CC BY
173
УДК 636.2.57.089.38
ИННОВАЦИОННЫЕ ЭМБРИОТЕХНОЛОГИИ В РЕПРОДУКЦИИ ЖИВОТНЫХ: ОТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ К ПРАКТИКЕ
Т.И. КУЗЬМИНА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных
Х. ТОРНЕР, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Х. АЛЬМ, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Институт биологии сельскохозяйственных животных (Думмерсторф, Германия)
E-mail:[email protected]
Резюме. Показана эффективность применения прижизненного красителя бриллиантового кристаллического голубого для оценки качества исходной популяции донорских ооцитов коров, используемых в клеточных технологиях репродукции.
Ключевые слова: клеточные технологии репродукции, ооциты, эмбрионы, оплодотворение in vitro, ВСВ-тест.
Успехи развития эмбриотехнологий за последнее десятилетие несомненны. Получение эмбрионов in vitro, трансплантация генотипированных и сексированных эмбрионов, клонирование, трансгенез, создание банков женских гамет, линий эмбриональных стволовых клеток - все эти достижения основаны на решении ряда фундаментальных вопросов репродуктивной биологии [1,2,3]. В основе совершенствования технологических аспектов клеточных репродуктивных технологий стоит вопрос о качестве исходного материала - компетентности к развитию донорских ооцитов животных. Проблема формирования зрелой яйцеклетки, способной к дальнейшему развитию - созреванию, оплодотворению и образованию эмбриона, по-прежнему актуальный вопрос биологии развития, решение которого позволит проводить коррекцию мейотического дозревания ооцитов и раннего эмбрионального развития in vitro.
Цель представленного исследования - идентификация факторов, вовлеченных в процесс созревания in vitro ооцитов коров, детерминирующих формирование из них биологически полноценных доимплантационных эмбрионов и разработка морфофункционального теста прогнозирования качества ооцитов для использования в клеточной и генетической инженерии.
Условия, материалы и методы. Объект исследования ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из антральных фолликулов яичников коров и половозрелых телок голштинской породы, а также до-имплантационные эмбрионы коров.
Отбор ооцит-кумулюсных комплексов для экспериментов проводили с использованием общепринятых критериев. Базовой средой для дозревания ооцитов коров служила ТС-199 (Sigma) с добавлением 10 % бычьей сыворотки (Ин-
66 -------------------------
ститут биологии сельскохозяйственных животных, Дум-мерсторф). В экспериментальных группах использовали систему кокультивирования клеток гранулезы с добавлением 50 нг/мл пролактина (Институт химии гормонов, Москва). Режим культивирования и оплодотворение ооцитов in vitro, культивирование доимплантационных эмбрионов соответствовал методическим рекомендациям [4]. Уровень апоптозов в эмбрионах на разных стадиях развития (от 8-ми до 32-х клеточных) определяли методом TUNEL [10].
Мониторинг исходной популяции донорских ооцитов коров для прогнозирования их потенций к дальнейшему созревания и оплодотворению in vitro проводили на основе использования маркера активности глюкозо-6-фос-фат-дегидрогеназы (G6PPH) - ВСВ (brillant cresyl blue -бриллиантовый кристаллический голубой), с помощью которого можно тестировать растущие и завершившие стадию роста ооциты. Фермент G6PDH активен в растущих ооцитах, а в клетках завершивших стадию роста его активность снижается [5]. Тест основан на способности G6PDH конвертировать окраску BCB из голубой в бесцветную в растущих ооцитах, тогда как в цитоплазме ооцитов завершивших стадию роста она не меняется [6].
Второй этап многоступенчатой технологии получения зрелой яйцеклетки in vitro - ее культивирование в синтетических питательных средах. Моделирование состава сред, адекватно отражающих условия созревания ооци-та, - важная задача эмбриотехнолога.
В интрафолликулярное созревание ооцита вовлечен ряд факторов, реализующих свои эффекты, в соответствии с полигенно-каскадным контролем реинициации мейоза, его завершения и овуляции зрелой яйцеклетки. Компетенцию к развитию нормальных зародышей на доимплантационных стадиях ооцит приобретает во время роста и созревания в фолликуле, в тесном контакте с окружающими его структурными элементами - грануле-зой, кумулюсом. Созревание ооцита - комплексный процесс преобразований хроматина и цитоплазматических изменений. В связи с этим, изучение потенций к развитию ооцитов, подвергшихся ВСВ-диагностике, подразумевает, в первую очередь, оценку состояния хроматина культивируемых клеток.
При раннем развитии эмбрионов коров часто наблюдается их дегенерация, особенно это касается зародышей из экстракорпорально созревших и оплодотворенных ооцитов. Среди возможных причин аномалий следует отметить апоптоз, дегенерацию хромосом и низкий
Таблица 1. Развитие доимплантационных эмбрионов коров, полученных при оплодотворении ВСВ(+) или ВСВ(-) ооцитов in vitro
ВСВ Число S...16 кле- Бласто-
Группа эксперимента ооци- точные эм- сто-
тест тов, n брионы, n (%) цисты, n (%)
ТС199+10 % бычьей сыворотки + 10 кле- + 141 89(63) 19(21)с
ток/мл гранулезы - 137 66(48)а 3 (5)й
ТС199+10 % бычьей сыворотки + 106 кле- + 133 101(76)ь 38(з8)е
ток/мл гранулезы+50 нг/мл пролактина__________-______139_______87(63)______17(20)'
Достоверность различий сравниваемых значений (критерий х-квадрат): а, ь р<0,001; с,
“ р<0,001; °,е р<0,001; ", е р<0,001; ", ' р<0,003; е, ' р<0,001
______________________________ Достижения науки и техники АПК, №04-2010
Таблица 2. Апоптоз в ядрах бластомеров эмбрионов коров, полученных при оплодотворении ВСВ(+) или ВСВ(-) ооцитов in vitro
Группа эксперимента ВСВ тест Число 8...32клеточных эмбрионов
всего, п нормальных, п (%) в состоянии апоптоза, п (Уо)
ТС 199+10%бычьей сыворотки + 10ькле- + 61 39(64) 22(36)
ток/мл гранулезы - 49 24(49)а 25(51)
ТС 199+10% бычьей сыворотки + 106 кле- + 69 53(77)'° 16(23)
ток/мл гранулезы+50 нг/мл пролактина - 51 31(61) 20(39)
Достоверность различия сравниваемых значений (критерий х-квадрат): а Ь р<0,01
уровень метаболизма. При сравнительном анализе уровня апоптозов в доимплантационных эмбрионах, полученных in vivo и in vitro, обнаружено, что у зародышей на стадии морулы нет достоверных различий между исследуемыми группами по доле клеток, находящихся в состоянии апоптоза. Однако при оценке апоптозных изменений в бластомерах бластоцист, отмечен высокий уровень апоптозов в группе зародышей, развившихся из ооцитов, созревших и оплодотворенных вне организма. Он был достоверно выше, чем у эмбрионов на такой же стадии, вымытых из живых доноров [7]. Выявленные ранее положительные эффекты гипофизарного бычьего п рол актина на получение биологически полноценных эмбрионов коров in vitro, снижение уровня апоптозов в соматических клетках овариальных фолликулов (гранулеза, кумулюс), определили наш выбор в использовании этого гормона в качестве добавки к среде культивирования [8,9].
Важный показатель потенций к развитию эмбрионов, полученных in vitro, - число клеток в зародышах на стадии бластоцисты. В заключительной серии экспериментов по диагностике исходной популяции донорских ооцитов с использованием ВСВ-теста мы оценили число ядер в бластомерах бластоцист (день 7), полученных из предварительно тестированных ооцитов.
Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерии у?, Стью-дента (Лакин, 1990) с помощью статистической программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: р<0,05; р<0,01; р<0,001.
Результаты и обсуждение. В ходе исследований мы установили гетерогенность исходной популяции ооцитов коров, выделенных из фолликулов разного диаметра, по ВСВ-тесту. Доля ВСВ(+) ооцитов в фолликулах диаметром меньше 3,3.. .5 мм и более 5 мм составила - 58,79 и 70 %, соответственно. Логично, предположить, что для ооцитов, не закончивших рост, нужны иные системы дозревания, а также режимы культивирования и, вероятно, пролонгация культивирования. Использование ВСВ-теста для стандартизации исходной популяции ооцитов позволяет проводить индивидуальную оценку женской гаметы, что значительно повышает эффективность отбора ооцитов перспективных для дальнейшего культивирования.
После 24 часов культивирования достоверных различий по количеству ооцитов, не реинициировавших мейоз не обнаружено. Однако ВСВ(-) ооциты показали низкую потенцию к развитию. Так, лишь 51 % из них за это время завершили ядерное созревание. При этом 27 % яйцеклеток имели дегенерированный хроматин на разных стадиях мейотического дозревания (диакинез, метафаза-1, анафаза). Кроме того, мы установили положительное влияние пролактина на снижение уровня дегенераций хро-
матина в ВСВ (+) ооцитах, по сравнению с величиной этого показателя в ВСВ(-) ооцитах (9 % против 27 %, р <0,05).
При оплодотворении ВСВ(+) и ВСВ(-) ооцитов самые высокие (76%) показатели развития эмбрионов до стадии 8... 16 клеток отмечены в варианте с ВСВ(+) ооци-тами, созревшими совместно с пролактином (табл. 1). И, как следствие, в этой же группе получено наибольшее число эмбрионов на стадии бластоцисты - (38 % против 5...21 %, р<0,001).
Доля 8...32 клеточных эмбрионов с бластомерами в состоянии апоптоза, после оплодотворения в группе ВСВ(+) ооцитов, созревших совместно с пролактином составила 23 % (табл.2 ), ВСВ(-) ооцитов, созревших без этого гормона - 51 % (р<0,01).
В бластоцистах коров, развившихся из ВСВ(+) ооцитов, число ядер (табл. 3) было значительно выше, чем в зародышах, полученных из ВСВ(-) ооцитов (106±1,12 и 113±0,44 против 51 ±1,8 и 106±0,6 соответственно р<0,01). Одновременно, установлено что введение в среду куль-
тивирования ВСВ(-) ооцитов 50 нг/мл пролактина спо-
Таблица 3. Число ядер в бластоцистах коров, полученных при оплодотворении in vitro ВСВ(+) и ВСВ(-) ооцитов (количество эмбрионов - 68)
Группа эксперимента ВСВ тест Число ядер в бластоцистах
ТС 199+10% бычьей сыворотки + 106 клеток/мл гранулезы ТС 199+10% бычьей сыворотки + 106 клеток/мл гранулезы + 50 нг/мл пролактина + 106±1,12а 51±1,8° + 113±0,44с 106±0,6d
Достоверность различия сравниваемых значений аЬ; а,с; Ь,с; ЬД с,0 р<0,01 (критерий СтЬЮДвНТЭ)
собствует увеличению количества ядер в полученных из них бластоцистах (с 51 ±1,8 до 106±0,6 р<0,01).
Более того, выход клонированных эмбрионов коров на стадии бластоцисты после пересадки соматических ядер ушного эпителия быка в ВСВ(+) ооциты составил 39 %, в ВСВ(-) ооциты - лишь 4 % (р< 0,05). Именно после пересадки клонированного эмбриона из ВСВ(+) ооцита было получено жизнеспособное потомство.
Выводы. В целом, результаты исследований свидетельствуют о высокой эффективности использования ВСВ-теста для раннего прогнозирования проспективных потенций исходной популяции ооцитов коров к экстракорпоральному созреванию, оплодотворению и формированию из них эмбрионов. Учитывая то, что женские гаметы животных используются в клеточных технологиях репродукции (программы экстракорпорального оплодотворения, соматическое и репродуктивное клонирование, трансгенез, получение химер, эмбриональных стволовых клеток, партеногенез), создания криобанков с целью сохранения генофонда элитных пород и исчезающих видов животных, наличие в достаточном количестве донорских ооцитов и разработка эффективных тестов их мор-фофункционапьного состояния будет способствовать интенсификации внедрения достижений эмбриотехнологий в практику.
Литература.
1. Н. Niemann, W. Kues, J.W. Carnwath. Transgenic farm animals: Current status and perspectives for agriculture and biomedicine. In: Engelhard M, Hagen K, Boysen M Genetic engineering in livestock - New applications and interdisciplinary Достижения науки и техники АПК, №04-2010 -------------------------------------------- 67
perspectives - Ethics of Science and Technology Assessment. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, pp. 1-30 2008
2. R.R.Sakai, K. L., K.Tamashiro, Y.Yamazaki, R.Yanagimachi. Cloning and assisted reproductive techniques: Influence on early development and adult phenotype // Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. - Jun 2005. - V. 75. - N. 2. -P. 151-162.
3. P. M.Chavatte-Palmer, Y.Heyman, C.Richard, C.Urien, J.-P.Renard, I.Schwartz-Cornil. The Immune Status of Bovine Somatic Clones // Cloning and Stem Cells. - 2009. - V. 11. - N. 2. -P. 309-318.
4. Кузьмнна Т.И., В.А. Багиров, А.В. Егиазарян, Х.Альм, Х.Торнер Биотехнология получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Санкт-Петербург-Пушкин, 2009, 44 С.
5. Rodriguez-Gonzalez, E., Lopez-Bejar, M., Velilla, E. & Paramio, M. T. (2002) Selection of prepubertal goat oocytes using the brilliant cresyl blue test. Theriogenology, 57, 1397-1409.
6. Bhojwani S, Alm H, Torner H, KanitzW, Poehland R. Selection of developmentally competent oocytes through brilliant cresyl blue stain enhances blastocyst development rate after bovine nuclear transfer// Theriogenology. - 2007. - V. 67. - P. 341-5.
7. Jakob O. Gjшrret, Hiemke M. Knijn, Steph J. Dieleman, Birthe Avery, Lars-Inge Larsson and Poul Maddox-Hyttel. Chronology of Apoptosis in Bovine Embryos Produced In Vivo and in vitro Biology of Reproduction 69, 1193-1200 (2003)
8. Kanitz W., Torner H., Alm H., Kuzmina T., Becker F. Aspects of in vitro production of cattle embryons // J.Physiology and Pharm. 1996. V. 47. - № 2. suppl. 2. - P. 55-70.
9. Кузьмина Т.И., Х.Альм ХТорнер, Скотти О.С., Мурза Г.В. Эффект пролактина на апоптоз в соматических и половых клетках овариальных фолликулов коров. Сборник «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». 5-7 июня 2007 г., Пущино.- С. 57-61
10. F.F. Paula-Lopes and P.J. Hansen Heat Shock-Induced Apoptosis in Preimplantation Bovine Embryos Is a Developmentally Regulated Phenomenon1Biology of Reproduction 66, 1169-1177 (2002).
INNOVATIVE EMBRYOTECHNOLOGY IN THE REPRODUCTION OF ANIMALS: FROM BASIC
RESEARCHES TO PRACTICE
T.I.Kuzmina, X.Torner, H.Alm
Summary. Ways of an intensification of introduction embryotechnology to practice are analyzed. Efficiency of use of dye brillant cresyl blue for an estimation of initial population donor’s bovine oocytes used in cellular technologies of a reproduction was shown.
Key words: cell technology of reproduction, oocytes, embryos, fertilization in vitro, BCB-test.
УДК 619:616-097.3
МОНИТОРИНГ ПЛЕМЕННОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА СКРЫТЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕФЕКТЫ И ТИПЫ ГЕНА
КАППА-КАЗЕИНА
Е.Г.НИKИФОPОBA, аспирант H.B^EEMEHTbEBA, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
A.Ф.ЯKОBЛЕB, член корреспондент PAСХН, зав. отделом
BНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных
E-mail: [email protected]
Резюме. Мониторинг племенных стад крупного рогатого скота позволил выявить носителей генетических мутаций и определить типы гена каппа-казеина. Частота С¥М среди быкопроизводящих коров в некоторых племенных хозяйствах достигает 10 %. Поэтому необходим полный генетический мониторинг стад во всех хозяйствах, реализующих ремонтных бычков. Частота носителей мутации ВІАй в отдельных хозяйствах составляет 1...2 %. Отмечено нарушение генетического равновесия по типу ВВ гена каппа-казеина. Ключевые слова: мутации, С¥М, БІАй, коровы, мониторинг
Молекулярно-генетические исследования крупного рогатого скота позволяют направлять и контролировать процессы селекции в племенных стадах. Для повышения продуктивности, как правило, используют ограниченное число выдающихся быков-производителей. Поэтому, роль одного животного в распространении опре-
68 --------------------------------------------------
деленных полиморфных типов генов и генетических дефектов значительно повышается. Это приводит, с одной стороны, к снижению гетерозиготности стада, а с другой - к насыщению популяций летальными мутациями. Генетический мониторинг летальных мутаций крупного рогатого скота необходим не только среди быков-производителей, но и в ведущих племенных хозяйствах, поставляющих ремонтных бычков на племпредприятия.
Сейчас частота встречаемости таких заболеваний, как дефицит адгезивности лейкоцитов (В_Ай) и нарушение развития позвоночного столба (СУМ) снизилась. Но контроль нужен до тех пор, пока мутантные аллели сохраняются в маточных стадах.
Исследование типов гена какппа-казеина необходимо как для определения генетического равновесия по этому гену, так и для повышения технологических свойств молока, ВВ-тип гена позволяет получать больше сыра.
Цель наших исследований - генетический мониторинг племенных животных на предмет поиска скрытых генетических дефектов и типов гена каппа-казеина в племенных хозяйствах Ленинградской области.
Условия, материалы и методы. Для анализа были взяты 497 образцов крови у коров и быков-производите-лей из ведущих племенных хозяйств Ленинградской области. ДНК выделяли по стандартной методике и хранили при -20°С. Определение ДНК-полиморфизма проводили с помощью полимеразной цепной реакции с последующим расщеплением полученного продукта эндонуклеазами.
__ Достижения науки и техники АПК, №04-2010
