CC BY
18
Актуальт проблеми сучасно! медицини
КЛ1Н1ЧНА МЕДИЦИНА
УДК 617.586-002.44:616.379-008.64]:611-018.53
INOS МОНОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ЗАЖИВЛЕНИИ РАН У БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ
Баринова М.Э.
Донецкий национальный медицинский университет им. М.Горького
Цель работы - проанализировать динамику активности iNOS моноцитов во время заживления ран при условиях синдрома диабетической стопы (СДС). Исследование продукции NO моноцитами проведено in vitro у 14 больных на момент поступления в стационар, а также через 3-5, 10-14 и 18-24 сутки после начала лечения. На момент госпитализации выявленно увеличение базальной активности iNOS и снижение ЛПС-зависимой стимуляции фермента. Повышение активности iNOS через 3-5 дней после начала лечения сопровождалось решением воспаления в ране, а через 10-14 дней (в период развития грануляций) - снижалась. Завершение раневого процесса сопровождалось ростом базальной активности iNOS относительно показателя у здоровых людей.
Ключевые слова ¡NOS, моноцит, рана, диабетическая стопа Эффективность течения процесса заживления во многом определяется параметрами, регулирующими его фазность [5]. Последняя заключается в последовательном включении различных морфогенетических процессов с участием разных клеточных популяций под контролем широкого спектра регуляторов [8]. Ключевыми участниками и регуляторами раневого процесса являются моноциты-макрофаги. Им отводится важная роль не только в детерминации параметров воспаления, но и в «переключении» разных фаз раневого процесса [9]. Нарушение функции этих клеток считается причиной развития хронического воспаления, длительно незаживающих (хронических) ран и дизрегенератор-ного синдрома, имеющего место при осложненном течении сахарного диабета [4]. Это определяет интерес к функционированию моноцитов-макрофагов при СД. Однако анализ полученных на сегодняшний день фактов осложнен многофакторностью регуляции активности моноцитов-макрофагов и широким спектром продуцируемых молекул, что усложняет диагностику и интерпретацию функционального состояния данных клеток. Выход из ситуации видится в анализе in vitro динамики активности iNOS. Данный выбор обусловлен тем, что NO обладает мощным микробицидным эффектом и считается важным регулятором процесса заживления [7].
Кроме того, активация экспрессии iNOS является следствием стимуляции бактериальным ли-пополисахаридом (ППС), индукции МАР-киназ и NF-kB, отражая интенсивность провоспалитель-ной активации: стимуляция iNOS сопровождается изменением продукции ряда провоспали-тельных цитокинов и фагоцитарной активности [4, 10]. Следовательно, выяснение динамики активности данного фермента в ходе раневого процесса при СДС позволит выяснить механизмы нарушения пространственно-хронологической программы заживления ран кожи.
Материал и методы исследования.
Проанализированы результаты лечения гнойно-некротического поражения нижних конечностей у 22 больных сахарным диабетом II типа со смешанной формой синдрома диабетической стопы. Обследовано 10 мужчин и 12 женщин, возраст больных варьировал от 46 до 72 лет. Длительность заболевания СД составила 10,5±3,2 года. Консервативное лечение проводили с использованием общепринятых методов [8]. У 14 (63,6%) пациентов вскрытие флегмоны с последующим иссечением нежизнеспособных тканей способствовало заживлению раны в течение 18-24 дней. Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев сходного возраста. При поступлении пациента в хирургическое
* Работа выполнена в рамках НИР «Вивчити роль внутршньоштинних сигнальних систем nid час реал/зацП' запально-репаративних процеав в органах, що забезпечують гомеостаз организму» (№ держреестрацп 0106U01840)
BÍCHHK Украгнсъког медичног стожатологЬчног академи
отделение, а также через 1-3 суток, 10-14 суток и 1 месяц из периферической крови методом градиентного центрифугирования (Histopaque, р =1,077г/см3) выделяли мононуклеарные клетки. Их отмывали забуференным изотоническим раствором NaCl и ресуспендировали в бессывороточной культуральной среде RPMI 1640 (ICN) [2]. Последняя содержала 80 мкг/мл гентамици-на, 2мМ L-глутамина и 10мМ HEPES. Прилипшие к пластику мононуклеарные клетки выделяли после 3-х часовой инкубации в луночном планшете («Flow Lab») с использованием С02-инкубатора. Надосадочную жидкость удаляли, лунки промывали два раза бессывороточной средой RPMI 1640. Клетки из расчета 106 на лунку помещали в 96-луночный планшет в 200 мкл среды RPMI-1640 с указанными выше добавками и 5% эмбриональной телячьей сыворотки. В I серии продукцию NO моноцитами исследовали по следующей схеме: в 1-й лунке клетки стимулировали липосахаридом (ЛПС 0,3 мкг/мл; E.coli фирмы "Calbiochem", США); в контрольной - проводили инкубацию моноцитов без добавления ЛПС. В 3-ю и 4-ю лунки вводили стимулятор и ингибитор iNOS соответственно L-аргинин- 200 мкМ и Аминогуанидин (АГ) -150 мкМ. После инкубации в течение 24ч при 37°С в атмосфере 5% С02 анализировали продукцию NO макрофагами по накоплению в культуральной среде нитрит-ионов NO2-. Для этого 100 мкл культуральной среды переносили в лунку 96 луночного планшета и последовательно добавляли 100 мкл 1,5% раствора сульфониламида в 1 нормальной HCL, затем 100 мкл 0,15% раствора ^(1нафтил)этилендиамина в H20. Инкубацию проводили 15-30 мин при комнатной температуре и анализировали оптическую плотность при 540-570нм на СФ-46. Полученные результаты обрабатывали статистически [1].
Результаты исследования и их обсуждение.
Стандартная доза ЛПС (0,3 мкг/мл) in vitro вызывала увеличение продукции NO моноцитами здоровых лиц (на 64,1%; p<0,01) по сравнению с контрольным (без стимуляции) уровнем. Добавление в инкубационную среду L-аргинина продемонстрировало еще более значительное повышение синтеза NO (в 2,11 раза по сравнению с контролем; p<0,001), что может рассматриваться как критерий высокой резервной мощности iNOS в моноцитах здоровых людей. Аминогуанидин подавлял синтез NO на 47,1% (p<0,01) по сравнению с контролем). Данная величина отражает степень реальной активности фермента у здоровых людей. Причем разница между абсолютными величинами продукции NO при инкубации моноцитов с L-аргинином и ЛПС (Д 26,1 нмоль NO^/мл на 106 клеток) свидетельствует о степени участия бактериальной ЛПС в интенсификации резервной мощности iNOS и степени ЛПС-независимой стимуляции фермента.
У больных СДС при поступлении в стационар отмечено повышение фоновой продукции N0 на 22,99% по сравнению с контролем (р<0,01). Однако при стимуляции ЛПС прирост активности iN0S составил лишь 6,16% (р<0,05), причем абсолютный показатель ЛПС-стимулированной продукции N0 оказался на 20,41% ниже (р<0,01), чем у здоровых людей. Данный факт может быть отражением снижения роли бактериального ЛПС в регуляции активности фермента. При этом отмечалось снижение резервной мощности iN0S на 13,18% по сравнению с контролем (р<0,05): добавлении в среду Ь-аргинина стимулировало продукцию N0 на 51,18% (р<0,01) по отношению к фоновому уровню (тогда как в контроле этот показатель возрастал более, чем в 2 раза).
Через 3-5 сут отмечен достоверный прирост фоновой продукции N0 моноцитами на 22,59% по сравнению с предыдущим сроком (р<0,01). Данный показатель был на 50,79% выше, чем у здоровых людей (р<0,01). Этот было обусловлен повышением реальной активности iN0S: использованием АГ вело к подавлению продукции N0 моноцитами на 69,68% (р<0,01). При этом ЛПС-зависимый механизм активации iN0s по-прежнему играл незначительную роль: продукция оксида азота изменялась лишь на 17,52% (р<0,05). При этом резервная мощность iN0S была более, чем в 2,5 раза выше (р<0,001): использование Ь-аргинина стимулировало продукцию оксида азота на 42,48% (р<0,01). Данный факт свидетельствует о превалировании ЛПС-независимого пути регуляции активности фермента.
Изучение No-пpoдyциpyющeй способности моноцитов через 10-14 суток у больных СДС выявило снижение экспрессии и активности iN0S. Так, фоновая продукция N0 снизилась на 38,11% по сравнению с предыдущим сроком исследования и оказалась достоверно ниже контроля (на 6,68%; р<0,05). Подтверждением уменьшения активности фермента был результат инкубации моноцитов с АГ: амплитуда его эффекта снизилась на 20,78% (р<0,01) по сравнению с предыдущим сроком исследования. Использование Ь-аргинина вело к стимуляции продукции оксида азота на 74,62% по сравнению с фоном (р<0,01). Однако при этом суммарная величина резервной мощности фермента была на 23% ниже контроля (р<0,01), что может свидетельствовать о суммарном угнетении генетически детерминированной экспрессии iN0S. Парадоксально, что в этих условиях зарегистрировано усиление ЛПС-зависимого механизма регуляции фермента: добавление в инкубационную среду бактериального ЛПС повышало продукцию N0 на 40,47% по сравнению с фоном (р<0,01), хотя абсолютное значение данного эффекта было 20,09% ниже нормы (р<0,05).
К моменту завершения раневого процесса (через 18-24 дня после начала лечения) отме-
Актуальн проблеми сучасно! медицини
чена тенденция к нормализации синтеза N0. Так, фоновая активность продукции оксида азота повысилась на 16,43% (р<0,05), по сравнению с предыдущим сроком исследования, и была на 8,65% выше таковой у здоровых людей (р<0,05). Возросли значения ЛПС-стимулированной продукции N0 и резервной мощности iN0S - соответственно на 20,06% и 7,09% по сравнению с предыдущим сроком исследования (р<0,05). При этом прирост продукции N0 на фоне стимуляции моноцитов бактериальным ЛПС составлял 44,85% (р<0,01), тогда как у здоровых людей отмечена более выраженная разница - подъем продукции N0 составлял 64,07% (р<0,01). Эти данные с одной стороны свидетельствуют о частичном восстановлении чувствительности к ЛПС вероятно вследствие проводимой антибактериальной терапии. С другой - сохранение повышенной активности iN0s при снижении реакции на ЛПС отражает пролонгирование воспаления в коже и наличие относительной толерантности к факторам бактериальной агрессии. Пониженная резервная возможность iN0S, судя по амплитуде эффекта Ь-аргинина, была на 19,16% ниже, чем в контроле (р<0,05), может ограничивать эффективность защитной реакции на действие повреждающих факторов внешней среды.
Повышение экспрессии iN0S при воспалении в коже является важным защитным механизмом, обеспечивающим гиперпродукцию N0 и супероксиданион-радикапа (02-). Образование активированных кислородных метаболитов (02-, Н202, ОН-радикала, синглетного кислорода, N0-радикала, пероксирадикалов) играет ключевую роль в развитии окислительного стресса [5]. N0 в высоких концентрациях оказывает прямое ци-тотоксическое и иммуногенное действие за счет пероксинитрит-опосредованного повреждения ДНК и ингибирования функции многих ферментов [3]. Это с одной стороны, обеспечивает мощный бактерицидный эффект, но с другой -является фактором эндогенной агрессии и выраженной альтерации тканей. Последний фактор при СДС может играть решающую роль в развитии прогрессирующего гнойно-некротического поражения нижних конечностей.
Полученные в работе факты позволят ответить на вопрос о причинах ограничения гиперпродукции оксида азота при СДС в условиях воспаления. С нашей точки зрения, это обусловлено длительной, но слабой по амплитуде активацией iN0S, вероятно за счет длительной персистенции микробного фактора и формирования толерантности к ЛПС. Отмеченная к 3-5 суткам стимуляция активности фермента, вероятно, отражает эффективность проводимого лечения. Суть данной реакции заключается в стимуляции воспаления с целью очищения раны. Ведь изначально, активация iN0S является результатом стресс-реакции - защитным механизмом, который активируется в моноцитах, чтобы
противостоять действию токсических эффектов и направленный на элиминацию поврежденных структур [7]. Таким образом, в условиях хронического раневого процесса эффективность терапии на ранних этапах может проявляется стимуляцией острой воспалительной реакции (провоспалительной активности моноцитов). Но при этом нельзя забывать, что данный феномен сопровождается вторичной альтерацией тканей кожи [9]. В связи с этим изменение активности iN0S и механизмов ее регуляции в ходе воспа-лительно-репаративного процесса по сути отражает эффективность регуляторной функции моноцитов-макрофагов, или же превалирование моноцитов с провоспалительной и антивоспалительной активностью, стресс ответом и апопто-зом клеток. Интересно, что продуцируемый N0, продуцируемый макрофагами, защищает последние от ЛПС-индуцированного апоптоза [10]. Этот механизм может являться компонентом ау-токринной защиты макрофагов в очаге воспаления.
Интересным представляется факт снижения активности iN0S через 10-14 суток, поскольку в данный срок отмечено развитие грануляций в области раневого дефекта. Вероятно ингибиро-вание продукции оксида азота моноцитами отражает снижение их провоспалительной и активацию регуляторной функции, направленной на смену клеточных популяций в ране [9]. В интерпретации данного изменения активности iN0S важно помнить о существовании альтернативного пути метаболизма аргинина, участвующего в продукции межклеточного вещества, в частности в фибриллогенезе, который активируется при образовании грануляционной ткани [3, 6]. С этой позиции, динамика активности iN0S в течение 2-й недели может быть критерием прогнозирования течения раневого процесса.
Важно подчеркнуть, что завершение эпители-зации раневого дефекта и ремоделирование кожи в области раны сопровождалось повышением продукции N0 моноцитами. Данный факт вряд ли можно оценить однозначно. С одной стороны повышение синтеза N0 моноцитами может быть компенсаторной реакцией, направленной на поддержание суммарного тканевого пула регулятора в условиях сохраняющейся ин-сулинорезистентности и эндотелиальной дисфункции [7]. С другой - учитывая механизмы активации iN0S, отмеченная картина отражает недостаточную эффективность барьерных свойств кожи и пролонгирование воспалительного процесса [9].
Таким образом, в ходе раневого процесса при СДС, активность iN0S повышается через 3-5 дней после начала лечения, что сопровождается разрешением воспаления в ране, и уменьшается через 10-14 дней - в период развития грануляций. На момент завершения раневого имеет место повышение реальной активности iN0S при снижении ее резервной мощности.
BÎCHHK Украгнсъког медичног cm оматолог in ног' академИ'
Перспективы дальнейших исследований.
Динамика активности и механизмы регуляции экспрессии iNOS могут использоваться для разработки критериев прогнозирования и способов управления течением раневого процесса.
Литература
1. Лях Ю.Е. Основы компьютерной биостатистики.- Д., 2006.- 211 с.
2. Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитарных клеток при оценке иммунного статуса человека. Л., 1986
3. Curran J.N., Winter D.C., Bouchier-Hayes D. Biological fate and clinincal implications of arginine metabolism in tissue healing // Wound repare and regeneration.-2006.- Vol. 14.-P. 376-386.
4. Dinh T.L. Review of the mechanisms implicated in the pathogenesis of the diabetic foot // Int. J. Low Extrem. Wounds.- 2005, № 4.- P. 154 -159.
5. Lobmann R., Schultz G., Molecular fundamentals of wound healing in diabetic foot syndrome // Med. Klin.- 2003.- Vol. 98.- P.292 -301.
6. Kampfer H., Pfeilschifter J., Frank S. Expression and activity of arginase isoenzymes during normal and diabetes-impaired skin repair // J. Invest. Dermatol.- 2003.- Vol. 121, № 6.- P. 1544-1551.
7. Nagareddy P.R., Xia Z.,McNeil J.H.Increased expression of iNOS is associated with endoyjelialdysfunction and impaired pressorresponsiveness in streptozotocin-induced diabetes // Am. J. Physiol. Heart Cir4c. Physiol.- 2005.- Vol. 289.-H2144-2152.
8. Sweitzer S.M. What is the future of diabetic wound care? // Diab. Educ. - 2006.- Vol. 32, №.- P. 197-210.
9. Telgenhoff D., Shroot B.Cellular seneccence mechanisms in chronic wound healing // Cell Death and differentiation.-2005.- Vol. 12.-P. 695-698.
10. Vane J.R., Mitchell J.A., Tomlinson A. Inducible isoform of cyclooxigenase and nitric oxide synthase in inflammation //Proc Natl. Acad. Sci.- 1994.-Vol. 91.- P. 2046-2050.
Реферат
iNOS МОНОЦИТ1В KPOBI ПРИ ЗАГОеНН1 РАН У ХВОРИХ 13 СИНДРОМОМ Д1АБЕТИЧН01 стопи Баршова М.Е.
Ключевые слова: iNOS, моноцит, рана, диабетична стопа
Цть роботи - проаналЬувати динамку активност1 iNOS моноцитш nifl час загоення ран за умов синдрому д1абетичноТ стопи (СДС). Дослщження продукци N0 моноцитами проведене in vitro у 14 хворих на момент надходження в стацюнар, а також через 3-5, 10-14 i 18-24 доби пюля початку лкування. На момент гостталЬацп виявлене збтьшення базальноТ активное^ iNOS i зниження ЛПС-залежноТ стимуляцп ферменту. Пщвищення активное^ iNOS через 3-5 днш пюля початку лкування супроводжувалося виршенням запалення в paHi, а через 10-14 днш (у перюд розвитку грануляцш) - знижувалася. Завершения ранового процесу супроводжувалося зростанням базальноТ активное^ iNOS в1дносно показника у здорових людей.
Summary
BLOOD MONOCYTES iNOS DURING WOUND HEALING IN PATIENTS WITH DIABETIC FOOT Barinova M.E.
Key words: iNOS, monocyte, wound, diabetic foot
The aim of this work was to analyze dynamic of monocytes iNOS activity during diabetic wound healing. The intensity of NO production by monocytes was estimated in vitro in 14 patients with diabetic foot at the hospitalization, and at 3-5, 10-14 и 18-24 days after treatment. Initially the enhancement of basal activity of iNOS and decrease of LPS-dependent stimulation of enzyme were detected. After 3-5 days of treatment increase of iNOS activity was associated with inflammatory reaction release, but at 10-14 day (during granulation development) it decreased. Final healing in diabetic patients was accompanied with rising of iNOS basal activity to level higher than in health persons.
