CC BY
39
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
18. ПетровР.В., ХаитовР.М., НекрасовА.В., АтауллахановР.И., ПучковаН.Г., Иванова А.С. Полиоксидоний - препарат нового поколения иммуномодуляторов с известной структурой и механизмом действия. Иммунология. 2000; 5: 24-8.
19. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Некрасов А.В., Мельников С.Я., Атауллаханов Р.И., Пучкова Н.Г., Михеева А.В., Иванова А.С. Способ получения вакцины против вируса гриппа. Патент № 1580617 (Российская Федерация). Приоритет: май 1988.
20. ПетровР.В., ХаитовР.М., НекрасовА.В., ИвановаА.С., Пучкова
Н.Г. Гриппозная вакцина нового поколения - Гриппол. Физиология и патология иммунной системы. 2004; 8(1): 10-26.
REFERENCES
1. Landsteiner K. The specificity of serological reactions. Cambridge, Massachusetts: Harvard University, 1946.
2. Sela M. Antigenicity: some molecular aspects. Science. 1969; 166: 1365-74.
3. Petrov R.V., Evdakov V.P., Khaitov R.M., Filatova E.D., Alekseeva N.Yu., SavinovaI.VAntigenic properties picrate polygrounds. Reports. USSR Academy of Sciences. 1977; 236(5): 1260-3 (in Russian).
4. Kabanov V.A., Mustafayev M.I., Nekrasov A.V., Norimov A.§h, Petrov R.V., Khaitov R.M., Khaustova L.I. Critical nature of the influence degree of polymerization polyelectrolytes on their immune-stimulating properties. Reports. USSR Academy of Sciences. 1984; 274(4): 998-1001 (in Russian).
5. Petrov R.V., Khaitov R.M. Artificial antigens and vaccines. M.: Meditsinf. 1988 (in Russian).
6. Petrov R.V., Man’ko VM., Egorov И.К. The different antibodyforming ability of the mice to highlyinbred lines. Reports. USSR Academy of Sciences. 1963; 153(3): 728-30 (in Russian).
7. PetrovR.V., Man’ko V.M., PanteleevE.I. Bulletin of experimental biology and medicine. 1966; 62(8): 70-4 (in Russian).
8. Benacerraf B. The genetic mechanisms that control the immune response and antigen recognition. Ann. Immunol. 1974; 1250: 143-164.
9. McDevittH.O., SelaM. Genetic control of the antibody response.
J. Exp. Med. 1965; 122: 517-31.
10. Kabanov V.A., PetrovR.V., KhaitovR.M. Artificial antigens and vaccines based on non-natural polyelectrolytes. Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol., 1984,V 5, 277-322.
11. Petrov R.V., Khaitov R.M., Ataullakhanov R.I. Immunogenetics and artificial antigens. M.; Meditsina; 1983. (in Russian).
12. Kabanov V.A., Mustafayev M.I., Norimov A.§h, Petrov R.V., Khaitov R.M. Immunogenicity complex bovine serum albumin with polycation, loaded hydrophobic side groups. Reports. AS USSSR, 1978; 243:5: 1130-3.
13. Petrov R. V., Kabanov V.A., Khaitov R.M., Nekrasov A. V., Alekseeva N.Yu., AparinP.G., Elkina S.I. Protective efficacy of conjugates of bacterial antigen with synthetic polyelectrolytes. Reports. USSR Academy of Sciences. 1983; 270(5): 1257-9 (in Russian).
14. Petrov R.V., Khaitov R.M. Immunogenes and vaccines of new generation. M.; GEOTAR-Media: 2011. (in Russian).
15. Petrov R.V., Khaitov R.M., Norimov A.S., Nekrasov A.V., Koryakin
S.A. Phenotype correction of Ir-genic control of immune response to (T,G)-A-L conjugated to synthetic polyelectrolytes. Immunol. Lett. 1986; 12: 237-42.
16. Petrov R.V., Khaitov R.M., Zhdanov VM., Sinyakov M.S., Nekrasov A.V Influenza virus antigens conjugated with a synthetic polyelectrolytes: a novel model of vaccines. vaccine. 1985; 3: 392-400.
17. Nekrasov A.V Puchkova N.G., Ataullakhanov R.I, Ivanova A.S., Khaitov R.M., Petrov R.V Derivatives ofpoly (1,4-Etilenpiperazin, have immunostimulating, antiviral and antimicrobial activity. Patent № 2073031 (Russian Federation). Priority: August 1990.
18. Petrov R.V., Khaitov R.M., Nekrasov A.V, Ataullakhanov R.I., Puchkova N.G., Ivanova A.S. Immunologiya. 2000; 5: 24-8 (in Russian).
19. Petrov R.V., Khaitov R.M., Nekrasov A.V, Mel’nikov S.Ya., Ataullakhanov R.I., Puchkova N.G., Mikheeva A.V, Ivanova A.S. A method of obtaining a vaccine against the influenza virus. Patent № 1580617 (Russian Federation). Priority: may 1988.
20. Petrov R.V., Khaitov R.M., Nekrasov A.V., Ivanova A.S., Puchkova N.G. Fiziologiya i patologiya immunnoy sistemy. 2004; 8(1): 10-26.
Поступила 13.02.13
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.411:57.034].085
М.Е. Диатроптов, М.А. Диатроптова, О.В. Макарова
ИНФРАДИАННЫЕ РИТМЫ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ СЕЛЕЗЕНКИ
у крыс-самцов линии вистар
ФГБУ НИИ морфологии человека РАМН, 117418, г Москва
Проведено исследование инфрадианных колебаний показателей морфофункциональных зон селезенки, уровня стероидных гормонов, неоптерина, TGF-pi в сыворотке крови и продукции цитокинов ИФНY, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНОа клетками селезенки, активированными конканавалином А, у крыс-самцов Вистар. Установлен синхронный 4-суточный период колебаний объемной плотности лимфоидных фолликулов и количества мононуклеаров в селезенке, их максимальные значения наблюдались на фоне низкого содержания стероидных гормонов в сыворотке крови. Уровень неоптерина в сыворотке крови также имел 4-суточную периодичность. Продукция ИЛ-2 клетками селезенки и уровень TGF-р в крови отрицательно коррелировали с концентрацией кортикостерона. Ритмические изменения этих показателей необходимо учитывать в экспериментальных и клинических исследованиях.
Ключевые слова: инфрадианныйритм, кортикостерон, цитокины, селезенка, крыса
- 185 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
M.E. Diatroptov, M.A. Diatroptova, O.VMakarova
INFRADIAN RHYTHMS OF MORPHOFUNCTIONAL CHANGES IN THE SPLEEN OF MALE WISTAR RATS
Infradian rhythms of morphofunctional changes in the spleen, steroid hormone levels, neopterin, TGF-pi in the serum and IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-a production levels by concanavalin A activated splenic cells of male Wistar rats have been studied. The volume fraction of splenic lymph nodes and mononuclear number in the spleen synchronously changed in 4-days fluctuation period. The maximum of these changes was found out when steroid hormone levels in the serum were low. The neopterin level in the serum fluctuated in 4-days fluctuation period too. The IL-2 production level by splenic cells and TGF-p in the serum negatively correlated with corticosterone level. These rhythmic changes could be taking into account in experimental and clinic researches.
Key words: infradian rhythm, corticosterone, cytokines, spleen, rat
Биологические ритмы свойственны всем уровням организации живых систем: клеточному, органному, организменному, популяционному [1]. Основное внимание современных хронобиологических и хрономедицинских исследований сосредоточено на суточных и сезонных ритмах [2]. Известно, что в зависимости от времени суток воздействие экспериментального фактора приводит к реакции иммунной системы, варьирующей в широком диапазоне [3]. В литературе описаны инфра-дианные (период > 28 ч) ритмы стероидных гормонов, регулирующих функциональное состояние иммунной системы [4, 5]. Ранее нами выявлен устойчивый 4,06-суточный ритм уровня кортизола и тестостерона в сыворотке крови мужчин [6].
Морфофункциональное состояние селезенки также ритмически изменяется. Так, у крыс в полуденные часы, когда уровень стероидных гормонов в крови минимален, численность клеток в этом органе в три раза выше, чем утром [7].
В последние десятилетия в экспериментальных исследованиях широко используется методика функциональной оценки состояния иммунной системы с помощью митогенной стимуляции продукции цитокинов в суточной культуре клеток селезенки лабораторных животных, позволяющая оценить потенциальную способность этих клеток к синтезу и секреции цитокинов [8]. Известно, что продукция провоспалительных цитокинов имеет суточную периодичность с максимумом в ночные и ранние утренние часы. Динамика уровня провоспалительных цитокинов связана с суточными колебаниями глюкокортикоидов [9].
Целью работы было исследование у крыс-самцов Вистар инфрадианных ритмов морфофункциональных изменений селезенки, уровня стероидных гормонов, неоптерина и трансформирующего фактора роста (transforming growth factor P-1 - TGF-pi) в сыворотке крови, а также продукции цитокинов клетками селезенки, активированными конканавалином А (КонА).
Материалы и методы. Работа выполнена на 104 половозрелых самцах крыс Вистар (питомник Столбовая). Масса тела животных колебалась в пределах от 200 до 240 г При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.77. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН. Крыс содержали при естественном освещении и комнатной температуре. Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира ежедневно в период с 17 по 29 марта 2011 г (n = 8), в 8-8 ч 30 мин утра по местному солнечному времени (Москва). Клетки селезенки выделяли с помощью гомогенизатора Поттера. Для индукции синтеза и секреции цитокинов суспензию клеток селезенки, содержащую 5-106 клеток на 1 мл, культивировали в ростовой среде с 5% фетальной сыворотки и добавлением КонА в конечной концентрации 5 мкг/мл в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 1 суток. Образцы сывороток и супернатанта хранили не более 6 мес при температуре -70°С.
Селезенку фиксировали в растворе Буэна в течение 24 ч, затем проводили по спиртам восходящей концентрации и заливали в парафин. Изготовляли гистологические срезы, окра-
Диатроптов М.Е. [email protected]
шивали их гематоксилином и эозином. В гистологических срезах селезенки методом точечного счета оценивали объемную долю функциональных зон под световым микроскопом, «200.
Уровень кортикостерона и неоптерина в сыворотке крови определяли ИФА наборами IBL (Германия); тестостерона -DBC (Канада); TGF-P1, ИЛ-2, -4, -6, ФНОа, ИФНу - «Bender MedSystems» (Австрия). Для регистрации результата использовали микропланшетный ИФА анализатор «ANTHOS 2010» (Австрия).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0. В соответствии с характером распределения был выбран непараметрический метод. Достоверность различий между показателями определяли по Н-критерию Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение. В динамике объемной доли лимфоидных фолликулов селезенки наблюдался 4-суточный ритм. Максимальную объемную долю лимфоидных фолликулов выявлялиь 19, 23 и 27 марта, а минимальную - 17, 21-22, 24 и 29 марта. Показатели в акрофазе и батифазе статистически значимо различались между собой (рис.1, а). Максимальное количество ядросодержащих клеточных элементов в суспензии клеток селезенки - 1376 ± 187 млн клеток на орган и оно наблюдалось в те даты, когда была максимальной объемная плотность лимфоидных фолликулов. В те дни, когда объемная плотность лимфоидных фолликулов селезенки была минимальной, количество клеточных элементов составляло 720 ± 103 млн на орган.
Максимальные значения объемной доли периартериальных лимфоидных муфт отмечены 17, 23 и 29 марта, однако небольшая продолжительность эксперимента не позволила установить период изменения этого показателя.
В динамике уровня кортикостерона и тестостерона выявлен достоверный 4-суточный период. Показатели в акрофазе и батифазе статистически значимо различались между собой. Максимальные концентрации этих гормонов наблюдались в одни и те же календарные даты: 18, 22 и 26 марта. Наиболее стабильный ритм отмечали в колебаниях уровня тестостерона. В динамике уровня кортикостерона 22 марта выявлялось повышение показателя, но различия были статистически не значимы (рис. 1, б), что, по-видимому, объясняется возмущением геомагнитной обстановки в этот период. По данным ИЗМИ-РАН на всем протяжении эксперимента геомагнитная обстановка, оцениваемая по Ар-индексу, была спокойной. Только 22-23 марта Ар-индекс составил 10, что соответствует слабой возмущенности геомагнитного поля земли. Известно, что геомагнитные бури вызывают дисхроноз у млекопитающих и человека [10], и нарушают биологические ритмы продукции мелатонина и глюкокортикоидных гормонов [5, 11].
Таким образом, максимальные значения объемной плотности лимфоидных фолликулов и количества мононуклеаров в селезенке наблюдались на фоне низкого содержания стероидных гормонов в сыворотке крови. Согласно литературным данным, при повышении уровня глюкокортикоидов в результате иммобилизации или раздражения электрическим током определяется значительное снижение ядросодержащих клеток, в основном за счет В-зависимой зоны [12]. Кор-
- 186 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Рис. 1. Динамика объемной плотности лимфоидных фолликулов селезенки (а) и уровня кортикостерона (б) в сыворотке крови у крыс-самцов Вистар (март 2011 г.).
Здесь и на рис. 2-3 малый квадрат - медиана, прямоугольник - диапазон от нижнего до верхнего квартилей (25-75%), разброс - от минимального до максимального значений.
Достоверность различий:
а -р 17-19 = 0,004;р 19-21 = 0,023;р 21-23 = 0,001;р 23-24 = 0,008;р 24-27 = 0,009;р 27-29 = 0,003 б -р 17-18 = 0,003; р 18-19 = 0,002; р 24-26 = 0,008; р 26-27 = 0,006.
Рис. 2. Динамика уровня неоптерина (а) и TGF-P1 (б) в сыворотке крови у крыс-самцов Вистар. Достоверность различий:
а -р 17-19 = 0,004;р 19-21 = 0,004;р 21-23 = 0,003;р 23-25 = 0,002;р 25-27 = 0,004;р 27-29 = 0,003. б -р 17-18 = 0,009; р 18-20 = 0,004; р 24-26 = 0,01; р 26-28 = 0,015.
тикостерон тормозит пролиферацию и индуцирует апоптоз лимфоцитов, однако такие резкие колебания численности В-лимфоцитов объясняются их миграцией из селезенки [12].
В сыворотке крови динамика уровня неоптерина, являющегося интегративным показателем активации клеточного звена иммунитета [13], имела 4-суточный период и показатели в акрофазе и батифазе достоверно различались между собой (рис. 2, а). В периоды асинхронной динамики уровня кортикостерона ритм изменения показателей неоптерина сохранялся. В работе P. Depres-Brummer и соавт. [14] показано, что при содержании крыс в условиях постоянного освещения на фоне нарушения суточных ритмов уровня катехоламинов в плазме крови, двигательной активности и температуры тела сохраняется ритмическая функциональная активность Т-лимфоцитов. Авторы сделали вывод об относительной автономности суточных ритмов функционирования иммунной системы.
Уровень TGF-P1 в сыворотке крови отрицательно коррелировал с концентрацией кортикостерона (г = -0,42) (рис. 2,
б). TGF-P1 продуцируется огромным числом клеток, включая стромальные, эпителиальные клетки, макрофаги, регуляторные Т-лимфоциты [15]. Выявленное нами снижение уровня TGF-P1 при увеличении концентрации кортикостерона в сыворотке крови можно объяснить как супрессией глюкокортикоидами синтеза индуцибельной фракции белка TGF-P1 лимфоцитами [16], так и угнетением этими гормонами его продукции другими клетками [17].
Динамика уровня ИЛ-2 в суточной культуре клеток селезенки, активированных КонА, коррелировала отрицательно с уровнем кортикостерона в сыворотке крови (коэффициент корреляции г = -0,59) (рис. 3, а). Этот факт можно объяснить как угнетающим действием кортикостерона на синтез провоспалительных цитокинов путем ингибирования активации фактора транскрипции NF-kB [18], так и возможным изменением иммунофенотипического состава клеток селезенки.
В динамике уровня продукции ИФНу в суточной культуре клеток селезенки, активированных КонА, статистически
- 187 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
Рис. 3. Динамика уровня продукции ИЛ-2 (а) и ИФН-у (б) в культуральной среде клеток селезенки крыс-самцов Вистар, активированных конканавалином А.
Достоверность различий:
а -р 17-18 = 0,004; р 18-19 = 0,035; р 24-26 = 0,013; р 26-28 = 0,003; б -р 17-20 = 0,025; р 20-22 = 0,003; р 22-24 = 0,01.
значимо выявлялся 4-суточный период (рис. 3, б), находящийся в противофазе с уровнем стероидных гормонов. Продукция ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНОа не коррелировала с уровнем кор-тикостерона, однако наблюдались достоверные изменения в динамике этих показателей, но ритма на протяжении эксперимента не удалось выявить. Секреция цитокинов клетками иммунной системы контролируется не только глюкокортикоидами, но и множеством других механизмов эндокринной и нервной регуляции, а также ауторегуляцией, реализуемой с участием факторов самой иммунной системы. Известны десятки рецепторов клеток иммунной системы для гормонов и нейроэндокринных факторов, таких как тироксин, инсулин, соматотропный гормон, пролактин, половые стероидные гормоны, а- и Р-эндорфины, катехоламины, адренергические и холинэргические нервные стимулы [15].
Таким образом, у половозрелых крыс-самцов Вистар установлен синхронный 4-суточный период колебаний объемной плотности лимфоидных фолликулов и количества монону-клеаров в селезенке. Максимальные значения объемной плотности лимфоидных фолликулов и количества мононуклеаров в селезенке наблюдались на фоне низкого содержания стероидных гормонов в сыворотке крови. Динамика уровня неопте-рина в сыворотке крови имеет также 4-суточный период. Секреция ИЛ-2 клетками селезенки, активированными КонА, и уровень TGF-P1 в сыворотке крови коррелируют отрицательно с концентрацией кортикостерона. Уровень продукции ИФНу имел слабую отрицательную корреляцию, а секреция ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНОа не коррелировала с уровнем кортикостерона в сыворотке крови. Полученные данные необходимо учитывать при проведении экспериментальных исследований с оценкой функционального состояния эндокринной и иммунной системы и трактовке их результатов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Комаров Ф.И., Рапопорт С.И. Хронобиология и хрономедицина. М.: Медицина; 2000.
2. Деряпа Н.Р., Мошкин М.П., Посный В.С. Проблемы медицинской биоритмологии. М.; 1985.
3. Шурлыгина А. В., Дергачева Т. И., Ковшик И. Г. и др. Клеточный состав лимфоидных органов крыс-самок с экспериментальным острым воспалением внутренних половых органов после введения интерферона-гамма в разных суточных режимах. Иммунология. 2008; 2: 114-6.
4. Диатроптов М.Е. Инфрадианные колебания уровня тестостерона в сыворотке крови лабораторных крыс-самцов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011; 5: 577-80.
5. Jozsa R., Olah A., Cornelissen G. et al. Circadian and extracircadian exploration during daytime hours of circulating corticosterone and other endocrine chronomes. Biomed. Pharmacother. 2005; 59(1): 109-16.
6. Диатроптов М.Е. Инфрадианный ритм изменения уровня стероидных гормонов и рецепторного антагониста интерлейкина-1 у мужчин зрелого возраста. Иммунология. 2011; 6: 324-27.
7. Литвиненко Г.И., Вербицкая Л.В., Тараданова Л.В. и др. Влияние амитриптилина на суточные колебания клеточного состава органов иммунной системы у крыс при экспериментальном де-синхронозе. Бюллютель экспериментальной биологии и медицины. 2000; 11: 589-92.
8. Palumbo M.L., Canzobre M.C., Pascuan C.G. et al. Stress induced cognitive deficit is differentially modulated in BALB/c and C57Bl/6 mice: correlation with Th1/Th2 balance after stress exposure. J. Neu-roimmunol. - 2010; 218(1-2): 12-20.
9. Straub R.H., Cutolo M. Circadian rhythms in rheumatoid arthritis: implications for pathophysiology and therapeutic management. Ar-thr. and Rheum. 2007; 56 (2): 399-408.
10. Чибисов С.М., ФроловВ.А., Агаджанян Н.А. и др. Влияние гелиогеофизических факторов на биоритмы человека // Успехи современного естествознания. 2006; 9: 21-8.
11. O’ConnorR.P., PersingerM.A. Increases in geomagnetic activity are associated with increases in thyroxine levels in a single patient: implications for melatonin levels. Int. J. Neurosci. 1996; 88(3-4): 243-7.
12. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. - М., 1983.
13. ЯгловаН.В., Березов Т.Т. Роль тиреотропного гормона в изменении гормонального и цитокинового профиля при экспериментальном синдроме нетиреоидных заболеваний. Иммунология. 2010; 3: 146-51.
14. Depres-Brummer P., Bourin P., Pages N. et al. Persistent T lymphocyte rhythms despite suppressed circadian clock outputs in rats. Am. J. Physiol. 1997; 273(6, 2): 1891-9.
15. Ярилин А.А. Иммунология. М.; 2010.
16. Baumgartner R.A., Deramo V.A., Beaven M.A. Constitutive and inducible mechanisms for synthesis and release of cytokines in immune cell lines. J. Immunol. 1996; 157(9): 4087-93.
17. Batuman O.A., Ferrero A., Cupp C. et al. Differential regulation of transforming growth factor beta-1 gene expression by glucocorticoids in human T and glial cells. J. Immunol. 1995; 155(9): 4397-405.
18. Roumestan C., Gougat C., Jaffuel D., Mathieu M. Glucocorticoids and their receptor: mechanisms of action and clinical implications. Rev. Med. Interne. 2004; 25(9): 636-47.
Поступила 21.05.12
- 188 -
