CC BY
17
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ORiGiNAL RESEARCH
© Коллектив авторов, 2019
УДК 616-006.484:537.612:613.648
DOI - https://doi.org/10.14300/mnnc.2019.14021
ISSN - 2073-8137
ИНГИБИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ИМПУЛЬСНЫХ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ И ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА КУЛЬТУРУ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА T98G
И. А. Попов, А. И. Шихлярова, Э. Е. Росторгуев, М. А. Гусарева, Н. Н. Тимошкина, Д. С. Потемкин, Ю. Ю. Арапова, В. В. Стасов
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону, Россия
INHIBITING INFLUENCE OF IMPULSE MAGNETIC FIELDS AND IONIZING RADIATION ON THE CULTURE OF HUMAN T98G GLIOBLASTOMA CELLS
Popov I. A., Shikhliarova A. I., Rostorguev E. E., Gusareva M. A., Timoshkina N. N., Potemkin D. S., Arapova Yu. Yu., Stasov V. V.
Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia
В образцах культуры клеток глиобластомы человека T98G после лучевого воздействия выявлен максимальный уровень летальности. При сочетании воздействий ионизирующего излучения и ИМП с индукцией 15 мТл значения летальности оказались столь же высоки. Монофакторные воздействия ИМП как с индукцией 15 мТл, так и с индукцией 300 мТл способствовали снижению митотического индекса в 3,6-2,4 раза соответственно, а также увеличению в 2,4-2,5 раза летальности культуры относительно контроля. Полученные результаты свидетельствует об ингибирую-щем влиянии импульсных магнитных полей на жизнеспособность злокачественных глиальных клеток и перспективе сопроводительной ТМС-терапии в нейроонкологии.
Ключевые слова: глиобластома T98G, импульсное магнитное поле, ионизирующее излучение
The maximal was observed in samples of T98G human glioblastoma cell culture after radiation exposure. Combination of ionizing radiation and impulse magnetic fields (IMF) with induction of 15 mT showed similarly high lethality values. Exposure to IMF alone with induction of 15 mT and 300 mT decreased the mitotic index by 3.6 and 2.4 times, respectively, and increased the culture lethality by 2.4-2.5 times compared to the control. The results demonstrate the inhibitory effect of impulse magnetic fields on the viability of malignant glial cells and the prospects of accompanying TMS therapy in neuro-oncology.
Keywords: T98G glioblastoma, impulse magnetic field, ionizing radiation
Для цитирования: Попов И. А., Шихлярова А. И., Росторгуев Э. Е., Гусарева М. А., Потемкин Д. С., Арапова Ю. Ю., Стасов В. В. ИНГИБИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ИМПУЛЬСНЫХ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ И ИОНИЗИРУЮЩЕГО ОБЛУЧЕНИЯ НА КУЛЬТУРУ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА T98G. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2019;14(1.2):228-231. DOI - https://doi.org/10.14300/mnnc.2019.14021
For citation: Popov I. A., Shikhlyarova A. I., Rostorguev E. E., Gusareva M. A., Timoshkina N. N., Potemkin D. S., Arapova Yu. Yu., Stasov V. V. INHIBITING INFLUENCE OF IMPULSE MAGNETIC FIELDS AND IONIZING RADIATION ON THE CULTURE OF HUMAN T98G GLIOBLASTOMA CELLS. Medical News of North Caucasus. 2019;14(1.2):228-231. DOI - https://doi.org/10.14300/mnnc.2019.14021 (In Russ.)
ИМП - импульсное магнитное поле
В последнее десятилетие ежегодно отмечается рост числа новообразований головного мозга во всем мире [1, 2]. По данным 2018 года в Российской Федерации в год появляется около 32100 вновь выявленных больных с первичными опухолями центральной нервной системы, из них глиобластомы составляют 15,6 % [3]. Особое внимание уделено перифокальной зоне ложа опухоли, как источнику 80 % всех рецидивов.
На этапе лучевой терапии развитие отека перифокальной зоны ложа удаленной опухоли иницииру-
ет повышение внутричерепного давления, сдавление мозговых структур и может трансформироваться в болевой синдром за счет раздражения твердой мозговой оболочки [4]. В этой связи контроль перифокальной зоны в ближайшем послеоперационном периоде и при проведении лучевой терапии представляет собой актуальную проблему лечения злокачественных глиом головного мозга. Обсуждается потребность в развитии технологий вспомогательной терапии, к числу которых относится бесконтактная электромаг-нитотерапия [5, 6]. Особый интерес представляет
медицинский вестник северного кавказа
2019. Т. 14. № 1.2
medical news of north caucasus
Vоl. 14. Iss. 1.2
разработка алгоритмов дозирования переменного сверхнизкочастотного и постоянного магнитных полей с положительными неврологическими эффектами, возможностями их противоопухолевого, проти-воотечного и обезболивающего влияния [7, 8, 9].
В настоящее время развивается технология транскраниальной импульсной магнитотерапии как метод повышения чувствительности опухолевых клеток к ионизирующему излучению [10]. Данные о влиянии ИМП на культуру клеток глиобластомы человека в доступной литературе отсутствуют. Представляется целесообразным и перспективным изучение влияния ИМП на модели клеточной культуры глиобластомы с определением противоопухолевой эффективности ИМП в монорежиме и сочетании с лучевой терапией. Это позволит определить вероятность трансляции новых подходов для лечения злокачественных глиом мозга.
Целью исследования стало изучение противоопухолевой эффективности импульсного магнитного поля и ионизирующего излучения на модели клеточной культуры глиобластомы человека T98G.
Материал и методы. Материалом служила культура клеток глиобластомы человека T98G из коллекции КККП ИНЦ РАН. Культивирование клеток проводилось в среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) c добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific hyclone, США) и при концентрации гентамицина 50 мкг/мл (Биолот, Россия). Культуру засевали в шесть планшетов фирмы Biofil так, чтобы в каждой лунке планшета число клеток составляло не менее 800000 клеток на 3 мл питательной среды, затем инкубировали в мультигазовом инкубаторе CB 150 («Binder», Германия) в условиях контролируемых 5 % CO2, 37 °C и 95 % влажности в течение 24 часов до достижения конфлюэнтности выше 70 %. Ионизирующее излучение проводилось на аппарате TheratronEquinox фирмы BestTheratronics, где в качестве источника излучения использовался ко-бальт-60. Поле излучения с размерами 12х18 см соответствовало параметрам планшета, при этом доза излучения для каждой лунки составила 10 Гр, а время воздействия 11,69 мин. Процедуру выполняли на аппарате «Нейро-МС/Д терапевтический расширенный» компании «Нейрософт» в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее=7 мин при различных параметрах индукции -B=300 мТл и 15 мТл. Три планшета подвергали монофакторному воздействию ионизирующего излучения
Через 24 часа наблюдения показатели в контрольной группе оставались на низком уровне летальности при наивысших значениях митотического индекса клеток культуры Т980. Высокую эффективность проявило сочетание ионизирующего излучения в дозе 10 Грей и ИМП с индукцией 15 мТл. Наиболее
(1) или ИМП в двух режимах (2), два планшета - сочетанию этих воздействий. Контрольным служил планшет, который не подвергался воздействию вышеуказанных физических факторов.
После воздействий культуру помещали в мульти-газовый инкубатор CB 150 с контролируемыми условиями - 5 % CO2, 37 °C и 95 % влажности. Анализ результатов проводился в двух контрольных временных точках: через три и через двадцать четыре часа. Для снятия клеток с подложки использовался раствор DPBS и раствор Трипсин Версена в соотношении 1:1. Подсчет общего количества клеток, а также количества живых и мертвых клеток проводился в клеточном анализаторе JuLiFL NanoEntek с использованием 0,4 % раствора красителя трипанового синего в соотношении 1:1. Летальность определяли по процентному соотношению числа мертвых клеток к общему количеству клеток. Митотический индекс определяли в десяти полях зрения по процентному соотношению числа делящихся клеток к общему количеству клеток при помощи микроскопа Leica DMIL LED Fluo. Полученные данные обрабатывали на персональном компьютере с использованием пакета статистических программ «Statistica 10.0» с вычислением критерия достоверности Стьюдента (t). Статистически значимым считалось различие с вероятностью безошибочного прогноза не менее 95 %, т. е. p<0,05.
Результаты и обсуждение. При сравнении показателей летальности между исследуемыми группами было установлено, что через 3 часа минимальный процент гибели культуры клеток глиобластомы отмечался в контрольной группе. Напротив, максимальный уровень мертвых клеток был зафиксирован в образцах культуры T98G после воздействия ионизирующего излучения (18,7 % против 5,2 % в контроле, p<0,05). После сочетания ионизирующего излучения с ИМП с индукцией в 15 мТл результаты были сопоставимы с лучевым воздействием, а при индукции 300 мТл - на 20 % ниже. При этом разница с контрольными данными была существенной и наблюдаемое увеличение летальности клеток культуры T98G в 2,9 раза свидетельствовало о высоком ингибирующем влиянии используемых факторов. Применение ИМП в монорежиме с разной индукцией в 15 или 300 мТл привело к неожиданному противоопухолевому эффекту: увеличению показателей летальности клеток глиобластомы соответственно в 2,5-2,8 раза выше по сравнению с контролем (табл. 1).
глубокое подавление митотической активности гли-альных клеток Т980 наблюдалось при воздействии в монорежиме ИМП с индукцией 15 мТл: митотический индекс клеток глиобластомы по сравнению с контролем снизился в 4,7 раза, а летальность увеличилась в 2,3 раза (табл. 2).
Таблица 1
Количество клеток, летальность при разных условиях эксперимента через три часа после воздействий
Условия эксперимента Число клеток Общее число клеток Летальность
живые мертвые
Контроль 720000,0±18165,9 39850,00±4323,01 759850,0±21092,38 5,2 %
10 Гр 680000,0±19148,54 157000,0±4771,443* 837000,0±20978,56 18,7 %
15 мТл 711666,7±37004,75 104833,3±5574,163* 816500,0±42030,38 12,8 %
300 мТл 686666,7±14129,03 114833,3±5823,722* 801500,0±18769,29 14,3 %
10 Гр+15 мТл 666666,7±32312,14 152833,3±9579,734* 819500,0±41220,65 18,6 %
10 Гр+300 мТл 686666,7±12981,47* 123500,0±4504,011* 810166,7±12120,88 15,2 %
* - р<0,05 по отношению к контролю.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
oRiGiNAL RESEARCH
Таблица 2
Количество клеток, летальность и митотический индекс при разных условиях эксперимента через двадцать четыре часа после воздействий
Условия эксперимента Число клеток Общее число клеток Летальность Митотический индекс
живые мертвые
Контроль 961666,7±27556,3 58166,66±4342,8 1019833,3±30653,5 5,7 % 6,6 %
10 Гр 510000,0±35087,2* 116833,3±8887,2* 626833,33±42369,9* 18,6 % 4,4 %
15 мТл 975000±40875,8 153833,3±8150,3* 1128833,3±45156,3 13,6 % 1,8 %
300 мТл 1148000±31763,0 156400,0±8920,6* 1087000,0±95432,1 14,4 % 2,8 %
10 Гр+15 мТл 760000±47128,7 165500,0±6815,6* 925500,0±46752,4 17,9 % 3,5 %
10 Гр+300 мТл 813333,33±21464,9 143333,3±3873,9* 956666,7±23988,6 15 % 3,1 %
* - р<0,05 по отношению к контролю.
Таким образом, экспериментальные данные, полученные на культуре клеток злокачественной глиомы человека Т980, свидетельствовали о высокой значимости сочетания ионизирующего излучения с ИМП как фактором неспецифической природы, оказывающим самостоятельное ингибирующее влияние на клетки опухоли мозга. Были установлены различия при межгрупповом сравнении с контролем, на фоне которого влияние ИМП убедительно демонстрировало эффекты повышения летальности и снижения митотического индекса злокачественных клеток культуры Т980. Кроме того, было обнаружено различие в эффективности разных режимов интенсивности при
одинаковом поличастотном алгоритме ИМП, свидетельствующее о предпочтительном использовании «малых доз» воздействия, как отражение принципа нелинейности в реакциях живых систем.
Заключение. Полученные результаты указывают на доступность сверхнизкочастотных слабых ИМП к интимным механизмам регуляции клеточного деления и свидетельствуют об их ингибирующем влиянии на жизнеспособность культуры клеток глиобластомы человека Т980. Это указывает на перспективы применения импульсной транскраниальной магнитоте-рапии в качестве сопроводительного метода лечения в нейроонкологии.
Литература/References
1. Siegel R. L., Miller K. D., Jemal A. Cancer Statistics, 2017. CA: А Cancer Journal for Clinicians. 2017;67(1):7-30. https://doi.org/10.3322/caac.21387
2. Каприн А. Д., Старинский В. В., Петрова Г. В. Злокачественные новообразования в России в 2016 году (заболеваемость и смертность). М.: МНИОИ им. П. А. Герцена; 2018. [Kaprin A. D., Starinskij V. V., Petrova G. V. (eds.). Zlokachestvennye novoobrazovaniya v Rossii v 2016 godu (zabolevaemost i smertnost). Moscow: MNIOI im. P. A. Gertsena; 2018. (In Russ.)].
3. Первичные опухоли центральной нервной системы. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации; 2018. Режим доступа: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/853. Ссылка активна на 19.12.2018. [Pervichnye opukholi tsentralnoj nervnoj sistemy. Klinicheskie rekomendatsii ministerstva zdravookhraneniya Rossijskoj Federatsii; 2018. Available at: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/853. Accessed December 19, 2018. (In Russ.)].
4. Zhu P., Zhu J. J. Tumor treating fields: a novel and effective therapy for glioblastoma: mechanism, efficacy, safety and future perspectives. Chinese Clinical Oncology. 2017;6(4):41. https://doi.org/10.21037/cco.2017.06.29
5. Улащик В. С. Магнитотерапия: современные представления о механизмах действия магнитных полей на организм. Здравоохранение. 2015;11:21-29. [Ulashchik V. S. Magnet therapy: current understanding of mechanisms of magnet field action on body. Zdravookhranenie. - Health care. 2015;11:21-29. (In Russ.)].
6. Куташов В. А., Шульга А. С. Транскраниальная магнитотерапия в неврологической клинике. Центральный научный вестник. 2016;1(12):9-11. [Kutashov V. A., Shulga A. S. Transcranial magnetic therapy in neurological clinic. Tsentralnyj nauchnyj vestnik. - Central Scientific Herald. 2016;1(12):9-11. (In Russ.)].
7. Falone S., Grossi M. R., Cinque B., D'Angelo B., Tettama-nti E. [et al.]. Fifty hertz extremely low-frequency electromagnetic field causes changes in redox and differentiative status in neuroblastoma cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2007;39(11):2093-2106. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2007.06.001
8. Destefanis M., Viano M., Leo C., Gervino G., Ponzetto A. [et al.]. Extremely low frequency electromagnetic fields affect proliferation and mitochondrial activity of human cancer cell lines. International Journal of Radiation Biology. 2015;91(12):964-972.
https://doi.org/10.3109/09553002.2015.1101648
9. Marchesi N., Osera C., Fassina L., Amadio M., Angelet-ti F. [et al.]. Autophagy Is Modulated in Human Neuroblas-toma Cells Through Direct Exposition to Low Frequency Electromagnetic Fields. Journal of Cellular Physiology. 2014;229(11):1776-1786. https://doi.org/10.1002/jcp.24631
10. Storch K., Dickreuter E., Artati A., Adamski J., Cordes N. BEMER Electromagnetic Field Therapy Reduces Cancer Cell Radioresistance by Enhanced ROS Formation and Induced DNA Damage. PLoS One. 2016;11(12):e0167931. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167931
Сведения об авторах:
Попов Иван Александрович, врач-нейрохирург, аспирант;
тел.: 89515080080; e-mail: [email protected]; http://orcid.org/0000-0002-1126-3186
Шихлярова Алла Ивановна, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник испытательного лабораторного центра; e-mail: [email protected]; http://orcid.org/0000-0003-2943-7655
Росторгуев Эдуард Евгеньевич, кандидат медицинских наук, заведующий отделением нейроонкологии; e-mail: [email protected]; http://orcid.org/0000-0003-2937-0470
