CC BY
11
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются многообещающими кандидатами для клеточной терапии. Терапевтический потенциал МСК в отношении восстановления тканей и заживления ран основан не только на их паракринных эффектах, но и на продукции внеклеточного матрикса (ВКМ), регулирующего функциональную активность клеток. Однако потенциал регенерации с возрастом снижается. Одним из способов модуляции регуляторных функций МСК может быть применение геропротекторных цитокинов, таких как GDF11. Чтобы выяснить механизмы старения МСК, а также возможность модуляции свойств сенесцентных МСК цитокином GDF11, изучали протеомные изменения как самих клеток МСК, так и изменения ВКМ и се-кретируемых белков.
Сенесцентные МСК (линия ASC52telo) получали методом стресс-индуцированного старения с помощью ми-томицина С (МмС). Параллельно в аналогичных условиях культивировали МСК, не подвергшиеся воздействию МмС. Также на этом этапе к половине клеток в каждой группе добавляли рекомбинантный белок GDF11 (Abcam, США) в концентрации 10 нг/мл и культивировали в течение 10 дней. Затем отдельно анализировали белки клеток, белки кондиционированной среды (секретом), а также белки ВКМ, полученного путем децеллюляриза-ции. Протеомный анализ проводили методом жидкостной хроматографии — масс-спектрометрии на основе системы нано-ВэжХ Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США) и масс-спектрометра TimsTOF Pro (Bruker Daltonics, США).
У сенесцентных МСК в лизате выявлено повышение содержания белков, для которых характерно участие в ответе на стресс и тепловой шок, метаболизме белков, регуляции сигналинга апоптоза и др. процессах, регулируемых IL1B, CDKN1, ММР3, GDF15, PLAUR, FAS. Одновременно, снижались уровни белков, участвующих в митозе, экспрессии генов, процессинге РНК, метаболических процессах соединений азота и в регуляции внеклеточного матрикса.
В ВКМ и секретоме МмС+ клеток обнаружено повышенное содержание белков каскада комплемента и коагуляции (PAI1, PAI2, VTN, FGB, A2M), при этом снижены уровни коллагенов I и VI типов (COL1A1, COL1A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3), а также регуля-торные и адгезионные гликопротеины FBLN1, HTRA1, LGALS1, TGFBI. Особого внимания заслуживает отрицательный регулятор сигнального пути рецептора гормона роста — GDF15, уровень которого был повышен в образцах как лизата МСК, так и ВКМ и секретома МмС+ клеток.
Добавление в среду культивирования GDF11 приводило к повышению уровня фактора роста гепатомы (HDGF), а также активатора фактора роста гепатоцитов (HGFA) в клетках, а в секретоме увеличивался уровень простациклинсинтазы (PTGIS) — мощного медиатора вазодилатации и ингибитора агрегации тромбоцитов. Обнаруженные белки могут быть ключевыми регуляторами действия GDF1 1. В целом, GDF1 1 не оказывал влияния на белки, ассоциированные с клеточным старением. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 21-75-10117.
ИНТЕГРАЛЬНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ В ОЦЕНКЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПОКРЫТИЙ ИЗ ОКСИНИТРИДОВ ТИТАНА, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ РЕАКТИВНОГО МАГНЕТРОННОГО РАСПЫЛЕНИЯ
И.И. Ким1, 2, М.А. Суровцева1, 2, Н.А. Бондаренко1, 2, А.П. Лыков1, О.В. Повещенко1, 2, Е.В. Чепелева1, 2, И.Ю. Журавлева2, А.А. Алишевская3
1 НИИ клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия
2 ФГБУ НМИЦ им. академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России
3 ООО «НИЦ Биостатистики и Клинических исследований», Новосибирск, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: интегральный показатель, нитинол, оксинитрид титана, биосовместимость, NO, EA.hy926, жизнеспособность.
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности населения. Эффективным подходом к коррекции ИБС является коронарная ангиопластика, заключающаяся в установке стента. Большое распространение получили стенты с лекарственным покрытием. Однако в отдаленные сроки после их установки на фоне длительно развивающихся рестенозов формируются тромбы. В связи с этим в последнее время вырос интерес к биоинертным покрытиям из оксидов и оксинитридов титана. Титанооксидные пленки улучшают био- и гемосовместимость металлической подложки.
В данной работе изучали образцы с покрытиями TiON с различным соотношением N2 к O2, нанесенных с помощью реактивного магнетронного распыления на подложки из медицинского нитинола (NiTi, 8x8x0,5 мм), время экспозиции — 45 мин.: контроль (NiTi); № 1 (TiO2, U=-100 V); № 2 (TiO2, U=0); № 3 (Ti-O-N, U=-100 V, N/O — 1/1); № 4 (Ti-O-N, U=0, N/O — 1/1); № 5 (Ti-O-N, U=-100 V, N/O — 2/1) № 6 (Ti-O-N, U=0, N/O — 2/1); № 7 (Ti-O-N, U=-100 V, N/O — 3/1); № 8 (Ti-O-N, U=0, N/O — 3/1). Оценивали влияние этих покрытий на цитотоксич-ность, адгезию, жизнеспособность и продукцию NO клетками эндотелиальной линии EA.hy926. Цитотоксичность определяли в МТТ тесте после экспозиции образцов на клетках. Количество адгезированных клеток, живых и находящихся в фазах апоптоза и некроза, подсчитывали на 1 мм2 после окрашивания образцов с клетками акридинновым оранжевым и этидиум бромидом. Продукцию NO определяли с помощью реактива Грисса.
В результате было показано, что наименьшую цито-токсичность продемонстрировал образец № 2, наибольшую адгезию — образец № 4, наибольшую жизнеспособность — № 5, и наибольшую продукцию NO — образец № 8.
В связи с неоднозначностью полученных данных нами был введен интегральный показатель для определения наиболее биосовместимого покрытия. Для этого для каждой из 4 групп измеряемых показателей были установлены следующие пограничные значения и присвоены баллы: нижний допустимый уровень (0 баллов), приемлемый диапазон значений (1 балл), оптимальный уровень (2 балла). В каждой серии экспериментов каждому результату был присвоен соответствующий балл и было рассчитано среднее значение. Интегральный показатель рассчитывался для каждого покрытия по формуле:
II (integral indicator) = Mean score (MS, cytotoxity) + MS (adhesion) + MS (viability) + MS (NO production)
Максимальное значение интегрального показателя составляло 8 баллов, минимальное—0 баллов. Покрытие считалось оптимальным для использования при значении II не менее 4,8 баллов (60% значений во всех тестах выше оптимального уровня) и покрытие считалось приемлемым для использования при значении II не менее 3,2 баллов (80% значений во всех тестах выше допустимого уровня).
В результате определения интегрального показателя биосовместимости покрытий было показано, что наиболее оптимальным по функциональным свойствам для использования является образец № 2.
СОЗДАНИЕ ТКАНЕВОГО ЭКВИВАЛЕНТА ХРЯЩА НА ОСНОВЕ МАТРИЦЫ ИЗ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОГО МИКРОНИЗИРОВАННОГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА СВИНЬИ
А.Д. Кириллова, Ю.Б. Басок, А.М. Григорьев, Л.А. Кирсанова, Е.А. Немец, В.И. Севастьянов
ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. В.И. Шумаков» Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: децеллюляризация, микрочастицы, хрящевая ткань, тканевая инженерия.
Перспективным терапевтическим решением проблемы восстановления структуры и функций поврежденной хрящевой ткани являются технологии малоинвазивного внутрисуставного введения клеточно-инженерных конструкций (КИК), состоящих из биосовместимых матриц, клеток и биоактивных молекул. Многообещающими выглядят матрицы из децеллюляризованных тканей, способные не только удерживать клетки в месте повреждения хряща, но и обеспечивать им необходимые для жизнедеятельности условия [1]. Цель — разработать тканевой эквивалент хряща на основе тканеспецифической матрицы из децеллюляризованного микронизированно-го суставного хряща свиньи (ДМСХс). Материалы и методы. Были разработаны три способа децеллюляризации микрочастиц хряща со средним размером 161 ± 11 мкм. Способ 1—3 цикла замораживания/оттаивания (+37°С/-196°С), обработка поверхностно-активными веществами (ПАВ) (Triton X-100 и додецилсульфат натрия), инкубация в ДНКазе I типа; способ 2 — обработка ПАВ, инкубация в ДНКазе I типа, обработка в среде сверхкритического CO2 с добавлением 10% этанола; способ 3 — обработка ПАВ, обработка ультразвуком (УЗ), инкубация в ДНКазе I типа. Биохимический анализ тканеспецифических матриц включал определение содержания ДНК, гликозаминогликанов (ГАГ) и коллагена. Морфологию ДМСХс оценивали гистологическими методами окрашивания. Биологическую безопасность исследовали in vitro и in vivo. Функциональную активность in vitro определяли по способности матрицы поддерживать адгезию, пролиферацию и специфическую активность мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч). Результаты исследования. Децеллюляризация хрящевой ткани последовательно обработкой ПАВ, УЗ и ДНКазой I типа позволила достичь снижения количества ДНК на 95% с наибольшим сохранением ГАГ (37%) и коллагена (82%), по сравнению
с другими способами. В экспериментах in vitro и in vivo доказана биологическая безопасность матрицы из ДМСХс. На культуре МСК ЖТч показана способность матрицы поддерживать высокий уровень пролиферации и хон-дрогенную дифференцировку, проявляющуюся в способности клеток нарабатывать ГАГ и коллаген II типа. Выводы. Разработанный оптимальный способ получения тканеспецифической матрицы на основе ДМСХс дает возможность перейти к разработке технологий создания из КИК тканевых эквивалентов хряща для регенеративной медицины.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 21-15-00251, https:rscf.ru/ project/21-15-00251/.
Литература:
1. Sevastianov V.I., Basok Y.B., Kirsanova L.A. et al. Life (Basel).
2021. V. 11. № 8. P. 756.
КРИОХРАНЕНИЕ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ КАК
СПОСОБ СОХРАНИТЬ ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ХОНДРОЦИТОВ
ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТКАНЕИНЖЕРНЫХ
КОНСТРУКЦИЙ
Е.В. Киселева1, Е.В. Батухтина2 3, А.В. Люндуп2
1 ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия
2 Рооссийский университет дружбы народов, Москва, Россия
3 «SeedBio», Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: криоконсервация, хрящевая ткань, хон-
дроцит, хрящевой эквивалент.
Ограниченная способность хрящевой ткани к регенерации является проблемой при проведении реконструктивных операций лицевого скелета, верхних дыхательных путей, суставных поверхностей. Возможность выделять и культивировать in vitro хондроциты из биопсийного материала способствует развитию тканевой инженерии и клеточных технологий реконструкции хрящевой ткани. Однако при монослойном культивировании хондроциты человека быстро теряют свои фенотипические характеристики: снижается экспрессия хондрогенных генов, таких как коллаген 2 типа, аггрекан и др) и увеличивается экспрессия маркеров дедифференцировки (коллагена 1 и 3 типа и др), что является значительным ограничением для существующих регенеративных терапевтических подходов. Дедифференцированные хондроциты способны редифференцироваться, например, при культивировании в гипоксических и/или 3D условиях, и/или при использовании индукторов хондрогенной диффе-роенцировки (TGF-p, IGF, BMP-2 и др), но с увеличением времени культивирования эта способность значительно снижается. Мы исследовали возможность криоконсер-вации и длительного хранения биопсийного материала хрящевой ткани для сохранения фенотипических характеристик выделяемых хондроцитов и создания хрящевого эквивалента.
Хрящевую ткань делили на кусочки, которые подвергались криоконсервации и хранились при -80°С в течении 2, 4 и 6 мес. После хранения оценивали жизнеспособность хрящевой ткани, эффективность выделения хондроцитов в культуру, скорость роста и способность культивированных хондроцитов образовывать хрящевой эквивалент.
