CC BY
42
© СУХАНОВ А.В., ПИКЕРСКИИ И.Э., ИГНАТОВ А.В., СЕРЕБРЕННИКОВА Е.Н., МЕНЬШИКОВАЛ.В.
- 2007
ИНФОРМАТИВНОСТЬ ДЫХАТЕЛЬНОГО УРЕАЗНОГО ХЕЛИК®-ТЕСТА В ОПРЕДЕЛЕНИИ СТЕПЕНИ ОБСЕМЕНЁННОСТИ HELICOBACTER PYLORI И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА. СООБЩЕНИЕ 6. СРАВНЕНИЕ С МОЛЕКУЛЯРНЫМ МЕТОДОМ
А.В. Суханов, И.Э. Пикерский, А.В. Игнатов, Е.Н. Серебренникова, Л.В. Меньшикова
(Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр, гл. врач — к.м.н. М.Л. Меньшиков; Иркутский государственный университет, ректор — д.х.н., проф. А.И. Смирнов; Институт географии СО РАН, директор — д.г.н. А.Н. Антипов; Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. А.А. Дзизинский, кафедра семейной медицины, зав. — д.м.н., проф. Л.В. Меньшикова)
Резюме. Проведено сравнительное исследование результатов уреазного дыхательного Хелик®-теста и определения ДНКH. руюп в слизистой оболочке желудка у 50пациентов с использованием двух статистических методов: корре-ляционнго и регрессионного анализов. Совпадений показателей не получено ни при проведении корреляционного, ни при использовании регрессионного статистических методов. Делается вывод о низкой диагностической ценности дыхательного уреазного Хелик*-теста по методике фирмы АМА.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, дыхательный уреазный Хелик®-тест, ПЦР диагностика.
Известно, что наиболее частой причиной возникновения гастритов и язвенной болезни является микроорганизм Helicobacter pylori (H. pylori) — Природные резервуары этого возбудителя не выявлены, а вне организма H. pylori приобретает устойчивую кокковидную форму и реверсирует в вибрион только в желудке [8,9,12,13].
Для уточнения этиологии заболеваний желудка и двенадцатипёрстной кишки необходимо установить наличие этого возбудителя. С этой целью были разработаны различные методы выявления H. pylori, основанные на биохимических и морфологических особенностях этого микроорганизма.
Известно, что H. pylori обладает выраженной уреаз-ной активностью. Бактериальная уреаза разлагает мочевину до углекислого газа и аммиака. Эта особенность метаболизма легла в основу разработки различных не-ивазивных методов определения H. pylori, получивших название «уреазные тесты». Широкое распространение в большинстве стран мира получили уреазные дыхательные тесты с мочевиной, меченной изотопами углерода 13С и 14С [11]. Данный изотоп, входящий в состав мочевины, при разложении последней выделяется в составе углекислого газа через лёгкие с возможностью его последующей регистрации в выдыхаемом воздухе.
Существует и другой метод оценки уреаз-ной активности H. pylori — регистрация аммиака, образующегося при гидролизе мочевины (Хелик®-тест) [5].
Дыхательные уреазные тесты имеют как положительные, так и отрицательные стороны. Основная ценность этих методов заключается в том, что исследователь имеет представление об уреаз-ной активности всей поверхностности слизистой оболочки желудка (СОЖ), а не отдельных её фрагментов.
Недостаток уреазных тестов заключается в том, что эти методы косвенные, не позволяющие обнаружить возбудителя непосредственно [7].
Целью настоящего исследования является сравнительное изучение информативности дыхательного уре-азного Хелик®-теста по методике фирмы АМА и определения ДНК H. pylori в биоптате СОЖ.
Материалы и методы
Исследование проводилось на базе Иркутского областного клинического консультативно-диагностического центра.
В исследование было включено 50 пациентов, обратившихся в ИОККДЦ с различными диспептическими жалобами. Всем обследуемым проводился общеклинический осмотр, эндоскопическое исследование с забором биопта-тов СОЖ для выявления нуклеиновых кислот возбудителя с помощью метода ПЦР и уреазный дыхательный Хелик®-тест с использованием расходных материалов и оборудования фирмы АМА (г. Санкт-Петербург).
Возраст обследуемых пациентов варьировался от 13 до 75 лет и составлял в среднем 37+8 лет. Основной диагноз, установленный в ходе эндоскопического и морфологического обследования, — хронический поверхностный гастрит, встречался у 48 (96%) пациентов, у остальных 2 (4%) — диагностирована язвенная болезнь двенадцатипёрстной кишки.
Всем испытуемым проводился дыхательный уреазный Хелик®-тест с использованием мочевины нормального изотопного состава. Методика данного исследования была следующей: у пациента в течение 5 минут с помощью микрокомпрессора забирался воздух ротовой полости и продувался через капилляр, содержащий индикатор, нанесённый на силикагель. Затем внутрь давался раствор, содержащий 0,5 г мочевины нормального изотопного состава в 15 мл воды. После 5-ти минутной экспозиции повторялся забор воздуха из ротовой полости. При наличии в последнем аммиака, индикатор менял цвет с жёлтого на тёмносиний. По величине изменения цвета, измеренной в миллиметрах, Хелик®-тест оценивался как отрицательный —
Таблица 1
Статистические характеристики изучаемых параметров
Переменная Число Среднее Стандартное
измерений значение отклонение
Уреазный тест 50 1,15 0,33
ПЦР ДНК H. pylori 50 0,7 0,46
если не было разницы между выраженностью окрашивания индикатора до и после приёма мочевины (0 баллов), слабоположительный — если разница составляла 1 -2 мм (1 балл), положительный — при разнице 3-10 мм (2 балла) и резко положительный — при разнице более 10 мм (3 балла).
ПЦР -диагностика выдаёт только отрицательные или положительные результаты, которые выражались в баллах: 0 или 1 соответственно.
Методы исследования взаимозависимости переменных Для изучения взаимосвязанности контролируемых характеристик были применены методы корреляционного и регрессионного анализа. Вычисление коэффициентов корреляции, оценка их точности и статистической значимос-
ти проводилась по стандартным формулам [3] с помощью программы «Excel» из пакета «Microsoft Office 2000».
Для оценки поведения условных средних (регрессий) их зависимость от своих аргументов аппроксимировалась кусочно-линейными кривыми. Для этого область изменчивости аргументов разбивалась на несколько равных интервалов, и в каждом из них вычислялись среднее значение аргумента и функции. Далее через точки, задаваемые такими средними значениями, проводились соответствующие ломаные линии. Все необходимые вычисления и построения графиков выполнялись с помощью программы, написанной одним из авторов настоящей статьи [2]. Числа, записываемые в месте положения вершин ломаных линий, аппроксимирующих регрессию, означают объем выборки, использованный для вычисления соответствующих условных средних. Статистически значимое изменение этих средних на области изменения их аргументов позволяет судить о наличии и приблизительной структуре регрессионной зависимости между соответствующими переменными.
Корреляционный анализ
Задачей корреляционного анализа является проверка гипотез о наличии взаимосвязей линейного характера между исследуемыми характеристиками. Для решения этой задачи были оценены коэффициенты корреляции между всеми переменными и их вариабельность.
Таблица 2
Коэффициент корреляции (выше диагонали) и его коэффициент вариации (ниже диагонали)
Наименования и обозначения переменных Х5 Х7
Уреазный Хелик®-тест 0,09
ПЦР НР 158
Между сравниваемыми показателями значимой корреляционной (линейной) связи не наблюдается: коэффициент корреляции г = 0,09 (табл. 2).
Коэффициент корреляции лишь частично, и из-за этого не всегда правильно, описывает взаимосвязанность переменных. Поэтому для подтверждения и уточнения выводов, сделанных на основе корреляционного анализа был проведен их взаимно-регрессионный анализ, задачей которого является проверка гипотез о наличии парных взаимозависимостей между оцениваемыми параметрами и взаимосвязей линейного характера между исследуемыми характеристиками.
Регрессионный анализ Результаты регрессионного анализа парных взаимозависимостей между оцениваемыми параметрами в виде графика условных средних, построенных в соответствии с описанной выше методикой, показаны на рисунке 1.
3
3
+
3
3
J +
3
'
□
О.ОО+ОО Х5 3.00+00
Примечание: статистически достоверными считаются показатели, когда различия между начальными и конечными точками графика превышают две клетки по вертикали. Рис. 1. Регрессионная зависимость результатов уреазного Хелик®-теста от данных обнаружения ДНК Н. pylori.
Приведенные данные подтверждают вывод об отсутствии соответствия между уреазным Хелик®-тестом и результатами ПЦР диагностики ДНК Н. pylori в биоптатах СОЖ, полученными как методами корреляции, так и вариационной статистики. Подобная демонстрация отсутствия связей нелинейного характера и корреляции указывает на низкую диагностическую информативность уреаз-ного Хелик®-теста.
Результаты и обсуждение
Зависимость результатов уреазного теста от показателей обнаружения ДНК Н. pylori в СОЖ не выявляется.
При проведении регрессионного анализа также выяснено, что нет никакой связи между выраженностью уреазного Хелик®-теста и данными молекулярной диагностики. В литературе мы не обнаружили развернутых и достаточно аргументированных работ по изучению Хелик®-теста независимыми исследователями, кроме патента и статей его авторов [4,5,6].
Почему уреазный Хелик®-тест с мочевиной нормального изотопного состава (по технологии АМА), в отличие от уреазных тестов с изотопно-обогащённой мочевиной, даёт показания биохимической активности Н. pylori, которые не коррелируются с данными других методов диагностики Н. pylori'?
Как мы считаем, ответ необходимо искать в химизме протекающих процессов.
Известно, что в водной среде, под действием уреа-зы Н. pylori, мочевина разлагается:
N2H4CO ^ CO2t + 2NH3t.
Когда уреазный тест проводится по общепринятой в мировой практике схеме с изотопно обогащённой мочевиной 13С или 14С, то степень обсеменённости Н. pylori определяется по количеству образовавшегося меченого СО2. Этот углекислый газ практически не вступает в химические реакции в организме и полностью выделяется через лёгкие, и таким образом фиксируется количественно, однозначно свидетельствуя об уреазной активности.
Уреазный Хелик®-тест, выполняемый по методике фирмы АМА, основан на определении количества выделившегося в желудке и попавшего в ротовую полость аммиака.
Во время проведения теста общее количество зафиксированного аммиака всегда значительно ниже «стехи-ометрически возможного». Поэтому возникает вопрос: что может влиять на степень выделения аммиака.
На наш взгляд существует не один, как утверждают авторы уреазного Хелик®-теста [5], а целый ряд факторов [10].
Во-первых, в желудке практически всегда имеется стехиометрически избыточное количество соляной кислоты, следовательно, обязательно должна иметь место реакция нейтрализации, протекающая с большой скоростью:
NH3 + HCl ^ NH4Cl.
Во-вторых, необходимо учитывать, что аммиак, имеющий свободную электронную пару, способен кроме химического вступать и в донорно-акцепторные взаимодействия и образовывать различные соединения с органическими веществами, в избытке имеющимися в желудке в результате естественного слущивания клеток эпителия, выделения секрета многочисленными железами СОЖ.
Таким образом, дополнительно к предыдущему, мо-
гут иметь место следующие реакции с участием аммиака:
1. с карбонильными группами с образованием ими-нов или оснований Шиффа;
2. с карбоновыми кислотами с образованием аммонийных солей;
3. с аминокислотами с образованием аммонийных солей;
4. с липидами, с частичным гидролизом;
5. с фосфолипидами без гидролиза;
6. с фосфолипидами с частичным гидролизом;
7. с гидрохлорной кислотой (НСЮ), генерируемой нейтрофилами, с образованием цитотоксичных гидро-ксиамина (МН2ОН) и монохлорамина (МН2С1) [1].
Учитывая вышесказанное, становится понятным, что на количество аммиака, выделяемого при уреазном Хелик®-тесте с мочевиной нормального изотопного состава, влияет гораздо большее число факторов, чем на регистрируемый углекислый газ при уреазном дыхательном тесте с изотопно обогащённой мочевиной.
Для того чтобы концентрации исходного аммиака и суммарно определённого были равны ([NH^ ^ =
[NH ] ), необходимо создать в желудке,
L ^суммарно определённой7 - 1
пищеводе и ротовой полости условия, сходные с химической колбой, где среда нейтральная, отсутствуют влага и любые органические соединения. Понятно, что соблюсти подобные условия in vivo невозможно, а, следовательно, дыхательный уреазный Хелик®-тест фирмы АМА не может быть рекомендован для определения степени обсеменённости СОЖ Н. pylori.
Таким образом, методами математической статистики с использованием корреляционного и вариационного анализа показано что результаты уреазного Хе-лик®-теста по методике фирмы АМА не совпадают с результатами молекулярной диагностики ДНК Н. pylori в биоптатах СОЖ. Дыхательный уреазный Хелик®-тест с фиксацией аммиака в воздухе ротовой полости не может быть рекомендован для диагностики хеликобак-терной инфекции у человека.
INFORMATIVITY OF RESPIRATORY UREASE HELIC®-TEST IN DEFINITION OF DEGREE OF DISSEMINATION WITH HELICOBACTER PYLORI AND PATHOLOGICAL CHANGES IN CTOMACH MUCOUS MEMBRANE: COMPARISON WITH THE MOLECULAR METHOD
(REPORT 6)
A.V. Sukhanov, I.E. Pikersky, A.V. Ignatov, E.N. Serebrennikova, L.V. Menjshikova (Irkutsk Regional Diagnostic Center; Irkutsk State University; Institute of Geography of Siberian Department of Russian Academy of Science; Irkutsk State Institute for Medical Advanced Studies)
There has been conducted the comparative investigation of the results of respiratory urease Helic®-test and definition of DNA of H. pylori in the stomach mucous membrane in 50 patients with the use of two statistical methods: correlational and regressive analyses. In conducting correlational and regressive statistical methods there have not been obtained any coincidences of indices. The conclusion has been made of a little diagnostic value of respiratory urease Helic®- test on the methods of AMA Firm.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А.Морфологи-ческая диагностика болезней желудка и кишечника. — М.: Триада-Х, 1998. — С. 113-119.
2. Игнатов А.В. Опыт вероятностного моделирования и анализа взаимозависимости многомерных географических данных // География и природные ресурсы. — 1996. — № 4. — С. 149-158
3. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике. — М.: Наука, 1978. — 831 с.
4. Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., Клочко О.Г. и др. Непрерывная регистрация концентрации аммиака в воздухе ротовой полости в диагностике инфекции Helicooacter pylori // Рос. журнал гастроэнтерол., гепа-тол. и колопроктол. — 2003. — Т.Х111, № 5, Приложение № 21. — С. 159.
5. Корниенко Е.А., Милейко В.Е. Способ неинвазивной диагностики хеликобактера ин виво, RU 2100010 С1.
6. Корсунский А.А., Щербаков П.Л., Исаков В.А. Оценка информативности и рациональный выбор методов выявления Helicobacter pylori при хронических болезнях органов пищеварения у детей // В кн. Хеликобак-териоз и болезни органов пищеварения у детей. — М.: ИД Медпрактика-М, 2002. — Глава 5. — С.105-124.
7. Лапина Т.Л. Основные принципы диагностики H. pylori // Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии
/ Под ред. В.Т. Ивашкина, Ф. Мегро, Т. Л. Лапиной. — М.: Триада-Х, 1999. — С.107-116.
8. Логинов А.С., Васильев Ю.В., Касьяненко В.И., Зелени-кин С.А. Уреазные тесты быстрого определения хели-кобактер пилори в биоптате слизистой оболочки желудка как один из методов контроля результатов лечения больных язвенной болезнью // Рос. гастроэнтеролог. журнал. — 1997. — № 1. — С.19-23.
9. Логинов А.С., Васильев Ю.В., Сиваш Э.С., Фарбер А.В. Диагностика и лечение пенетрирующих язв желудка и двенадцатипёрстной кишки // Тос. гастроэнтеролог журнал. — 1996. — № 3. — С.20-29.
10. Тюкавкина И.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия: Учебник. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1991. — 528 с.
11. Atherton J. С. Non-endoscopic test in the diagnosis of Helicobacter pylori infection // Aliment. Pharmacol. Ther.
— 1997. — Vol. 11 (Suppl. 1). — P. 11-20.
12. Battaglia G, DiMario K, Pasini M. et al. Helicobacter pylori infection, cigarette smoking and alchogol cunsumption. A histological and clinical study on 286 subjects // The Italian Journal of Gastroenterology. — 1993. — Vol.25. — № 8. -P.419-424.
13. Gilvarry J. M, Leen E., Sweeney E., О ’Morain C.A. The Longterm effect of Helicobacter pylori on gastric mucosa // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. — 1994. — Vol.6. — P.43-45.
