи 8ХТ от донорских клеток реципиентным.
связывается с 4 операторами между s086 и setR, транскрибируемых в разных направлениях [23]. SetR подавляет экспрессию промотора перед s086, который считается первым геном оперона, включающего setC и setD, ключевых активаторов передачи SXT. SetC и SetD активируют транскрипцию как интегразы, так и четырех (га-оперонов, кодирующих процессинг ДНК и образование пар спаривания.
Передача SXT требует наличия гена гесА в донорских клетках, но молекулярные основы данного обстоятельства неясны [28]. Два локуса, setC и setD, кодируют транскрипционные активаторы, необходимые для вырезания и передачи SXT; гиперэкспрессия этих активаторов была токсична для клеток, которые содержали SXT, но не для клеток, в которых SXT отсутствовал [23]. Ген setR, расположенный на З'-конце, сходен с С1-репрессором бактериофага X и, так же, как и этот репрес-сор, предположительно содержит ДНК-связывающий мотив спираль-поворот-спираль и мотив протеазы.
Сходство SetR с С1-репрессором фага X указывает, что регуляция передачи SXT может быть похожа на регуляцию Х-лизогении. В Х-лизогенах С1 подавляет экспрессию генов профага. После повреждения ДНК и индукции SOS-ответа ко-протеазная активность RecA стимулирует ауто-протеолиз С1, ослабление С1-опосредованной репрессии и начало литического цикла фага. Так как передача SXT требует наличия гесА в донорских клетках, а SetR сходен с С1, вызываемый SOS-ответ может привести к RecA-зависимому расщеплению и инактивации SetR, повышению экспрессии setC и setD и ускорению SXT-передачи (см. рис. 1). Инактивация SetR выключает репрессию setC и setD, транскрипционных активаторов конъюгативной передачи SXT и гена интегразы. Воздействие стрессовых физических факторов, таких как ультрафиолетовое из-
Таблица 1
Основные гены SXT (по [30])
Координаты в нуклеотидной Гомология
Гены SXT последовательности элемента, GenBank acc. AY055428 Функция ген генетический элемент (микроорганизм)
001 (int) 836-2074 Интеграза int R391 (Providencia rettgeri)
002 (rumB') 4244-5413 ДНК полимераза, УФ-репарация rumB R391 (P. rettgeri)
003 (dfr18) 11656-12207 Дигидрофолатредуктаза тип VIII dhfrVIII pLM0226 (Escherichia coli)
004 (floR) 16399-17610 Флорфеникол-экспортер floR E. coli
005 (strB) 18572-19405 Стрептомицин-фосфотрансфераза strB Tn5393 (Erwinia amylovora)
006 (strA) 19408-20022 То же strA Tn5393 (E. amylovora)
007 (sulII) 23514-23831 Дигидроптеорат-синтаза тип II sulII RSF1010 (E. coli)
008 (rumB) 23791-24162 ДНК-полимераза, УФ-репарация rumB R391 (P. rettgeri)
009 (rumA) 45176-47323 УФ-репарация rumA R391 (P. rettgeri)
010 (tral) 47396-49192 Релаксаза xf1753 Xylella fastidiosa
011 (traD) 51187-51471 Фактор связывания traG R27 (Salmonella enterica serovar Typhi)
012 (traL) 51471-52094 Сборка sex-пилей traL pNL1 (Sphingomonas aromaticivorans)
013 (traE) 52980-54266 То же trhE R27 (S. enterica serovar Typhi)
014 (traB) 54266-54913 " " trhB R27 (S. enterica serovar Typhi)
015 (traV) 54913-55296 " " trhV R27 (S. enterica serovar Typhi)
016 (traA) 58066-60462 Субъединица пилина trhA R27 (S. enterica serovar Typhi)
017 (traC) 61312-62433 Сборка sex-пилей trhC R27 (S. enterica serovar Typhi)
018 (traW) 62420-63445 То же trhW R27 (S. enterica serovar Typhi)
19 (traU) 63683-67144 " " trhU R27 (S. enterica serovar Typhi)
020 (traN) 88747-89721 Стабилизация пар скрещивания trhN R27 (S. enterica serovar Typhi)
021 (traF) 89727-91112 Сборка sex-пилей r0126 R27 (S. enterica serovar Typhi)
022 (traH) 91119-94685 То же trhH R27 (S. enterica serovar Typhi)
023 (traG) 95210-95740 " " traG R27 (S. enterica serovar Typhi)
024 (setC) 95740-96036 Транскрипционный активатор s006 DT104 (S. enterica serovar Typhimurium)
025 (setD) 98513-99157 Транскрипционный активатор флагеллина flhD Serratia liquefaciens
026 (setR) 26241-27164 Транскрипционный репрессор cl Фаг 434
027 27395-27775 Функция неизвестна
028 27766-28356 То же
029 28378-30270 " "
030 30325-31920 " "
031 32037-32570 Рекомбинация orf1 pNSF-1 (Shigella flexneri)
032 32488-33237 Функция неизвестна ss01994 Sulfolobus solfataricus
033 33237-33992 То же
034 34209-34676 1! II
035 34672-35868 II II
036 35852-36229 II II
037 36399-37010 II II
038 37601-40231 II II
039 40251-42323 Lon-протеаза lon Thermus thermophilus
040 42331-45018 Функция неизвестна orf74 pB171 (E. coli)
041 (tral) 45176-47323 Релаксаза xf1753 X. fastidiosa
042 (traD) 47396-49192 Фактор связывания traG R27 (S. enterica serovar Typhi)
043 49753-50385 То же r0117 R27 (S. enterica serovar Typhi)
044 50417-50692 Функция неизвестна gp48 Бактериофаг N15
045 50692-51012 То же gp49 Бактериофаг N15
046 (traL) 51187-51471 Сборка sex-пилей traL pNL1 (S. aromaticivorans)
047 (traE) 51471-52094 То же trhE R27 (S. enterica serovar Typhi)
048 52078-52974 Функция неизвестна r0031 R27 (S. enterica serovar Typhi)
049 (traB) 52980-54266 Сборка sex-пилей trhB R27 (S. enterica serovar Typhi)
050 (traV) 54266-54913 То же trhV R27 (S. enterica serovar Typhi)
051 (traA) 54913-55296 Субъединица пилина trhA R27 (S. enterica serovar Typhi)
052 (ynd) 55664-56308 Функция неизвестна ynd pTi (Agrobacterium tumefaciens)
053 (ync) 56292-57239 То же ync pTi (A. tumefaciens)
054 (dsbC) 57374-58063 Тиолдисульфидный обмен dsbC Pseudomonas aeruginosa
055 (traC) 58066-60462 Сборка sex-пилей trhC R27 (S. enterica serovar Typhi)
11 Продолжение см. на стр. 12
Продолжение табл. 1
056 (trsF) 60789-61298 Сигнальная пептидаза конъюгации trhF R27 (S. enterica serovar Typhi)
057 (traW) 61312-62433 Сборка sex-пилей trhW R27 (S. enterica serovar Typhi)
058 (traU) 62420-63445 То же trhU R27 (S. enterica serovar Typhi)
060 (traN) 63683-67144 Стабилизация пар скрещивания trhN R27 (S. enterica serovar Typhi)
060 67927-69006 Функция неизвестна
061 69009-70070 То же
062 70186-70899 Нуклеаза nucM Pectobacterium chrysanthemi
063 71011-71610 Функция неизвестна
064 (ssb) 72318-72734 Однонитевая ДНК - связывающий белок, 88В ssb F-плазмида (E. coli)
065 (bet) 72817-73632 Рекомбинация bet Бактериофаг 933W
066 (gp47) 73921-74934 Функция неизвестна gp47 Бактериофаг A118
067 (cobS) 75030-76103 Биосинтез порфирина cobS pMT1 (Yersinia pestis)
068 76975-77925 Функция неизвестна r0207 R27 (S. enterica serovar Typhi)
069 77990-78427 То же
070 78500-80152 " " r0206 R27 (S. enterica serovar Typhi)
071 (radC) 80237-80731 Репарация ДНК radC Vibrio cholerae
072 81243-82241 Функция неизвестна r0204 R27 (S. enterica serovar Typhi)
073 82335-83039 То же
074 83307-84233 Регулятор SOS-ответа rrp-1 Borrelia burgdorferi
075 84242-88045 Гистидинкиназа pa4112 P. aeruginosa
076 (traF) 88747-89721 Сборка sex-пилей r0126 R27 (S. enterica serovar Typhi)
077 (traH) 89727-91112 То же trhH R27 (S. enterica serovar Typhi)
078 (traG) 91119-94685 " " traG R27 (S. enterica serovar Typhi)
079 94724-95173 Функция неизвестна
080 (setC) 95210-95740 Транскрипционный активатор s006 DT 104 (S. enterica serovar Typhimurium)
081 (setD) 95740-96036 Транскрипционный активатор флагеллина flhD Serratia liquefaciens
082 96036-96581 Функция неизвестна mlr2934 Mesorhizobium loti
083 96571-96936 То же
084 96929-97231 " "
085 97221-97739 " "
085 (ydaS) 98147-98395 " " ydaS Профаг CP-933N (E. coli)
086 (setR) 98513-99157 Транскрипционный репрессор cl Фаг 434
лучение, стимулирует SOS-ответ и может активировать передачу SXT, кроме того, SOS-ответ активируется по крайней мере при воздействии двух классов антибиотиков - фторхинолонов (ципрофлоксацин) и ингибиторов дигидрофолатредуктазы (триметоприм) [29].
Обобщая вышеизложенное, можно представить цикл жизни SXT следующим образом (по Burrus V. и соавт. [9]): в интегрированном состоянии белок-репрессор SetR подавляет PL-промотор, который отвечает за экспрессию SXT активаторов SetC и SetD, тем самым прекращая экспрессию большинства генов SXT. Вероятно, несколько генов, таких как eexS, который является регулятором передачи, экспрессируются конститутивно.
RecA-зависимый аутопротеолиз SetR снижает репрессию setC и setD, что приводит к увеличению уровня белков SetC и SetD и к самоактивации генов setC и setD, а также к активации экспрессии tra и int. Активация tra-генов приводит к производству белков, участвующих в формировании аппарата спаривания, и белков, участвующих в ДНК-процессинге, таких как релаксаза Tral. Tra-белки формируют аппарат спаривания. Активация int приводит к производству Int, который в присутствии Xis катализирует вырезание SXT путем сайтспецифической рекомбинации между attL и attR, в результате чего образуются attB на хромосоме и attP на кольцевой молекуле SXT. Кольцевая молекула SXT используется в качестве субстрата для передачи по аппарату спаривания.
В клетке-реципиенте SXT экспрессирует рекомби-
нантную Int, которая катализирует интеграцию свободной циклической формы SXT в prfC путем рекомбинации между attP и attB. SXT экспрессирует репрессор SetR, который подавляет экспрессию tra и int. SXT также экспрессирует EexS, который препятствует передаче между клетками-донорами.
Генетическая структура элементов семейства sxT/R391
Последовательности ICEs представляют собой совокупность генов предположительно плазмидного и фагового происхождения, а также генов, происхождение которых неизвестно (табл. 1, рис. 2) [30]. Размеры известных ICEs варьирут в диапазоне от 80 до 105 т.п.н.
Консервативные последовательности ICEs представлены генами, участвующими в интеграции/вырезании, конъ-югативном переносе и регуляторных процессах [30].
Кроме того, все известные ICEs содержат вариабельную ДНК, придающую элементспецифические свойства [9]. Вариабельные последовательности размером приблизительно от 30 до 60 т.п.н. находятся в основном в 5 горячих точках (HS, hot spot), обозначаемых HS1 - HS5. Некоторые ICEs также содержат вариабельную ДНК, встроенную за пределами 5 горячих точек, в 4 вариабельных регионах (VR - variable region), обозначаемых VRI-VRIV [4]. Среди функций, кодируемых вариабельной ДНК, ICEs - устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам, регулирование образования биопленок и подвижности [31].
Таблица 2
Различные семейства ICEs (по материалам веб-сервера ICEBerg, http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg)
Число
№ п/п Семейство ICE известных ICE Распространенность
1 SXT/R391 89 Vibrio spp., Enterovibrio spp., Providencia spp., Photobacterium damselae, Shewanella spp., Proteus
spp., Escherichia coli
2 Tn916 82 Enterococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium spp., Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis, Listeria monocytogenes, Filifactor alocis
3 Tn4371 28 Ralstonia spp., Delftia acidovorans, Acidovorax spp., Congregibacter litoralis, Bordetella petrii, Comamonas testosteroni, Acidovorax ebreus, Congregibacter litoralis, Shewanella spp., Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Thioalkalivibrio, Alicycliphilus denitrificans, Polaromonas, naphthalenivorans, Burkholderia spp., Cupriavidus metallidurans
4 CTnDOT/ERL 7 Bacteroides spp., Porphyromonas gingivalis
5 ICEclc 16 Burkholderia xenovorans, Cupriavidus metallidurans, Xanthomonas campestris, Pseudomonas spp., Herminiimonas arsenicoxydans, Tolumonas auensis, Acidovorax spp., Ralstonia spp., Achromobacter xylosoxidan, Bordetella petrii
6 ICEBs1 2 Bacillus spp.
7 ICEHin1056 7 Haemophilus spp.
8 PAPI-1 7 Pseudomonas spp.
9 ICEMlSym(R7A) 2 Mesorhizobium loti
10 ICESt1 4 Streptococcus spp.
11 SPI-7 6 Salmonella spp.
12 ICE6013 13 Staphylococcus aureus
13 ICEKp1 9 Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Dickeya spp.,Citrobacter koseri, Enterobacter hormaechei
14 TnGBS1 3 Streptococcus agalactiae
15 Tn5253 18 Streptococcus pneumoniae
16 ICESa2603 8 Streptococcus spp.
17 ICEYe1 4 Yersinia spp.
18 10270-RD.2 2 Streptococcus pyogenes
19 Tn1207.3 2 Streptococcus pyogenes
20 Tn1806 5 Streptococcus spp., Aerococcus urinae, Finegoldia magna
21 ICEA5632 4 Mycoplasma spp.
22 ICEF-I/II 6 Mycoplasma fermentas
23 ICEAPG2 4 Mycoplasma spp.
24 ICEM 5 Mycoplasma mycoides
25 10270-RD.1 7 Streptococcus pyogenes, Bradyrhizobium japonicum
26 Tn5801 8 Staphylococcus spp., Streptococcus mitis, Enterococcus faecium
27 PPI-1 6 Streptococcus pneumoniae
28 ICEF-III 3 Mycoplasma fermentas
29 Неклассифицированные 103 Bacteroides spp., Salmonella enterica, Enterococcus spp., Escherichia coli, Lactococcus lactis, Streptomyces spp., Amycolatopsis spp., Klebsiella pneumoniae, Micromonospora rosaria,
Saccharopolyspora erythraea, Vibrio cholerae, Clostridium difficile, Frankia spp., Salinispora spp., Helicobacter spp., Pseudomonas spp., Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Citrobacter rodentium, Photorhabdus luminescens, Erwinia carotovora
В целом ICEs имеют выраженную модульную структуру; гены определенных функциональных групп сгруппированы в виде кластеров. На 5'-конце интегрированных форм ICEs обычно расположены гены резистентности к антибиотикам, З'-конец представлен 4 группами генов, ответственных за передачу, а также генами, кодирующими необходимые для регулирования переноса белки. ICEs не содержат генов, необходимых для автономной репликации [8]. Довольно значительное число кодирующих последовательностей ICEs функционально не аннотированы. Так, варианты SXT-элемента содержат 26 генов, предполагаемые продукты которых не имеют значительного сходства с известными последовательностями, представленными в базах данных (GenBank/DDBJ/EMBL), и 15 генов, функции которых неизвестны. Многие из этих гипотетических генов также объединены в кластеры [30].
Ген интегразы int локализован на 5'-конце интегрированных ICEs; интеграза обеспечивает встраивание и вырезание элемента по типу бактериофага X. В эле-
ментах семейства SXT/R391 ген int лежит в З'-области предполагаемого оперона, включающего 2 других гена, s002 и s003, делеция которых не оказывает влияния на передачу или вырезание SXT [26].
Гены резистентности к антибиотикам (сульфаме-токсазол, триметоприм, стрептомицин, хлорамфени-кол), чередующиеся с гомологичными известным генам транспозаз последовательностями (orfl, orf2 (tnpA), orfA), интегрированы в локус rumB, локализованный на 5'-конце SXT-элемента. Делеция всего региона, в том числе rumB и rumA (рис.2, Д1), не оказывает влияния на вырезание sXT и частоту его передачи, и, таким образом, предполагаемые транспозазы не играют заметной роли в передаче SXT [7].
Система конъюгативного переноса SXT сходна с таковыми у конъюгативной плазмиды R27 и у F-плазмид [32]. Область tra SXT локализована на З'-конце элемента и образована по крайней мере тремя предполагаемыми оперонами. Первый оперон (tral - s043) кодирует
Рис. 2. Структурная организация ICE семейства SXT/R391 (по [30]).
Предполагаемые ORF изображены стрелками, показывающими ориентацию. Оттенками серого выделены: гены транспозаз (tnp, tnpA, tnpB), гены устойчивости к антибиотикам (dfr18, floR, strB, strA, sulII), гены конъюгативного переноса (tral, traD, s043, traL, traE, s048, traB, traV, traA, traC, s056, traW, traU, traN), регуляторные гены (setC, setD), гомологи ORF фаговых геномов (s044, s045, s065, s066, s086, setR). ORF с неизвестной функцией указаны белым цветом. Черный прямоугольник соответствует положению начала переноса. Линиями помечены регионы элемента, выявленные в ходе делеционного анализа: Д1-2, Д7, Д11 - отсутствие изменений исходного фенотипа; Д3-6 - сохранение способности к мобилизации на перенос других элементов и отсутствие конъюгаци-онной передачи SXT; Д8-10, Д12 - отсутствие или значительное уменьшение частоты переноса SXT или других элементов; Д13-15 - утрата способности к переносу SXT или других элементов, утрата способности к вырезанию из хромосомы.
функции процессинга ДНК, в то время как два других оперона предположительно обеспечивают сборку пи-лей (traL - traN) и образование пар спаривания (traFtraG). Оперон, кодирующий сборку пилей, прерывается тремя генами (s052, s053, s054), которые отсутствуют у F-плазмид. Последовательности s052 и s053 имеют сходство с генами неизвестной функции Ti-плазмиды
А. tumefaciens, а s054 сходна с DsbC - дисульфидизомеразой [4]. Интересно, что tra-регионы плазмид, системы конъюгативного переноса которых наиболее схожи с SXT, также несут ортологи DsbC [32, 33].
Разнообразие и классификация ICEs
Сравнительной геномике ICEs посвящен веб-ресурс ICEBerg (http:// db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg) лаборатории молекулярной микробиологии Университета Jiao Tong (Шанхай, КНР). Существующая на сегодняшний день классификация ICEs основана на анализе степени гомологии генов интеграз и степени совпадения порядка расположения гомологичных кодирующих последовательностей (синтения). В соответствии с данной классификацией около 80% из известных ICEs (344 из 428) отнесено к 28 отдельным филогенетическим семействам (табл. 2), 6 из которых, наиболее представительных по числу входящих в них генетических элементов, были описаны относительно давно - SXT/R391, Tn916, Tn4371, ICEclc, CTnDOT/ERL и ICE6013. Остальные 22 семейства ICEs были сформированы на основе анализа in silico известных последовательностей геномов различных видов микроорганизмов, при этом 84 ICE пока не принадлежат ни к одному известному семейству, поскольку они либо имеют уникальные последовательности интеграз или других структурных компонентов, либо (в ряде случаев) сведений об их нукле-отидных последовательностях еще недостаточно для полноценных классификационных построений.
Как уже отмечалось в предыдущих разделах, семейство SXT/R391 является самым представительным по числу относящихся к нему ICEs. Генетические элементы данного типа были обнаружены в штаммах Vibrio cholerae различных серогрупп, у 5 других видов рода Vibrio, а также у некоторых представителей других родов (см. табл. 2). Сравнительный анализ геномов SXT/R391 ICEs демонстрирует, что данные элементы в большинстве являются мозаичными, сформировавшимися, по-видимому, в результате рекомбинации между различными «исходными» ICEs. Обширный набор основных генов, которые являются консервативными среди всех ICEs семейства SXT/R391, а также способность этих элементов формировать тандемные структуры делают такую возможность весьма вероятной. Таким образом, ICEs обеспечивают свое собственное разнообразие, а формирование рекомбинантных ICEs может дать новые мобильные элементы, несущие
новые комбинации генов, в том числе детерминант устойчивости к антибиотикам, расширяющие адаптивный потенциал бактериальных видов [28].
Семейство Tn916 ICEs [34] объединяет обширную группу интегративных конъюгативных элементов, распространенных в основном у грамположительных микроорганизмов, сходных по структуре с оригинальным Tn916. Структура ICEs данного семейства представлена 3 консервативными областями, включающими гены систем конъюгативного переноса, рекомбинации и регуляции транскрипции. Вариабельные регионы элементов семейства Tn916 могут нести различные вспомогательные гены, в частности детерминанты устойчивости к антимикробным соединениям. Tn916 ICEs способны как к конъюгативному переносу в клетки нового хозяина, так и к транспозиции в различные сайты внутри генома, являясь, по сути дела, конъюгативными транспозонами.
К семейству ICEs Tn4371 было предложено относить интегративные конъюгативные элементы, имеющие высокую степень гомологии интеграз с интегразой intTn4371, а также сходную структуру генных регионов, ответственных за конъюгативный перенос, интеграцию/ вырезание и регуляцию транскрипции [36]. Данные элементы были обнаружены у различных видов (см. табл. 2). В состав вариабельных регионов ICEs этого семейства часто входят гены систем эффлюкса различных токсических для клеток соединений, в частности ионов тяжелых металлов.
В состав семейства ICEclc [35] входят интегратив-ные элементы, имеющие интегразный ген, гомологичный intB13, детерминанты конъюгативного переноса и контроля вырезания/интеграции, а также многочисленные гены катаболизма, ответственные за утилизацию разнообразных органических субстратов, включая ароматические соединения, в частности гены деградации катехолов, аминофенолов и некоторых других субстанций. Элементы данного семейства выявлены у ряда видов (см. табл. 2).
Семейство CTnDOT/ERL включает ICEs с интеграза-ми, гомологичными интегразам intDOT. Элементы данного семейства описаны у различных видов Bacteroides [36]; интересно, что элементы семейства CTnDOT/ERL способны к конъюгативному переносу в интегрированном состоянии, фактически формируя Hfr-штаммы хозяина.
Семейство ICE6013 объединяет интегративные конъюгативные элементы Staphylococcus aureus, несущие инсерцию Tn552 и более десятка 0RF, включая сходную с IS30 DDE транспозазу и последовательности, гомологичные генам систем конъюгативного переноса других грамположительных микроорганизмов [37]. Следует отметить, что структуры семейства ICE6013 встречаются в клетках хозяев как в виде многочисленных копий в пределах хромосом, так и в виде внехромосомных циркулярных форм. Также отметим, что генетические элементы данного типа филогенетически довольно близки ICE-элементам семейства ICEBs1 Bacillus spp.
В заключение еще раз подчеркнем, что горизонтальный перенос генов играет фундаментальную роль в бактериальной эволюции, а разнообразные мобильные генетические элементы, включая ICEs, позволяют бактериальным видам приобретать новые фрагменты ДНК, кодирующие широкий спектр новых функций, способствуют поддержанию внутривидового генетического разнообразия и обеспечивают перенос генетического материала между различными видами и родами бактерий [20, 38]. Кроме обеспечения генетического разнообразия, конъюгационный перенос является основным
механизмом распространения устойчивости к антибиотикам [30]. Интегративные конъюгативные элементы могут быстро распространяться в популяциях бактерий, являясь мощными векторами для распространения генов резистентности [39]. Ранее считалось, что это их основная и практически единственная роль, но сейчас очевидно, что интегративные конъюгативные элементы могут быть посредниками в передаче самого разнообразного набора функций, позволяя видам бактерий быстро адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды и колонизировать новые экологические ниши.
Сведения об авторах:
Захарова Ирина Борисовна - канд.биол.наук, доц., зав. лаб. геномики и протеомики ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора;
Викторов Дмитрий Викторович - д-р биол. наук, доц., зам. дир. по научно-экспериментальной работе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, e-mail: [email protected]
ЛИТЕ РА Т У РА/REFERENCES
1. Wozniak R., Waldor M. Integrative and conjugative elements: mosaic mobile genetic elements enabling dynamic lateral gene flow. Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8: 552-63.
2. Burrus V., Waldor M. Shaping bacterial genomes with integrative and conjugative elements. Res. Microbiol. 2004; 155(5): 376-86.
3. Hastings P., Rosenberg S., Slack A. Antibiotic-induced lateral transfer of antibiotic resistance. Trends Microbiol. 2004; 12(9): 401-4.
4. Wozniak R., Fouts D., Spagnoletti M. et al. Comparative ICE genomics: insights into the evolution of the SXT/R391 family of ICEs. PLoS Genet. 2009; 5(12): e1000786. doi:10.1371/journal. pgen.1000786.
5. Ryan M., Pembroke J., Adley C. Novel Tn4371-ICE like element in Ralstonia pickettii and genome mining for comparative elements. BMC Microbiol. 2009; 9: 242. doi: 10.1186/1471-2180-9-242.
6. Burrus V., Pavlovic G., Decaris B., Guedon G. Conjugative transposons: the tip of the iceberg. Mol. Microbiol. 2002; 46(3): 601-10.
7. Hochhut B., Lotfi Y., Mazel D. et al. Molecular analysis of the antibiotic resistance gene clusters in the Vibrio cholerae 0139 and 01 SXT constins. Antimicrob. Agents Chemother. 2001; 45(11): 2991-3000.
8. Waldor M., Tschape H., Mekalanos J. A new type of conjugative transposon encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae 0139. J. Bacteriol. 1996; 178(14): 4157-65.
9. Burrus V., Marrero J., Waldor M. The current ICE age: biology and evolution of SXT-related integrating conjugative elements. Plasmid. 2006; 55(3): 173-83.
10. Ehara M., Nguyen B., Nguyen D. et al. Drug susceptibility and its genetic basis in epidemic Vibrio cholerae 01 in Vietnam. Epidemiol. Infect. 2004; 132(4): 595-600.
11. Iwanaga M., Toma C., Miyazato T. et al. Antibiotic resistance conferred by a class I integron and SXT constin in Vibrio cholerae 01 strains isolated in Laos. Antimicrob. Agents Chemother. 2004; 48(7): 2364-9.
12. Thungapathra M., Amita A., Sinha K. et al. 0ccurrence of antibiotic resistance gene cassettes aac(6')-Ib, dfrA5, dfrA12, and ereA2 in class I integrons in non-01, non-0139 Vibrio cholerae strains in India. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46(9): 2948-55.
13. Ahmed A., Shinoda S., Shimamoto T. A variant type of Vibrio cholerae SXT element in a multidrug-resistant strain of Vibrio fluvialis. FEMSMicrobiol. Lett. 2005; 242(2): 241-7.
14. Burrus V., Quezada-Calvillo R., Marrero J. et al. SXT-related integrating conjugative element in New World Vibrio cholera. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(4): 3054-7.
15. Dalsgaard A., Forslund A., Sandvang D. et al. Vibrio cholerae 01 outbreak isolates in Mozambique and South Africa in 1998 are multiple-drug resistant, contain the SXT element and the aadA2 gene located on class 1 integrons. J. Antimicrob. Chemother. 2001; 48: 827-38.
16. Rodríguez-Blanco A., Lemos M., Osorio C. Integrating conjugative elements as vectors of antibiotic, mercury, and quaternary ammonium compound resistance in marine aquaculture environments. An-timicrob Agents Chemother. 2012; 56(5): 2619-26.
17. Burrus V. Significance of the SXT/R391 family of integrating conjugative elements in Vibrio cholerae. In: Ramamurthy T., Bhattacha-rya S.K. Epidemiological and molecular aspects on cholera infectious disease. Springer; 2011: 161-84.
18. Osorio C.,Marrero J., Wozniak R. et al. Genomic and functional analysis of ICEPdaSpa1, a fish-pathogen-derived SXT related integrating conjugative element that can mobilize a virulence plasmid. J. Bacteriol. 2008; 190 (9): 3353-61.
19. Pembroke J., Piterina A. A novel ICE in the genome of Shewanella putrefaciens W3-18-1: comparison with the SXT/R391 ICE-like elements. FEMS Microbiol. Lett. 2006; 264 (1): 80-8.
20. Burrus V., Waldor M. Shaping bacterial genomes with integrative and conjugative elements. Res. Microbiol. 2004; 155 (5): 376-86.
21. Seth-Smith H., Fookes M., Okoro C. et al. Structure, diversity, and mobility of the Salmonella pathogenicity island 7 family of integra-tive and conjugative elements within Enterobacteriaceae. J. Bacteriol. 2012; 194(6): 1494-504.
22. Ghinet M., Bordeleau E., Beaudin J. et al. Uncovering the prevalence and diversity of integrating conjugative elements in Actinobacteria. Mob. Genet. Elements. 2012; 2(2): 119-24.
23. Beaber J., Waldor M. Identification of operators and promoters that control SXT conjugative transfer. J. Bacteriol. 2004; 186 (17): 5945-9.
24. Yokota T., Kuwahara S. Temperature-sensitive R plasmid obtained from naturally isolated drug-resistant Vibrio cholerae (biotype El Tor). Antimicrob. Agents Chemother. 1977; 11(1): 13-20.
25. Beaber J., Burrus V., Hochhut B., et al. Comparison of SXT and R391, two conjugative integrating elements: definition of a genetic backbone for the mobilization of resistance determinants. Cell. Mol. Life Sci. 2002; 59(12): 2065-70.
26. Hochhut B., Waldor M. Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC. Mol. Microbiol. 1999; 32(1): 99-110.
27. Marrero J., Waldor M. Interactions between inner membrane proteins in donor and recipient cells limit conjugal DNA transfer. Dev. Cell. 2005; 8(6): 963-70.
28. Ramamurthy T., Garg S., Sharma R. et al. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India. Lancet. 1993; 341(8846): 703-4.
29. Beaber J., Hochhut B., Waldor M. SOS response promotes horizontal dissemination of antibiotic resistance genes. Nature. 2004; 427(6969): 72-4.
30. Beaber J., Hochhut B., Waldor M. Genomic and functional analyses of SXT, an integrating antibiotic resistance gene transfer element derived from Vibrio cholera. J. Bacteriol. 2002; 184(15): 4259-69.
31. Bordeleau E., Brouillette E., Robichaud N., Burrus V. Beyond antibiotic resistance: integrating conjugative elements of the SXT/R391
family that encode novel diguanylate cyclases participate to c-di-GMP signalling in Vibrio cholerae. Environ. Microbiol. 2010; 12(2): 510-23.
32. Sherburne C., Lawley Т., Gilmour M. et al. The complete DNA sequence and analysis of R27, a large IncHI plasmid from Salmonella typhi that is temperature sensitive for transfer. Nucl. Acids Res. 2000; 28(10): 2177-86.
33. Garriss G., Waldor M., Burrus V. Mobile antibiotic resistance encoding elements promote their own diversity. PLoS Genet. 2009; 5(12): e1000775. doi:10.1371/journal.pgen.1000775.
34. Roberts A., Mullany P. A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements. Trends Microbiol. 2009; 17(6): 251-8.
35. Gaillard M., Vallaeys Т., Vorholter F. et al. The clc element of Pseudomonas sp. strain B13, a genomic island with various catabolic properties. J. Bacteriol. 2006; 188(5): 1999-2013.
36. Moon K., Sonnenburg J., Salyers A. Unexpected effect of a Bacteroi-des conjugative transposon, CTnDOT, on chromosomal gene expression in its bacterial host. Mol. Microbiol. 2007; 64(6): 1562-71.
37. Smyth D., Robinson D. Integrative and sequence characteristics of a novel genetic element, ICE6013, in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 2009; 191(19): 5964-75.
38. Frost L., Leplae R., Summers A., Toussaint A. Mobile genetic elements: the agents of open source evolution. Nat. Rev. Microbiol. 2005; 3(9): 722-32.
39. Mazel D., Dychinco B., Webb V., Davies J. Antibiotic resistance in the ECOR collection: integrons and identification of a novel aad gene. Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44(6): 1568-74.
Поступила 27.02.14 Received 27.02.14
CONJUGATIVE INTEGRATIVE ELEMENTS (ICEs) OF MICROORGANISMS
Zakharova I. B, Viktorov D. V.
Volgograd Anti-Plague Research Institute, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Volgograd, Russia
Integrative conjugative elements (ICEs) are an extensive group of mobile genetic elements found in the Gram-positive and Gram-negative bacteria. These genetic elements are replicated being incorporated into host chromosome, but retain the ability for excision and conjugative transfer. Given a set of the genes of the conjugative transfer, control of removal and integration, ICEs are directly involved in the processes of horizontal transfer of genetic determinants, which increase the adaptive potential of the bacterial species, as well as act as a mobilizing factor for other genetic elements. Key words: integrative conjugative elements; ICE; horizontal genetic transfer.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.862.1579.252
Маянский А.Н.1, Чеботарь И.В.2, Лазарева А.В.2, Маянский Н.А.2 ПНЕВМОКОККОВЫЕ БИОПЛЕНКИ
'ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России, 603005, Нижний Новгород, Россия; 2ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, 119991, Москва, Россия
Обзор посвящен обсуждению биопленочного процесса у пневмококков. Подчеркивается сложность изучения проблемы in vitro, которая связана со склонностью всех стрептококков к феномену генетической трансформации, когда значительная часть некомпетентных клеток подвергается разрушению. Показано, что практически все дикие штаммы пневмококка способны к формированию биопленок в том или ином масштабе. Наличие капсулы угнетает образование биопленок, и способность к их формированию имеет обратную зависимость с количеством капсульного материала.
Подчеркивается различие между фенотипом колоний инвазивных штаммов пневмококка и штаммов, обеспечивающих его перси-стенцию в носоглотке. Анализируется ряд вопросов, связанных с эффекторными и регуляторными факторами биопленочного пневмококкового процесса. Главным выводом, который следует из обзора, является положение о том, что биопленка необходима пневмококку лишь на стадии хронической персистенции.
Ключевые слова: Streptococcus pneumoniae; биопленка; пневмококковые инфекции.
Streptococcus pneumoniae (далее пневмококк) является одним из ведущих возбудителей среднего отита, пневмонии, сепсиса и менингита (прежде всего у детей). Принято считать, что глав-
Для корреспонденции: Маянский Николай Андреевич, e-mail: [email protected].
