CC BY
74
Ингибирование адгезии бактерий Staphylococcus на сетчатых имплантатах в комбинации с биоцидами (in vitro)
*М. В. КУЗНЕЦОВА1-2, А. А. ПАРШАКОВ', Е. В. АФАНАСЬЕВСКАЯ', В. А.САМАРЦЕВ'
1 ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е. А. Вагнера» Минздрава России, Пермь
2 ФБГУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
Inhibition of Adhesion of Staphylococcus Bacteria on Mesh Implants in Combination with Biocides (in vitro)
*M. V. KUZNETSOVA12, A. A. PARSHAKOV1, E. V. AFANASYEVSKAYA1, V. A. SAMARTSEV1
1 Perm State Medical University named after Academician E. A. Wagner, Perm
2 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of RAS, Perm
Оценена адгезия Staphylococcus aureus ATCC® 25923 и клинических штаммов S.aureus, S.epidermidis на монофиламентных хирургических сетчатых имплантатах — макропористом полиэстеровом и микропористом полипропиленовом, в комбинации с биоцидами в эксперименте in vitro. Клетки стафилококков адгезировались на поверхности фрагментов имплантатов без обработки биоцидами уже через несколько часов, при этом не выявлено существенного влияния на адгезию структуры или химический состав волокна. Кратковременная экспозиция имплантатов в растворах амоксиклава (100 мкг/мл) и хлор-гексидина (0,5%) приводила к ингибированию роста бактерий и контаминации поверхности как минимум в течение двух суток. В варианте с ванкомицином (100 мкг/мл) бактериальные клетки адгезировались на поверхности сетчатых фрагментов через 24 ч, но их количество было достоверно меньше, чем в контроле. Отмечено, что оба имплантата в комбинации с хлор-гексидином не были контаминированы бактериями S.aureus в течение 2 сут. и в условиях высокой концентрации клеток в суспензии. Регуляция бактериальной адгезии с использованием растворов биоцидов может представлять простую и экономичную стратегию борьбы с развитием инфекции области хирургического вмешательства.
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, биоплёнки, сетчатый импмнтат, полипропилен, полиэстер, биоциды.
The adhesion of Staphylococcus aureus ATCC® 25923 and the clinical strains of S.aureus, S.epidermidis on monofilament surgical mesh implants — macroporous polyester and microporous polypropylene in combination with biocides was assessed in an in vitro experiment. Staphylococcus cells adhered to the surface of implant fragments without treatment with biocides within a few hours, and there was no significant effect on the adhesion of the structure or chemical composition of the fiber. Short-term exposure of implants to the solutions of amoxiclav (100 ^g/ml) and chlorhexidine (0.5%) led to inhibition of bacterial growth and contamination of the surface for at least two days. In the experiment with vancomycin (100 ^g/ml), bacterial cells adhered on the surface of the mesh fragments after 24 h, but their amount was significantly lower than in the control group. It was noted that both implants in combination with chlorhexidine were not contaminated with S.aureus bacteria for 2 days under conditions of a high concentration of cells in the suspension. Regulation of bacterial adhesion using biocidal solutions can be a simple and economical strategy to combat the development of infection in the field of surgical intervention.
Keywords: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, biofilms, mesh implant, polypropylene, polyester, biocides.
Введение
Бактерии рода Staphylococcus являются наиболее частой причиной инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в том числе, обусловленный использованием катетеров, имплантатов и других внедрённый в организм медицинских устройств [1—3]. Это напрямую зависит от их способности создавать многослойную, хорошо структурированную биоплёнку на искусственный и би-
© Коллектив авторов, 2017
*Адрес для корреспонденции: e-mail: [email protected]
отических поверхностях. Последние достижения молекулярной биологии обеспечили детальное представление о биоплёнкообразовании стафилококков [4—6]. Формирование биоплёнки начинается с прикрепления клеток бактерий при участии тейхоевы х кислот к абиотической поверхности или связывания с белковыми факторами макроорганизма посредством специальны х рецепторов, названных MSCRAMM (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules — микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные молекулы матрикса) [7]. В результате этого взаимодействия экспрессируется
синтез катионного поли-М-ацетилглюкозамина — основного компонента полисахаридного межклеточного адгезина (PIA), и усиливается агрегация клеток. Получены данные об особенностях адгезии и первых этапов образования биоплёнок бактериями S.aureus и S.epidermidis при изменении физико-химических параметров внешней среды или под действием факторов, влияющих на поверхностные структуры бактериальных клеток [8, 9]. Регулировать бактериальную адгезию пытаются с помощью изменения свойств полимерных материалов, модификации поверхности или путём добавления антибактериальных соединений, что является основной стратегией подавления биоплён-кообразования бактерий [10—12].
Широкое внедрение в современную хирургическую практику синтетических сетчатых им-плантатов позволило снизить частоту рецидивов грыж почти на 50% по сравнению с таковой при использовании пластики местными тканями [13]. Однако применение аллотрансплантатов может привести к ряду осложнений. Частота инфекции области хирургического вмешательства (ИОХВ) после герниопластики, в зависимости от вида операции, составляет от 0,3 до 21,5% случаев, среди которых лидирующее место занимают се-ромы, целлюлит, образование серозных и гнойных свищей [14, 15]. Предоперационное системное применение антибактериальных препаратов является основным методом профилактики ИОХВ, который оправдан в случаях высокого риска инфекционных осложнений [16]. Тем не менее, эта стратегия не может гарантировать абсолютную эффективность, а в ряде случаев, например, в хирургии паховых грыж, является спорным вопросом [17—19]. Кроме того, системное использование антибиотиков может привести к побочным эффектам, а также способствует селекции резистентных штаммов микроорганизмов [20, 21]. К нерешённым проблемам герниологии относится и внедрение имплантатов в условиях компрометированной зоны вмешательства [22]. В связи с этим, новые данные о влиянии биоцидов на бактериальную колонизацию полимерных поверхностей могут стать основой для разработки эффективных способов предупреждения и борьбы с имплант-ассоциированными инфекциями, обусловленными формированием биоплёнок.
Цель работы — оценить адгезию бактерий рода Staphylococcus на полиэстеровых и полипропиленовых сетчатых имплантатах в комбинации с биоцидами в эксперименте in vitro.
Материал и методы
В работе использовали клинические штаммы S.aureus (n=5) и S.epidermidis (n=4), изолированные из раневого отделяемого пациентов хирургического стационара ГАУЗ ПК ГКБ №4 г. Перми. Все штаммы были чувствительны к оксацилли-ну и ванкомицину (МУК 4.2.1890-04). Референтный штамм
S.aureus АТСС® 25923 получен из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им Л. А. Тарасевича (сейчас ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, г. Москва).
Исследование проведено на двух хирургических сетчатых монофиламентных имплантатах: макропористый полиэстеро-вый Parietex™ Lightweight Monofilament Mesh (Medtronic, Ирландия) (удельный вес — 46 г/м2, размер пор — 1,5 мм, L-PE) и микропористый полипропиленовый Surgipro™ SPMM (Medtronic, Ирландия) (удельный вес — 90 г/м2, размер пор — 0,8 мм, H-PP).
Эксперименты по контаминации сетчатых имплантатов стафилококками проводили двумя способами. В первом случае [23] суспензии ночных культур бактерий, стандартизованных до 2,0 по стандарту McFarland и разведённых 1:100 в бульоне Луриа-Бертани (LB-бульон), засевали газоном (50 мкл) на LB-агар. Фрагменты сетчатых имплантатов (~10х10 мм) погружали на 10 мин в 0,89% NaCl (контроль), 0,5% раствор хлоргексидина биглюконата (ХГ), раствор амоксиклава (АМК, 100 мкг/мл) и раствор ванкомицина (ВАН, 100 мкг/мл), после чего удаляли излишки растворов промачиванием фильтровальной бумагой и раскладывали на засеянный газоном LB-агар. Чашки с посевами инкубировали при температуре 37°С в течение 24 ч. Результаты оценивали с учётом зон ингибирова-ния роста (ЗИР) бактерий по коэффициенту, рассчитанному как Sзиp/Sфрагмента. Документирование результатов производилось при помощи системы Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Во втором случае фрагменты сетчатых имплантатов в аналогичных вариантах помещали в лунки 24-луночного плоскодонного полистиролового планшета «Corning» (Бельгия) с бактериальной суспензией стандартизированной до 106 клеток/мл и инкубировали в течение 6, 24 и 48 ч. Динамику роста микробной популяции контролировали путём измерения оптической плотности клеток на микропланшетном ридере Benchmark Plus (Bio-Rad, США) при длине волны 600 нм. После экспозиции фрагменты сетчатых имплантатов 3-кратно отмывали в 5 мл 0,89% NaCl, погружали в 1,0 мл фосфатно-буферной среды и обрабатывали ультразвуком 5 раз в течение 1 мин при 37 кГц, поместив планшеты в ультразвуковую ванну Elma Ultrasonic 30S (Elma, Германия). Количество жизнеспособных клеток оценивали по числу колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) после высева из последовательных децимальных разведений бактериальных суспензий на LB-агар.
В отдельном эксперименте моделировали условия критически высокой обсеменённости области имплантации. Для этого фрагменты имплантатов помещали в лунки 24-луночно-го плоскодонного полистиролового планшета «Corning» (Бельгия) с бактериальной суспензий, стандартизированной до 108 клеток/мл ночной культуры каждого штамма и инкубировали в течение 48 ч. Рост микробной популяции и число ад-гезированных на поверхности имплантатов клеток оценивали аналогичным образом.
Микроскопию отмытых и предварительно окрашенных 0,1% водным раствором генцианового фиолетового (генциан-виолета) фрагментов имплантатов проводили на морфомет-рической установке «Olympus» (увеличение х200; х400, х1000) с последующим анализом изображений в программе Image PRO+ (free version).
Статистическую обработку полученных данных проводилась при помощи программного обеспечения Microsoft Office Excel 2016 и STATISTICA 10.0. Показатели представлены в виде среднего арифметического и его ошибки (M±m). Достоверность различий средних величин определяли с помощью ¿-критерия Стьюдента. Достоверность различий средних величин зависимых выборок определяли с помощью W-критерия Вилкоксона (Ж-test). Результат считали статистически достоверным при p<0,05.
Результаты исследования
В серии экспериментов на агаризованной среде показано, что без предварительной обработки
степень ингибирования бактериального роста, при использовании сетчатых имплантатов Ь-РБ и Н-РР в комбинации с ХГ, АМК и ВАН составило 3,90+0,62, 7,99+1,85, 1,38+0,25 и 3,45+0,31, 6,25+0,34, 1,44+0,65, соответственно.
В табл. 1 представлены сводные данные по коэффициенту к для сетчатых имплантатов Ь-РБ и Н-РР в различных вариантах с биоцидами в двух исследованных группах бактерий. Для имплантата Ь-РБ антибактериальный эффект показан в комбинации с ХГ как в отношении Б.аитет (к=2,97+0,73), так и Б.ер1-(1егт1&8 (к=2,68+0,55), в комбинации с АМК — для всех стафилококков (к=5,57+3,73), Б.аитет (к=6,68+4,11), но не для 8.ер1йегт1й1ъ. При экспозиции фрагмента Ь-РБ с ВАН коэффициент к был наименьшим и составил 1,35+0,68 для группы Б.аитет, 1,26+0,78 для 8.ер1йегт1й1ъ и 1,30+0,69 для всех исследованных культур. Для этого имплантата отмечена статистическая разница между вариантами ХГ/АМК и АМ К/ВАН в группах биоцидами Ь-РБ и Н-РР газонный рост культур Б-аигет и 8.аигеж+8.ер1йегт1й15, между вариантами стафилококков был как вокруг, так и в пределах ХГ/ВАН для всех групп микроорганизмов. Для им-фрагментов сеток (рис. 1). Для Б.аигеш АТСС® плантата Н-РР подавление роста бактерий в обеих 25923 значение коэффициента к, отражающего группах стафилококков выявлено как в комбина-
Таблица 1. Коэффициент кдля фрагментов сетчатых имплантатов L-PE и H-PP в комбинации с биоцидами
Группа микроорганизмов1 Вариант
ХГ AMK BAH
L-PE
S.aureus 2,97±0,73* 6,68±4,11*.** 1,35±0,68**'#
S.epidermidis 2,68±0,55* 3,72±2,18 1,26±0,78**
S.aureus + S.epidermidis 2,86±0,67* 5,57±3,73*.** 1,30±0,69**,#
H-PP
S.aureus 2,86±0,40* 3,34±2,14* 1,75±0,74*,**,#
S.epidermidis 2,67±0,48* 2,77±0,95* 1,48±0,44**,#
S.aureus + S.epidermidis 2,79±0,43* 3,13±1,79*.## 1,64±0,64**, #
Примечание. 1 - группа Б.аигеиз включала референтный и клинические штаммы (п=6), Б.ер/с/егт/сИз (п=4), Б.аигеиз + Б.ер1Сегт1С15 (п=10). * - достоверность отличий по отношению к контролю; ** - достоверность отличий по отношению к ХГ; # — достоверность отличий по отношению к АМК; ## - достоверность отличий между Ь-РБ и Н-РР в пределах варианта (1У^еБ1:).
L-PE
S. aureus АТСС S. epidermidis 454
Рис. 1. Зоны ингибирования роста бактериальных культур стафилококков, создаваемые фрагментами сетчатых имплантатов в комбинации с биоцидами: K — 0,89% NaCl (контроль); ХГ — 0,05% хлоргексидина биглюконат; AMK — амоксиклав, 100 мкг/мл: ВАН — ванкомицин 100 мкг/мл. Изображения получены с помощью системы Gel-Doc XR («Bio-Rad», США) и являются репрезентативными для каждой исследованной культуры бактерий при 24-часовом газонном росте на LB-агаре.
ции с ХГ, так и с AMK, в комбинации с ВАН — только для S.aureus (£=1,75+0,74). Для этого полимера статистическая разница отмечена между ХГ/ВАН, АМК/ВАН во всех группах микроорганизмов. Сравнивая коэффициент £ для L-PE и H-PP в аналогичных вариантах, выявлено, что он был достоверно выше для L-PE в комбинации с АМК в группе всех стафилококков (5,57+3,73 против 3,13+1,79; p=0,049). В комбинации с ХГ и ВАН достоверных отличий между сетчатыми им-плантатами не отмечено ни в одной из исследованных групп бактерий.
В экспериментах по адгезии бактерий S.aureus АТСС® 25923 и S.epidermidis 454 на поверхности имплантатов в суспензионной культуре получены следующие данные. Для L-PE в контроле число адге-зированных жизнеспособных клеток золотистого и эпидермального стафилококков на 6 ч составило 7,38E+03+4,81E+03 и 6,07E + 04 + 5,94E + 04 КОЕ/мл, соответственно (рис. 2). Через сутки их количество увеличилось до 9,24E+05+8,93E+05 и 5,22E+05+2,14E+05 КОЕ/мл и сохранялось на этом уровне в течение 48 ч, достоверно не отличаясь между культурами во все сроки. Фрагменты сетчатых имплантатов в комбинации с ХГ и АМК в течение 2 сут не были контаминированы бактериями. В варианте с ВАН клетки S.aureus и S.epidermidis адге-зировались на поверхности фрагментов уже через 24 ч (6,05E+03+5,94E+03 и 1,08E+03+0,96E+03 КОЕ/мл, соответственно), но их количество было достоверно меньше, чем в контроле. Для H-PP адгезия бактерий зарегистрирована только в группе контроля: число жизнеспособных клеток на 6, 24 и 48 ч составило, соответственно, 3,00E+03+2,79E+03, 1,62E+06+2,16E+06, 1,38Е+04+1,28E+04 КОЕ/мл для S.aureus и 1,10E+04+9,88E+03, 3,55E+05+2,51E+05, 9,03E+03+8,79E+03 КОE/мл для S.epidermidis (см. рис. 2). При сравнении двух сетчатых имплантатов
Рис. 2. Рост бактериальных культур S.aureus АТСС® 25923, S.epidermidis 454 и количество жизнеспособных клеток, адгезированных на поверхности сетчатых имплантатов L-PE и H-PP без биоцидов.
выявлено, что количество бактерий стафилококков, прикреплённых к поверхности полиэстера (L-PE) и полипропилена (H-PP), на всех сроках статистически не различалось. Необходимо отметить, что для S.aureus плотность бактериальной суспензии в динамике нарастала только в контрольном варианте (1,120+0,065 и 1,250+0,097 ед. ОП600, соответственно, для L-PE и H-PP) и в варианте с ВАН (до 0,739+0,074 ед. 0П600 для L-PE). Для S.epidermidis плотность микробной популяции в контроле достигала 1,366+0,345 и 1,260+0,103 ед. 0П600, соответственно, для L-PE и H-PP, а в варианте с ВАН она составила 0,280+0,043 ед. 0П600 для L-PE.
При моделировании условий высокого бактериального обсеменения не был использован ВАН, так как он более активен в отношении бак-
P P
H
s
в о
н а л п м
s
х ы т а ч т е с
о н
х р
е в о п а н х ы н н а в
о р
s
з е
г дг
а к,
о т е л к х ы н б о с о п с е
н
з
i0 о m
В
О
и О и
и О и
и О и
s s
в о
л
s ^
s > зе
I
О)
с
и
у с
>5
о н ь л а
S
р
е т к а б
о о чо
В
о
а д
s
£ * сто
S®
отн с
л
ce
s &
и
s s J m
ПЗ i
I1
vS о fi *
К Cû
w
* es о чо * Ln
о О о О _l_ о CD о _l_ О _l_
т w + W э т w Ш T Ш + W w ш
Tf о о сч es СЛ сл o\ о о Ln CD О Tf MD
Г-" + чсТ +1 чсТ —H —H + -H + ЧсТ
+1 H +1 +1 +1 +1 H +1 H +1
чо о es о Ln ЧО о es о о
о с, о о _l_ о О CD о CD__ О
W с0 + W т ш w Ш T W CD + W o^ ОЧ W CD*- T W
es r- о
CD° CD <N
cW С-Т -4 cW -4
+1
w
+1
X
w
+1
+1
W
w
+1
+1
X
w
s
iff1
c-d
* О СЛ * es о Ln Ln
О + О О -(- О -(-
W Ln LO * о + W 00 Ш 00 * О + W ЧО W * о О W 00 * о
о о о О о
vcT + VO ЧсТ + + + C-T +
+1 W +1 +1 W +1 +1 W W +1 W
о es о es о о in о
о CD о О CD о О CD__ CD__ о CD__
+ W CD + W Q + w CD + W 00 o^ + W CD*1 C^ + W C^
Ln —H
©0 c^
ЧсТ <N es
W
w
+1
+1
+1
X
w
+1
w
+1
+1
+1
+1
+1
+1
X
w
w
w
+1
w
+1
Si
c-3
Q. ^
о
CL I— X
о
3
о x
L
<u
и ï
ns »
<D
I ê
териальной популяции в экспоненциальной фазе роста. Суммарные результаты экспериментов представлены в табл. 2. В комбинации обоих им-плантатов с ХГ отмечена устойчивость к колонизации бактерий в течение 48 ч, за исключением варианта с использованием L-PE и суспензии S.epidermidis 454. Эффективность АМК в данных условиях оказалась существенно снижена: клетки стафилококков адгезировались на поверхности L-PE и H-PP уже через 6 ч экспозиции, кроме варианта H-PP + S.aureus. При этом необходимо отметить, что плотность бактериальной суспензии, как и число жизнеспособных клеток, образующих биоплёнку на поверхности имплантатов, оказались достоверно ниже, чем в контроле.
Наличие биоплёнки на поверхности имплан-татов L-PE и H-PP после их экспозиции в бактериальной суспензии было подтверждено данными микроскопии (рис. 3). Выявлено, что и макропористый, и микропористый сетчатые импланта-ты без предварительной обработки биоцидами подвергаются контаминации бактериями Staphylococcus. К 6 ч обнаруживаются либо единичные клетки, либо небольшие кластеры размножающихся клеток, через 24 ч на обоих им-плантатах детектировали обширные участки атакованной бактериями поверхности (рис. 3, б, е). К 48 ч бактериальная биоплёнка покрывала значительную площадь волокна (рис. 3, г, з, в, ж).
Обсуждение результатов
Бактериальная адгезия к поверхности внедрённого материала является ключевым этапом развития имплант-ассоциированной инфекции. Формирование биоплёнки на полимере и колонизация тканей перипротезной зоны ставят под угрозу эффективность системного лечения антибиотиками, а, в ряде случаев, единственной альтернативой становится частичное или полное удаление контаминированного имплантата, что увеличивает сроки выздоровления пациента и стоимость лечения [18, 22]. В связи с этим, покрытие имплантата антимикробным препаратом представляет подходящую стратегию контроля бактериальной адгезии к поверхности материала [11, 24]. В клинической практике ряда стран предложено непосредственно перед использованием пропитывать или опускать имплантат в раствор антибиотиков, таких как гентамицин или ванкомицин [25, 26]. Однако эффективность данного способа для снижения риска бактериальных осложнений окончательно не доказана и тестирование новых материалов и различных биоцидов проводится постоянно [12, 23, 27].
В представленном экспериментальном исследовании in vitro оценена адгезия и биоплёнко-образование бактерий рода Staphylococcus на хирургических сетчатых имплантатах без обработ-
Рис. 3. Изображение биоплёнки, сформированной Б.аигеш АТСС® 25923 на поверхности имплантатов Ь-РБ (верх) и Н-РР (низ): а, д — интактный сетчатый имплантат (контроль) (увеличение Х400); б, е — имплантат после экспозиции с бактериальной суспензией 24 ч (Х400); в, ж — биоплёнка (указана стрелкой) на поверхности имплантата после экспозиции с бактериальной суспензией 48 ч (Х400); г, з — биоплёнка (указана стрелкой) на поверхности имплантата после экспозиции с бактериальной суспензией 48 ч (Х1000). Окраска препарата — 0,1% генцианвиолет в течение 2 мин.
ки и в комбинации с биоцидами. В исследовании D. L. Sanders и соавт. (2013) доказано, что для развития ИОХВ достаточно бактериальной нагрузки 102 клеток/мл [28]. В экспериментах по моделированию условий бактериального обсеменения мы использовали концентрацию бактерий, значительно её превышающую (106 и 108 клеток/мл), так как подобная модель является обычной практикой для изучения бактериальной адгезии in vitro. В качестве образцов выбраны два наиболее часто используемых в хирургической практике имплантата — макропористая лёгкая сетка из полиэстера и микропористая тяжёлая сетка из полипропилена. Оба имплантата являются монофиламентными, что обеспечивает меньшую площадь контактной поверхности по сравнению с полифиламентным волокном [29]. В качестве биоцидов были взяты два антибиотика (ингибиторозащищённый широкого спектра действия — амоксиклав, активный в отношении продуцирующих пенициллиназу стафилококков, и ванкомицин, активный в отношении изолятов, резистентных к метициллину), а также антисептический препарат хлоргексидин.
Предварительные результаты, полученные на агаризованной среде, подтвердили антибактериальный эффект всех протестированных биоцидов, «сохранённых» на поверхности двух типов имплантатов. Как и следовало ожидать, при данной постановке эксперимента решающим фактором являлся размер пор фрагмента сетки. Так, коэффициент k, характеризующий степень инги-бирования роста бактерий, для L-PE и H-PP в аналогичных вариантах был достоверно выше для
L-PE в комбинации с АМК в группе всех стафилококков, и, хотя в комбинации с ХГ статистически значимо не различался, тенденция была аналогичной. Полученные результаты можно объяснить тем, что большие поры L-PE «удерживали» большее количество раствора биоцида, который затем диффундировал в агар. Интересно, что в отношении ВАН отмечен противоположный эффект — коэффициент k был выше для H-PP, что, учитывая низкую растворимость данного антибиотика, могло быть связано с большим количеством фиксированных крупнодисперсных частиц на тяжёлом имплантате.
По данным литературы, показано, что площадь поверхности и структура сетчатого имплан-тата являются существенными факторами в адгезии бактерий на его поверхности. Больший диаметр нити и малый размер пор (тяжёлые сетчатые имплантаты) статистически значимо увеличивают количество адгезированных к полимеру клеток [10]. Кроме того, известно, что определяющими факторами адгезии являются химический состав и гидрофобность атакованной поверхности [11, 26]. При этом бактерии с гидрофобными свойствами клеточной стенки, к которым относятся и стафилококки, лучше адгезируются на гидрофобных материалах [9, 30]. Учитывая, что L-PE — это углеродный полимер терефталевой кислоты, обладающий гидрофильными свойствами, а H-PP — гидрофобный термопластичный неполярным полимер, принадлежащий к классу полиолефи-нов, можно было ожидать существенную разницу в адгезии бактерий. Результаты микроскопии им-плантатов показали, что нити тяжёлого H-PP без
обработки биоцидами были практически полностью покрыты биоплёнкой S.aureus после 48 ч экспозиции фрагмента в бактериальной суспензии, тогда как площадь атакованной бактериями поверхности L-PE была не существенно, но меньше (рис. 2). Возможно, именно с гидрофобностью связана тенденция к более выраженному прикреплению стафилококков к H-PP на меньшем сроке экспозиции имплантатов в бактериальной суспензии с высокой концентрацией клеток (табл. 2). При этом оценка числа адгезированных жизнеспособных клеток на 24 и 48 ч, а также в суспензии растущих клеток в низкой концентрации во все сроки показала, что статистически значимых отличий между L-PE и H-PP выявлено не было. S. Demirer и соавт. (2001) также не обнаружили существенной разницы в уровне адгезии S.epidermidis на различных материалах имплантатов, включая полипропиленовые и полиэстеровые волокна [31]. При этом другие исследователи отмечают, что в экспериментах с различными типами импланта-тов плотность бактерий S.epidermidis в биоплёнках на полипропиленовых волокнах была меньше [32]. B. Gungor и соавт. (2010) показали, что количество клеток S.aureus, фиксированных к полиэстерово-му волокну, через 16 ч экспозиции было больше в разы, чем к полипропилену [33].
Представители различных видов и даже штаммы одного вида бактерий могут связываться с поверхностью из одного и того же материала с разной степенью активности [32]. По данным K. Aydinuraz и соавт. (2009), и золотистый и эпидермальный стафилококки (в условиях высокой концентрации бактерий, 108 клеток/мл) прикреплялись к монофиламентному полипропиленовому трансплантату в меньшей степени, чем к композитным волокнам. При этом S.epidermidis показал меньшую адгезию к монофила-ментному полипропиленовому трансплантату по сравнению с S.aureus [34]. В данном исследовании за исключением контрольного варианта H-PP через 24 ч экспозиции, достоверных отличий по адгезии клеток двух представителей стафилококков не выявлено.
В работе также выявлено ингибирование адгезии бактерий на поверхности фрагментов им-плантатов при их кратковременной экспозиции с биоцидами во всех экспериментах с суспензионной культурой. Выраженное подавление продемонстрировано при низкой плотности бактерий (что более приближено к ситуации in vivo) в вариантах с АМК и ХГ для обоих имплантатов и двух культур стафилококков. В варианте с ВАН клетки S.aureus и S.epidermidis адгезировались на поверхности сетчатых фрагментов уже через сутки, но их количество было достоверно меньше, чем в контроле. По-видимому, концентрация антибиотика оказалась недостаточной для ингибирования рос-
та бактерий, который сопровождается сдвигом рН в кислую сторону, тогда как оптимум рН действия ванкомицина — 8,0, и снижение до 6,0 резко уменьшает его эффект. Интересно, что в рандомизированном проспективном исследовании Н. Yabanoglu и соавт. (2015) показано, что замачивание монофиламентной синтетической полипропиленовой сетки в растворе ванкомицина в концентрации 10 мг/мл не привело к снижению случаев имплант-ассоциированной инфекции [35]. Авторы объясняют это нетривиальным спектром выделенных при гнойных осложнениях микроорганизмов, в котором преобладали грамот-рицательные бактерии.
Использование синтетических сетчатых им-плантатов в герниологии имеет решающее значение, когда есть предпосылки контаминирования зоны ремонта, например, при дефектах брюшной стенки, ущемленных грыжах, проколах кишечных сегментов или при открытой травме живота. Некоторые авторы считают, что применение имплантатов для закрытия дефектов брюшной стенки в условиях инфицирования возможно и оправдано по строгим показаниям [10, 14]. Примечательно, что при использовании бактериальной суспензии высокой плотности контаминация обоих имплантатов в варианте с ХГ для 8.аитеи5 не выявлена в течение 2 сут. Эффективность амоксиклава в данных условиях оказалась существенно снижена, что может быть связано с эффектом инокулюма, когда повышение плотности бактериальной популяции приводит к значительному снижению активности антибактериального вещества.
При выборе антимикробного агента для обработки сетчатого имплантата важно найти баланс между его эффективностью и токсичностью. При этом необходимо помнить, что в результате воздействия антибиотиков в субингибирующих концентрациях могут быть существенно изменены гидрофобность клеточной поверхности [36] и ад-гезивность бактерий [37]. Антибактериальные препараты, такие как амоксиклав и ванкомицин, показавшие в выбранной концентрации антибактериальные эффекты в отношении золотистого и эпидермального стафилококков, в то же время являются нетоксичными для клеток организма. Однако нужно учитывать, что широкое использование антибиотиков для профилактики ИОХВ может привести к росту количества резистентных штаммов, поэтому применение антибиотиков для обработки имплантатов должно быть ограничено [38]. В этом отношении преимущество использования хлоргексидина обусловлено дешевизной, высокой активностью в отношении различных видов микроорганизмов и отсутствием у них резистентности к препарату [39]. Возможное токсическое действие антисептика на эукариотические клетки может быть нивелировано циклическими
олигосахаридами (циклодекстрин) [40] или аллицином [23], которые могут даже усиливать его антибактериальный эффект.
Заключение
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что образование биоплёнки представляет собой универсальный механизм контаминации, который может быть реализован на различных имплантатах. Адгезия микроорганизмов является ключевым этапом «загрязнения» поверхности полимеров, проходит неспецифическую и специфическую фазы и высокочувствительна к внешним факторам. Поэтому одной из альтернатив системной антибиотикопро-филактики имплант-ассоциированной инфекции может быть местное использование биоцидов путём кратковременного погружения им-плантата в раствор антибиотика/антисептика перед установкой, что предотвратит как его контаминацию бактериями, так и окружающих тканей в операционном и раннем послеоперационном периодах.
ЛИТЕРАТУРА
1. McCann M.T., Gilmore B.F., Gorman S.P. Staphylococcus epidermidis device-related infections: pathogenesis and clinical management. J Pharm Pharmacol 2008; 60: 1551-1571.
2. Belkum A. Staphylococcal colonization and infection: homeostasis versus disbalance of human (innate) immunity and bacterial virulence. Curr Opin Infect Dis 2006; 19: 339-344.
3. Edmiston C.E., McBain A.J., Kiernan M, Leaper D.J. A narrative review of microbial biofilm in postoperative surgical site infections: clinical presentation and treatment. J Wound Care 2016, 25: 693—702.
4. Otto M. Staphylococcal biofilms. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 322: 207—228.
5. Foster T.J., Geoghegan J.A., Ganesh V.K., Hook M. Adhesion, invasion and evasion: the many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nat Rev Microbiol 2014; 12: 49—62.
6. Маянский A.H., Чеботарь ИВ. Стафилококковые биоплёнки: структура, регуляция, отторжение. Журн. Микробиол. — 2011. — №1. — С.101—108. / Mayanskij A.N, Chebotar' I.V. Stafilokokkovye bioplenki: struktura, regulyaciya, ottorzhenie. Zhurn. Mikrobiol 2011, 1: 101—108. [in Russian]
7. Clarke S.R., Foster S.J. Surface adhesins of Staphylococcus aureus. Adv Microb Physiol 2006; 51: 187—224.
8. Ерошенко Д.В., Лемкина Л.М., Коробов В.П. Адгезия бактерий Staphylococcus epidermidis 33 при действии некоторых физико-химических факторов среды. Вестник Пермского университета. Биология. — 2012. — № 1. — С.29—33 / Eroshenko D.V., Lemkina L.M., Korobov V.P. Adgeziya bakterij Staphylococcus epidermidis 33 pri dejstvii nekotoryh flziko-himicheskih faktorov sredy. Vestnik Permskogo uni-versiteta. Biologiya 2012, 1: 29—33. [in Russian]
9. Pagedar A., Singh J., Batish V.K. Surface hydrophobicity, nutritional contents affect Staphylococcus aureus biofilms and temperature influences its survival in preformed biofilms. Journal of Basic Microbiology 2010; 50: S98—S106.
10. Sanders D, Lambie J., Bond P., Moate R, Steer J.A. An in vitro study assessing the effect of mesh morphology and suture fixation on bacterial adherence. Hernia 2013; 17 (6): 779—789.
11. Ji J., Zhang W. Bacterial behaviors on polymer surfaces with organic and inorganic antimicrobial compounds. J Biomed Mater Res A 2009; 88 (2): 448—453.
12. Hook A.L., Chang C, Yang J., Luckett J., Cockayne A., Atkinson S. et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat Biotechnol 2012; 30 (9): 868—875.
13. Bay-Nielsen M, Kehlet H, Strand L, Malmstmm J., Andersen F.H., Wara P. et al. Quality assessment of 26 304 herniorrhaphies in Denmark: a prospective nationwide study. The Lancet 2001; 358 (9288): 1124—1128.
Выполненное экспериментальное исследование показало, что клетки S.aureus и S.epidermidis адгезируются на поверхности различных по структуре хирургических сетчатых имплантатов, не обработанных биоцидами, уже через несколько часов. При этом не выявлено существенного влияния на бактериальную адгезию протезной нагрузки или химического состава волокна. Учитывая, что кратковременная экспозиция имплан-татов в растворах биоцидов приводит к ингиби-рованию роста и контаминации поверхности как минимум в течение двух суток, регуляция бактериальной адгезии с использованием антибактериальных соединений может представлять простую и экономичную стратегию борьбы для снижения риска развития протезной хирургической инфекции.
Авторы выражают благодарность заведующей отдела учебно-методического и научного обеспечения ПГМУ имени академика Е. А. Вагнера, к.б.н. Чемурзиевой Н. В. за помощь в проведении микроскопии препаратов.
14. Cobb W.S., Carbonell A.M., Kalbaugh C.L., Jones Y, Lokey J.S. Infection risk of open placement of intraperitoneal composite mesh. Am Surg 2009; 75: 762—768.
15. Baucom R.B., Ousley J., Oyefule O.O., Stewart M.K., Phillips S.E., Browman K.K. et al. Evaluation of long-term surgical site occurrences in ventral hernia repair: implications of preoperative site independent MRSA infection. Hernia 2016; 20 (5): 701—710.
16. Saygun O., Agalar C., Aydinuraz K., Agalar F., Daphan C., Saygun M. et al. Gold and gold-palladium coated polypropylene grafts in a S.epider-midis wound infection model. J Surg Res 2006; 131: 73—79.
17. Aufenacker T.J., van Geldere D., van Mesdag T., Bossers A.N., Dekker B., Scheijde E. et al. The role of antibiotic prophylaxis in prevention of wound infection after Lichtenstein open mesh repair of primary inguinal hernia: a multicenter double-blind randomized controlled trial. Ann Surg 2004; 240: 955—960.
18. Sánchez-Manuel F.J., Lozano-Garcia J., Seco-Gil J.L. Antibiotic prophylaxis for hernia repair. Cochrane Database SystRev 2004; 4: CD003769.
19. Hosseini M., Heidari A. Evaluation of prophylactic antibiotic prescription in post-operative infection in patients undergone inguinal hernior-raphy surgery with prolene mesh: a randomized double blind study. Surgery Journal 2011; 6 (2): 21—25.
20. Гостев В В., Калиногорская O.C., Круглое А.Н., Сидоренко С.В. Ан-тибиотикорезистентность коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных в стационарах Санкт-Петербурга и Москвы. Антибиотики и химиотер. — 2015. — Т. 60. — № 9-10. — С.23—28. / Gostev V.V., Kalinogorskaya O.S., Kruglov A.N., Sidorenko S.V. Antibiotikorezistentnost' koagulazootricatel'nyh stafilokokkov, vydelen-nyh v stacionarah Sankt-Peterburga i Moskvy. Antibiotiki i khimioter 2015; 60 (9—10): 23—28. [in Russian]
21. Козлов P.C. Селекция резистентных микроорганизмов при использовании антимикробных препаратов: концепция «параллельного ущерба». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2010. — Т. 12. — № 4. — С. 284—294. / Kozlov R.S. Selekciya rezistentnyh mikroorganizmov pri ispol'zovanii antimikrobnyh prepara-tov: koncepciya «parallel'nogo ushcherba». Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya himioterapiya 2010, 12 (4): 284—294. [in Russian]
22. Паршиков В В., Ходак В.А., Самсонов А.А., Градусов В.П., Романов Р.В. Применение ненатяжной пластики брюшной стенки и синтетических имплантатов в условиях бактериальной контаминации. Рана и раневые инфекции. Журнал им. проф. Б.М. Костюченка. — 2014. № 2. — С. 9—15. / Parshikov V.V., Hodak V.A., SamsonovA.A., Gradusov V.P., Romanov R.V. Primenenie nenatyazhnoj plastiki bryush-noj stenki i sinteticheskih implantatov v usloviyah bakterial'noj kontam-inacii. Rana i ranevye infekcii. Zhurnal im. prof. B.M. Kostyuchenka 2014; 2: 9—15. [in Russian]
23. Pérez-Kohler B., García-Moreno F., Bayon Y., Pascual G., Bellón J.M. Inhibition of Staphylococcus aureus adhesion to the surface of a reticular heavyweight polypropylene mesh soaked in a combination of
Chlorhexidine and allicin: an in vitro study. PLOS ONE 2015; 10 (5): e012671119 pp.
24. Lakshmi S, Kumar S.S., Jayakrishnan A. Bacterial adhesion onto azidated poly (vinyl chloride) surfaces. J Biomed Mater Res 2002; 61 (1): 26—32.
25. Wiegering A., Sinha B, Spor L, Klinge U, Steger U, Germer C.T. et al. Gentamicin for prevention of intraoperative mesh contamination: demonstration of high bactericide effect (in vitro) and low systemic bioavailability (in vivo). Hernia 2014; 18: 691—700.
26. Deysine M.Infection control in a hernia clinic: 24 year results of aseptic and antiseptic measure implementation in 4,620 «clean cases». Hernia 2006; 10: 25—29.
27. Sadava E.E., Krpata D.M., Gao Y, Novitsky Y.W., Rosen M.J. Does pre-soaking synthetic mesh in antibiotic solution reduce mesh infections? An experimental study. J Gastrointest Surg 2013; 17: 562—568.
28. Sanders D.L., Kingsnorth A.N., Lambie J., Bond P., Moate R, Steer J.A. An experimental study exploring the relationship between the size of bacterial inoculum and bacterial adherence to prosthetic mesh. Surg Endosc 2013; 27: 978—985.
29. Klinge U, Junge K, Spellerberg B, Piroth C, Klosterhalfen B, Schumpelick V. Do multifilament alloplastic meshes increase the infection rate? Analysis of the polymeric surface, the bacteria adherence, and the in vivo consequences in a rat model. J Biomed Mater Res 2002; 63 (6): 765—771.
30. Van LoosdrechtM.C.M., Lyklema J., Norde W, Schraa G, Zehnder A.J.B. The role of bacterial cell wall hydrophobicity in adhesion. Appl. Environ. Microbiol 1987; 53 (8): 1893—1897.
31. Demirer S., Gegim I.E., Aydinuraz K., Ataoglu H, Yerdel M.A., Kuterdem E. Affinity of Staphylococcus epidermidis to various prosthetic graft materials. J Surg Res 2001; 99 (1): 70-74.
32. Паршиков ВВ., Чеботарь И.В., Ходак В.А., Самсонов A.A. Исследование in vitro микробной биоплёнки на поверхности синтетических макропористых имплантатов для пластики брюшной стенки. Современные технологии в медицине. — 2012. — № 1. — С. 15—20. / Parshikov V.V., Chebotar'I.V., Hodak V.A., SamsonovA.A. Issledovanie
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Кузнецова Марина Валентиновна — д. м. н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН, доцент кафедры микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВО «ПГМУ им. академика Е. А. Вагнера» Минздрава РФ, Пермь Паршаков Александр Андреевич — аспирант кафедры общей хирургии №1 ФГБОУ ВО «ПГМУ им. академика Е. А. Вагнера» Минздрава РФ, Пермь
in vitro mikrobnoj bioplenki na poverhnosti sinteticheskih makroporistyh implantatov dlya plastiki bryushnoj stenki. Sovremennye tekhnologii v medicine 2012; 1: 15—20. [in Russian]
33. Gungor B, Esen Gok A., Yilmaz H, Malazgirt Z, Leblebicioglu H. Comparison of the adherence of E.coli and S.aureus to ten different prosthetic mesh grafts: In vitro experimental study. Indian J Surg 2010; 72: 226—231.
34. Aydinuraz K, Agalar C, Agalar F, Ceken S., Duruyurek N, Vural T. In vitro S.epidermidis and S.aureus adherence to composite and lightweight polypropylene grafts. J Surg Res 2009; 157 (1): e79—86.
35. Yabanoglu H, Arer I.M., Cahskan K. The effect of the use of synthetic mesh soaked in antibiotic solution on the rate of graft infection in ventral hernias: a prospective randomized study. Int Surg 2015; 100: 1040—1047.
36. Absolom D.R. The role of bacterial hydrophobicity in infection: bacterial adhesion and phagocytic ingestion. Can J. Microbiol 1988; 34 (3): 287—298.
37. Balotescu C., Israil A.M., Lazar V., Cernat R, Petrache L.M., Dinu C. Study of antibiotic influence on adherence capacity of gram positive and gram negative bacteria to the cellular substrate Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2002; 47 (3—4): 131—135.
38. Holmes N.E., Tong S.Y., Davis J.S., Hal S.J. Treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Vancomycin and beyond. Semin Respir Crit Care Med 2015; 36: 17—30.
39. Зверьков A.B., Зузова А.П. Хлоргексидин: прошлое, настоящее и будущее одного из основных антисептиков. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2013. — Т. 15. — № 4. — С. 279-285. / Zverkov A.V., Zuzova A.P. Hlorgeksidin: proshloe, nastoy-ashchee i budushchee odnogo iz osnovnyh antiseptikov. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya himioterapiya 2013; 15 (4): 279-285. [in Russian]
40. Teixeira K, Denadai A.M., Sinisterra R.D., Cortqes M.E. Cyclodextrin modulates the cytotoxic effects of chlorhexidine on microorganisms and cells in vitro. Drug Deliv 2014; 22 (3): 444-453.
Афанасьевская Елизавета Викторовна — к. м. н., доцент кафедры микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВО «ПГМУ им. академика Е. А. Вагнера» Минздрава РФ, Пермь Самарцев Владимир Аркадьевич — д. м. н., профессор, заведующий кафедрой общей хирургии №1 ФГБОУ ВО «ПГМУ им. академика Е. А. Вагнера» Минздрава РФ, Пермь
