CC BY
26
УДК 616.8-092 ПЕТРОСЯН Т.Р.
Кафедра кинезиологии Армянского государственного института физической культуры, г. Ереван
ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО МЕЛАНИНА НА ЦЕРЕБРАЛЬНУЮ ВОСПАЛИТЕЛЬНУЮ РЕАКЦИЮ ПОСЛЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ МОЗГОВОЙ ТКАНИ У КРЫС
Резюме. У 12 животных было проведено гистохимическое исследование мозга с целью выявления действия бактериального меланина на процесс регенерации и вторичного воспаления после повреждения мозговой ткани. В мозговой ткани крыс (п = 6), которым на второй день после повреждения был введен внутримышечно раствор меланина, было обнаружено отсутствие соединительнотканного рубца, выраженная васкуляризация, а в окружающей рану мозговой ткани — большое количество ядер глиальных клеток и меньше макрофагов. У контрольных животных срок восстановления локомоции в три раза длиннее, чем у животных, получавших меланин.
Ключевые слова: гистохимическое исследование, повреждение мозговой ткани, воспаление, бактериальный меланин, протекторное влияние.
ш
М1ЖНАРОДНИЙ НЕВРОПОГ1ЧНИЙ ЖУРНАЛ
INTERNATIONAL NEUROLOGICAL JOURNAL |
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ /ORIGINAL RESEARCHES/
Введение
Несмотря на то, черепно-мозговая травма (ЧМТ) продолжает оставаться значительной проблемой общественного здравоохранения в мире, в настоящее время не существует эффективного метода лечения, который улучшает исход этой патологии [1, 2]. Одной из задач терапии ЧМТ является предупреждение вторичного повреждения мозга. Такое повреждение может быть обусловлено увеличением количества многочисленных иммунных медиаторов, которые часто активируются в ответ на ЧМТ [3—5]. Повышенные уровни таких молекул, как 1Ь-1р, ТКБ-а, 1Ь-6, 1САМ-1, в поврежденной мозговой ткани способствуют повреждению головного мозга, гибели клеток и нарушению функции гематоэнцефалического барьера [6].
Исходя из того, что в последнее десятилетие в числе современных подходов при лечении нейроде-генеративных заболеваний успешно применяются разного рода нейропротекторы, после введения которых ускоряется посттравматическое восстановление утраченных функций структур центральной нервной системы (ЦНС), в настоящем исследовании с этой целью был использован водный раствор бактериального меланина (БМ). Использованная в настоящем исследовании концентрация (6 мг/мл) успешно была применена нами в физиологических исследованиях в
предыдущие годы с целью обеспечения скорейшего восстановления нарушенных двигательных функций у крыс после разрушения ряда структур ЦНС, участвующих в организации двигательного поведения животного [7, 8].
Целью настоящего исследования было определить, способен ли бактериальный меланин ослаблять индуцированное травмой воспаление мозга в области сенсомоторной коры у крыс. Мы предположили, что эффект бактериального меланина на модуляцию церебрального воспалительного ответа заключается в механизме, посредством которого БМ уменьшает отек мозга, улучшает микроциркуляцию и подавляет корковый апоптоз после травмы.
В других работах было отмечено влияние пептидов меланокортина на процессы обучения и памяти, такие как классические и инструментальные условные
Адрес для переписки с автором: Петросян Т.Р.
Кафедра кинезиологии, Армянский государственный институт физической культуры 0070, Армения, г. Ереван, ул. Алек Манукян, 11 [email protected]
© Петросян Т.Р., 2013
© «Международный неврологический журнал», 2013 © Заславский А.Ю., 2013
fiNJj
рефлексы, зрительная дискриминация, габитуация и импринтинг у рыб, амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих, включая человека [9, 10]. Например, была обнаружена связь между меланин-концентриру-ющим гормоном, гиппокампальным уровнем окиси азота и процессом восстановления памяти [11], а также установлено значение уменьшения количества накопленного нейромеланина в черной субстанции при болезни Паркинсона [12].
Исследования показали, что у пациентов с болезнью Паркинсона происходит интенсивное разрушение (70 %) меланин-содержащих нейронов в компактной части черной субстанции [13]. Оксидативный стресс и высокий уровень металлов приводят к гибели нейронов черной субстанции, так как дофаминерги-ческие нейроны этой структуры имеют особенность накапливать ионы различных металлов, особенно железа. Экспериментальные исследования показали, что основной причиной болезни Паркинсона является потеря дофамин-содержащих нейронов, которые расположены в компактной части черной субстанции, а также их нервных окончаний, расположенных в полосатом теле. Доказано, что воспалительные факторы могут привести к гибели дофаминергических нейронов черной субстанции. Бактериальный меланин может способствовать выживанию нейронов в черной субстанции в условиях воздействия токсических факторов, подавлять воспалительный процесс. Вещество способствует также спраутингу нервных волокон, что было показано в серии экспериментов, проведенных на крысах [14]. Исследования показали также, что у пациентов с болезнью Паркинсона дофаминерги-ческие нейроны черной субстанции, содержащие нейромеланин, более подвержены дегенерации, чем нейроны, не содержащие меланин. Было доказано, что свободный внеклеточный нейромеланин становится причиной микроглиоза и является основной причиной болезни Паркинсона [15]. Внеклеточный нейромеланин в отсутствие микроглии нетоксичен для нейронов. Однако выход нейромеланина из разрушенных нейронов вызывает активацию микроглии и процесса нейродегенерации. Наши исследования с применением бактериального меланина (6 мг/мл) показали, что вещество не вызывает микроглиоза и не имеет побочных токсических эффектов [7].
Методика
Исследование проводили на 12 белых взрослых нелинейных крысах-самцах с массой тела 180—250 г. Животных анестезировали нембуталом (35—40 мг/кг внутрибрюшинно) и оперировали, удаляя сенсомо-торную кору левого полушария, которая соответствует зоне репрезентации передней и задней конечности справа [16]. У крыс проводили краниотомию, во время которой открывали поверхность на 2 мм ро-стральнее, на 3 мм каудальнее и на 3 мм латеральнее
Оригинальные исследования /Original Researches/
от линии «0» коронарного шва (брегмы), разрезали твердую мозговую оболочку и обнаженную кору данной площади удаляли отсосом через тонкую стеклянную пипетку до уровня белого вещества. После такой операции в последующие дни первой недели у крыс наблюдали парез конечностей контралатераль-ной стороны.
При введении раствора БМ объем вводимого раствора соответствующей концентрации вычисляли из расчета оптимально переносимой дозы в 0,17 г на килограмм живой массы. БМ вводили на следующий день после удаления сенсомоторной коры.
Через месяц после операции всех подопытных животных усыпляли нембуталом (45—50 мг/кг веса). В глубоком наркотическом сне производили декапита-цию, извлекали мозг и на его поверхности определяли размеры удаленного участка сенсомоторной коры. Далее мозги фиксировали в 5% растворе нейтрального формалина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4). Затем приготовляли срезы толщиной 50—60 предназначенные для микроскопических исследований.
С целью выяснения морфофункционального состояния клеточных структур мозга животных проводили гистохимические и гистоангиологические исследования. Применен гистоангиологический метод для выявления микроциркуляторного русла [17] и модифицированный гистохимический метод выявления активности кислой фосфатазы [18], который дает возможность не только получить богатую морфологическую картину, но и судить о функциональном состоянии самих структур.
Для оценки уровня достоверности различий мор-фометрических данных использованы расчеты по определению ^критерия Стьюдента [19].
Результаты
После удаления сенсомоторной коры и введения раствора БМ у крыс оценивался процесс восстановления моторики. У крыс, получивших БМ после операции, локомоция полностью восстановилась в течение 10—12 дней, а у контрольных животных полное восстановление движений произошло не раньше, чем через 30—35 дней.
Для изучения влияния раствора БМ на вторичное повреждение мозговой ткани проводилось морфоги-стохимическое изучение срезов сенсомоторной коры крыс, получавших БМ, и контрольных животных. Срезы мозга были приготовлены через месяц после операции и введения раствора БМ.
В морфологических исследованиях мозга контрольных и экспериментальных животных сравнивали локализацию, протяженность и глубину участка повреждения сенсомоторной коры. На срезах мозга контрольных животных (рис. 1, Д-Е) выявляется выраженный процесс глиоза. Четко выявляются гра-
Оригинальные исследования /Original Researches/
Рисунок 1. Место удаления сенсомоторной коры показано белой стрелкой. А-Г — срезы мозга животных, получивших внутримышечно бактериальный меланин в концентрации 6 мг/мл. Видно место удаления, заполненное клеточными элементами. Д-Е — срезы мозга животных контрольной группы. Четко видны границы удаленного участка коры за счет образования соединительнотканного рубца
ницы удаленного участка коры за счет образования соединительнотканного рубца — этого мощного барьера для миграции нервных и глиальных элементов, а также известного тормозящего фактора на пути роста аксонов. На срезах мозга экспериментальных животных (рис. 1, А-Г) наблюдается сближение, а местами и сращение границ травмы. Отмечается также значительная разница в степени инфильтрации раны соединительной тканью. У крыс, получивших бактериальный меланин, в окружающей рану мозговой ткани больше обнаруживается ядер глиальных клеток и меньше — макрофагов.
Данные по исследованию микроциркуляторного русла мозга животных, получивших в/м инъекцию раствора БМ, показали, что произошло усиление васкуляризации коры за счет расширения просвета сосудов по сравнению с контрольными животными.
Была проведена морфометрия в области сенсомо-торной коры. Средний диаметр сосудов выводился из измерений 150 капилляров на срезах мозга каждого животного. Статистическая обработка цифровых
Рисунок 2. Капиллярная сеть сенсомоторной коры полушария мозга крысы: А — сенсомоторная кора крысы контрольной группы; Б — сенсомоторная кора крысы после введения бактериального меланина в концентрации 6 мг/мл, на второй день после операции
данных с использованием ^критерия Стьюдента показала, что у контрольных крыс средний диаметр 900 капилляров был равен 5,90 ± 0,02 мкм (Р < 0,01), а у крыс, получивших раствор БМ, у того же числа капилляров средний диаметр был равен 6,40 ± 0,13 мкм (Р < 0,01). Расчеты показали, что просвет капилляров сенсомоторной коры был расширен на 8,5 % (Р < 0,01) по сравнению с контролем, что приводило к значительному усилению трофики мозга.
Полученные данные показывают, что благодаря протекторному и противовоспалительному влиянию бактериального меланина после удаления сенсомо-торной коры у крыс предотвращается образование рубца, усиливается трофика в результате расширения просвета сосудов и раскрытия новых ветвей в капиллярной сети, обеспечивается сохранность нервных клеток.
Обсуждение результатов
По результатам сроков восстановления локо-моции после удаления сенсомоторной коры у кон-
fiNJj
трольных крыс и у животных экспериментальной группы, получивших внутримышечное введение раствора бактериального меланина, можно заключить, что меланин играет определенную протекторную роль, ускоряя компенсаторное восстановление в центральной нервной системе после перенесенной травмы.
Аналогичный эффект получили также ЬипегЪи^ и Р1оИг [20] при исследовании влияния мелано-цитстимулирующего гормона. Очевидно, в мозге экспериментальных животных под влиянием бактериального меланина в первую очередь усиливаются трофические процессы благодаря усилению васку-ляризации, что способствует быстрому восстановлению нарушенных моторных функций. Как уже было отмечено, восстановление нормальной локомоции после удаления сенсомоторной коры наступает и у контрольных животных, но движение конечности у них восстанавливается или частично, или очень поздно. Считается, что основной причиной восстановления дефицита движения является способность кортикоруброспинального тракта брать на себя функцию поврежденного кортикоспинального тракта [21]. Эти два моторных тракта взаимодействуют через многочисленные петли на корковом, спинальном уровнях и также имеют проекции на нескольких уровнях спинного мозга. В настоящих экспериментах, когда после удаления сенсомоторной коры снимается тормозное влияние пирамидного тракта на кортикоруброспинальный путь на уровне коры мозга и красного ядра, руброспинальная система с помощью руброоливарных проекций берет под свой контроль обеспечение моторной функции, тем самым компенсируя функцию кортикоспиналь-ного тракта.
Очевидно, что быстрое и окончательное устранение дефицита моторики (10—12 дней при 6 мг/мл), наблюдаемое у получивших бактериальный меланин крыс, следует отнести к активирующему действию этого вещества. Не исключено, что при этом происходит ускорение процесса спраутинга и формирования новых синапсов. Результаты морфогистохи-мического исследования мозга экспериментальных животных показали, что введение вышеуказанных концентраций раствора БМ с целью клинического восстановления после повреждения центральной нервной системы, вероятно, влечет за собой активацию целого ряда трофических поддержек в качестве благоприятных факторов для регенерации, подавления вторичного повреждения и воспалительного процесса в мозговой ткани [22]. Возможно также допустить, что в указанных условиях активируется процесс деления стволовых клеток [23], который мог бы внести свой вклад в быстрое восстановление определенных структурных элементов коры мозга после травмы.
Оригинальные исследования /Original Researches/
Выводы
Терапевтический эффект применения бактериального меланина после повреждения мозговой ткани обусловлен усилением кровоснабжения в микроцир-куляторном русле, улучшением трофики мозговой ткани, благотворным воздействием на модуляцию вторичного воспалительного процесса и ингибиро-ванием глиоза.
Список литературы
1. Samir H. Haddad, Yaseen M. Arabi. Critical care management of severe traumatic brain injury in adults//Scand. J. Trauma Resusc. Emerg. Med. - 2012. - Vol. 20, № 12. - P. 2-15.
2. McKee J.A, Brewer R.P., Macy G.E., Borel C.O., Reynolds J.D., Warner D.S. Magnesium neuroprotection is limited in humans with acute brain injury // Neurocritical Care. — 2005. — Vol. 2, № 3. - P. 342-351.
3. Probst C, Mirzayan M.J., Mommsen P., Zeckey C, Teged-er T., Geerken L, Maegele M, SamiiA., van Griensven M. Ystemic Inflammatory Effects ofTraumatic Brain Injury, Femur Fracture, and Shock: An Experimental Murine Polytrauma Model// Mediators of Inflammation. - 2012. - Vol. 95, № 1-2. - P. 115-125.
4. Yu Lin, Liang Wen. Inflammatory Response Following Diffuse AxonalInjury//Int. J. Med. Sci. — 2013. — Vol. 10. - Р. 515-521.
5. Rancan M., Otto V.I., Hans V.H.J. Upregulation ofICAM-1 and MCP-1 but not of MIP-2 and sensorimotor deficit in response to traumatic axonal injury in rats // Journalof Neuroscience Research. - 2001. - Vol. 63, № 5. - P. 438-446.
6. NamasR., Ghuma A., HermusL., ZamoraR., Okonkwo D.O., Billiar T.R., Vodovotz Y.J. The Acute Inflammatory Response in Trauma / Hemorrhage and Traumatic Brain Injury: Current State and Emerging Prospects//LJM. — 1996. — Vol. 4, № 3. — P. 97103.
7. Gevorkyan O.V., Meliksetyan I.B., Ovsepyan A.S., Sagi-yan A.S. Effects of BT-melanin on recovery of operant conditioned reflexes in rats after ablation of the sensorimotor cortex // Neuroscience and Behavioral Physiology. — June 2007. — Vol. 37, Issue 5. - P. 471-476.
8. Фанарджян В.В. Функциональная роль красного ядра в коммуникационной системе кора мозга — мозжечок — спинной мозг// Успехи физиологических наук. — 2001. — Т. 32, № 2. — С. 3-15.
9. Elizabeth Adkins-Regan. Hormones and Animal Social Behavior. — Princeton University Press, 2005. — P. 245.
10. Scott Brady, George Siegel, R. Wayne Albers, Donald Price. Basic Neurochemistry: Principles ofMolecular, Cellular, and Medical Neurobiology. - Elsevier, 2012. - P. 1096.
11. Pavlos Pissios, RichardL. Bradley, Eleftheria Maratos-Flier. Expanding the Scales: The Multiple Roles of MCH in Regulating Energy Balance and Other Biological Functions // Endocrine reviews. - 2006. - V. 27, № 6. - P. 606-613.
12. ZeccaL., Zucca F.A., AlbertiniA., Rizzio E., Fariello R.G. A proposed dual role ofneuromelanin in the pathogenesis of Parkinson's disease// J. Neurology. — October 10, 2006. — Vol. 67, № 7, suppl. 2. - S8-S11.
13. Mauro Fasano, Bergamasko Bruno, Lopiano Leonardo. Modifications of the iron neuromelanin system in Parkinson's disease // J. Neurochem. - 2006. — 96. - 909-916.
Оригинальные исследования /Original Researches/
14. Petrosyan T.R., Gevorkyan O.V., Meliksetyan I.B., Hov-sepyan A.S., Manvelyan L.R. The Action of Bacterial Melanin in Rats after Pyramidal tract lesions // Journal Pathophysiology, Elsevier. - 2012.. - V 19. - P71-80.
15. Wei Zhang, Wielgus Phillips, Liu Jie, Albertini A., Zucca F., Faust R., Qian S., Miller D. Neuromelanin activates microglia and induces degeneration of dopaminergic neurons: implications for progression of Parkinson's disease // Neurotoxicity Res. — 2011. — 19. - 68-72.
16. Hicks S.P., D'Amato C.J. Locating corticospinal nervous by retrograde axonal transport of horseradish peroxidase // Exp. Neurol. - 1977. - V 56. - P. 410-420.
17. Чилингарян А.М. Новый кальций аденозин-трифос-фатный метод для выявления внутриорганного микроциркуля-торного русла //ДАН РА. - 1986. - Т. 82, вып. I. - С. 66-71.
18. Меликсетян И.Б. Активность кислой фосфатазы в клеточных структурах центральной нервной системы //
_1ш
Доклады, посвящ. 60-летию основания Института физиологии НАН Армении. — Ереван, 2004. — С. 108-111.
19. John McDonald. Handbook ofBiologicalStatistics. — Sparky House Publishing, 2011. — P. 319.
20. Luneberg U., Flohr H. Vestibular Compensation: Facts, Theories and Clinical Perspectives. — Paris: Elsevier, 1989. — Р. 161-174.
21. Kennedy PR., Humphry D.R. The compensatory role of the parvocellular division of the red nucleus in operantly conditioned rats//Neurosci. Res. — 1987. — V. 5. - P. 39-62.
22. Elisabeth Hansson, Lars Ronnback. Glial neuronal signaling in the central nervous system // The FASEB Journal. — 2011. — Vol. 17, № 3. - 341-348.
23. Галоян А.А. Стволовые клетки в генетических механизмах нейрогенеза и гематопоэза // Нейрохимия. — 2004. - Т. 21, № 3. - C. 183-189.
Получено 15.07.13 □
Петросян Т.Р.
Кафедра юнезюлоги Врменського державного ¡нституту ф!зично'1 культури, м. Ереван
¡нпбуюча д|я бактер1ального меланжу на церебральну запальну реакцю пюля ушкодження мозково1 тканини в щур1в
Резюме. У12 тварин було проведено пстохишчне дослщження мозку з метою виявлення дц бактерiального меланшу на процес регенерацп i вторинного запалення тсля ушкодження мозково! тканини. У мозковш тканиш щурiв (п = 6), яким на другий день тсля ушкодження був введений внутршньом'язово розчин меланшу, була виявлена вщсутшсть сполучнотканинного рубця, виражена васкуляризацы, а в оточуючш рану мозковш тканиш — велика кшьисть ядер дальних клггин i менше макрофапв. У контрольних тварин термш вщновлення локомоцй в три рази довший, нгж у тварин, яи отримували меланш.
Ключовi слова: гiстохiмiчне дослщження, ушкодження мозково! тканини, запалення, бактерiальний меланш, протекторний вплив.
Petrosyan T.R.
Department of Kinesiology of Armenian State Institute of Physical Education, Yerevan, Armenia
inhibitory effect of bacterial melanin on cerebral inflammatory response following brain tissue traumatic injury in rats
Summary. Histochemical study of brain was carried out in 12 rats to reveal the effects ofbacterial melanin on processes of regeneration and secondary inflammation after brain tissue injury. In the brain tissue of rats (n = 6) injected intramuscularly with melanin solution on the next day of trauma, we revealed the absence of connective tissue scar, increased vascularization, and a large number of glial cell nuclei and very small number ofmacrophages in the brain tissue surrounding the wound. In control rats the recovery period of locomotion was three times longer than in melanin injected animals.
Key words: histochemical study, brain tissue injury, inflammation, bacterial melanin, protective action.
