CC BY
0ОНКОЛОГИЯ
г™ЙРЛЧ "
УДК: 576.5
ИНФОРМАТИВНОСТЬ БЕЛКОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВЫ И ШЕИ
А. Ю. Максимов, В. Г. Воловик, А. А. Демидова, А. Б. Альникин, А. С. Гончарова, Д. С. Щепляков
Аннотация. В статье установлен характер изменения фибронектина в опухолевом гомогенате на экспериментальной модели рака слизистой оболочки органов ротовой полости (РСООРП) с продолженным ростом в зависимости от объема опухолевого поражения нижней челюсти. Имплантация титановых скаффолдов с к леточными культурами РСООРП от доноров-пациентов была проведена 15 самцам иммунодефицитных мышей линии Balb/c Nude в область сегментарного дефекта надкостницы нижней челюсти. Опухолевый материал получали от трех пациентов с III и IV стадиями заболевания. При определении объемов ортотопических ксе-нографтов у мышей проводили измерение их линейных размеров. Для этого осуществляли процедуру компьютерной томографии с кратностью каждые 5 дней, начиная с 20-х
и до 60-х суток после имплантации. Содержание онкомаркера фибронектина в опухолевом гомогенате определяли методом иммуноферментного анализа. При имплантации животным первичных клеточных линий от донора с IV стадией заболевания РСООРП в ксенографте происходит активация мезенхимального маркера фибронектина с повышением его концентрац ии в опухолевом гомогенате. При IV стадии РСООРП усиление экспрессии фибронектина в опухолевой ткани способствует увеличению опухолевой массы, что может обусловливать продолженный рост опухоли и ее реци-дивирование.
Ключевые слова: опухоли головы и шеи, рак слизистой оболочки органов ротовой полости, белки внеклеточного матрикса, модель продолженного роста опухоли, фибронектин.
INFORMATIVITY OF EXTRACELLULAR MATRIX PROTEINS FOR ASSESSING THE PROGRESSION OF HEAD AND NECK TUMORS
A. Yu. Maksimov, V. G. Volovik, A. A. Demidova, A. B. Alnikin,
A. S. Goncharova, D. S. Shcheplyakov
Annotation. The article establishes the nature of changes in fibronectin in the tumor homogenate in an experimental model of cancer of the oral mucosa (COM) with continued growth depending on the volume of tumor lesions of the lower jaw. Implantation of titanium scaffolds with COM cell cultures from patient donors was carried out in 15 male immunodeficient Balb/c Nude mice in the area of a segmental defect in the periosteum of the mandible. Tumor material was obtained from three patients with stages III and IV of the disease. When determining the volumes of orthoptic xenografts in mice, their linear dimensions were measured. For this purpose,
a computed tomography procedure was performed every 5 days, starting from 20 to 60 days after implantation. The content of the tumor marker fibronectin in the tumor homogenate was determined by enzyme immunoassay. When primary cell lines from a donor with stage IV COM disease are implanted into animals, the mesenchymal marker fibronectin is activated in the xenograft with an increase in its concentration in the tumor homogenate. In stage IV COM, increased expression of fibronectin in tumor tissue contributes to an increase in tumor mass, which can cause continued tumor growth and recurrence.
Keywords: head and neck tumors, cancer of the oral mucosa, extracellular matrix proteins, model of continued tumor growth, fibronectin.
Взаимодействие опухолевых клеток с внеклеточным матриксом (ВКМ) и клетками, инфильтрирующими опухолевую ткань, во многом определяет прогрессирование опу холи, ее чувствительность к химиотерапевтическим препаратам. Молекулярный состав ВКМ злокачественных опухолей динамично изменяется [1]; он представлен различными белками, включая коллагены разных типов, эластин, фибронектин, виментин и многие другие [2]. Структурная роль у ВКМ основная, но далеко не единственная. ВКМ опухолевой ткани выполняет трофическ ую функцию, регулирует миграцию клеток, их подвижность, межклеточную передачу сигналов, участвует в созда
нии ниши стволовых клеток опухоли [3]. ВКМ злокачественной опухоли отличается от ВКМ нормальной ткани по архитектуре и составу, в т. ч. белковому [3].
Клеточный нерастворимый фибронектин — основной компонент внеклеточного матрикса, его количество резко увеличивается при раковых заболеваниях [4]. Фибронектин играет важную роль в таких процессах, как клеточная адгезия, пролиферация, клеточная подвижность, дифференцировка и апоптоз [5]. Дополнительный домен A фибронектина повышает его сродство с интегринами, что лежит в основе усиления подвижности клеток и пролиферации [5].
Клеточные модели опухолей, полученных от больных, на 3D-скаффолдах (конструкции
для контролируемой доставки веществ) включают молекулы ВКМ [6]. Культуры клеток, выращиваемые в 3D-формате на скаффолдах, гистологически схожи с биопсийными препаратами, полученными от пациентов [7], они воссоздают тканевую архитектуру и характерные клеточные взаимодействия раковых клеток с иммунными, стромальными клетками и ВКМ. В работе M. Liu и соавт. показано, что при культивации на коллагеновых гидрогели-евых каркасах клеточных линий рака яичников OV-NC и OV-206 опухолевые клетки превращались в многоклеточные сфероиды.
!<^ЖРАЧ “ ОНКОЛОГИЯ
При проведении оценки маркеров эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) в ткани опухоли было обнаружено увеличение экспрессии виментина, фибронектина и N-кадгерина [8].
Анализ клеток, находящихся внутри скаффолда, затруднен и в ряде случаев невозможен без нарушения его трехмерной структуры [9]. Микроскопические методы применимы при работе с 2D-, но не 3D-культурами клеток [10]. Клетки, выращиваемые на носителе, как правило, образуют компактные кластеры. Лабораторное определение белков ВКМ в клеточных линиях опухоли перспективно для изучения вклада молекул ВКМ в прогрессирование злокачественного заболевания. Для пациентов с опухолями головы и шеи характерны показатели высокой смертности, рецидивирования и метастазирования [11]. Оценить вклад молекул ВКМ в прогрессирование злокачественных заболеваний опухолей головы и шеи важно не только с патогенетической, но и с практической стороны, поскольку от понимания влияния опухолевого окружения на прогрессирование злокачественного заболевания зависит стратегия лекарственного воздействия, тактика проведения таргетной терапии.
Цель работы — оценить характер изменения фибронектина в опухолевом гомогенате на экспериментальной модели рака слизистой оболочки органов ротовой полости с продолженным ростом в зависимости от объема опухолевого поражения нижней челюсти.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На первом этапе создавали первичные клеточные культуры рака слизистой оболочки органов ротовой полости (РСООРП) согласно стандартному протоколу [12]. Опухолевый материал получали от трех пациентов с III и IV стадиями заболевания, после чего опухолевые клетки культивировали на титановых скаффолдах с модификацией поверхности ионами серебра для улучшения адгезивных свойств конструкций. На втором этапе создавали модель опухолевого поражения нижней челюсти на иммунодефицитных мышах и охарактеризовали изменения содержания онкомаркера фибронектина в опухолевом гомогенате.
Донорами опухолевого материала стали трое пациентов с опухолевым поражением нижней челюсти в результате продолженного роста РСООРП. От больных было получено письменное согласие на передачу биологического материала. Характеристика пациентов-доноров представлена в таблице 1.
Титановые скаффолды помещали в отдельные секции 96-луночно-го планшета без адгезивного слоя и высевали 1х106 клеток в 120 мкл каждой из полученных первичных клеточных линий РСООРП. Культивацию полученных линий на скаф-фолдах проводили в инкубаторе при температуре 37 °C с содержанием CO2 5 %.
Имплантация титановых скаф-фолдов была проведена 15 самцам иммунодефицитных мышей линии Balb/c Nude в область сегментарного дефекта надкостницы нижней челюсти. Животных содер
жали в SPF-виварии в системе искусственно вентилируемых клеток с соблюдением режима день/ночь. Работа с животными осуществлялась в соответствии с Правилами проведения работ с экспериментальными животными.
Мышей наркотизировали путем проведения процедуры премедикации внутримышечной инъекцией 1,5 мл/кг ксилазина (Interchemie werken «De Adelaar» B.V., Нидерланды) в концентрации 20 мг/мл. Через 15 мин внутримышечно вводили водный раствор золетил 50 (Virbac, Франция) в концентрации 22,57 мг/мл. Титановый скаффолд устанавливали в костный дефект, фиксировали к кости, обвивая тело нижней челюсти нитью и завязывая узел.
В зависимости от донора опухолевого материала выделяли три клеточные линии: КК1 (от первого донора), КК2 (от второго донора) и КК3 (от третьего донора). При определении объемов ортоптиче-ских ксенографтов у мышей проводили измерение их линейных размеров. Для этого осуществляли процедуру компьютерной томографии в высоком разрешении с помощью прибора Quantum GX2 (Perkin Elmer, США) с кратностью каждые 5 дней, начиная с 20-х и до 60-х суток после имплантации.
После выведения животных из эксперимента для приготовления гомогената забирали фрагмент опухоли объемом около 8 мм3. Опухолевую ткань помещали в питательную среду DMEM-F12 для инкубирования при температуре 37 °С в течение 72 ч. Далее проводили центрифугирование при 2000 оборотах в минуту в течение 15 мин.
Таблица 1
Характеристика доноров опухолевого материала
Пациент Стадия Ортопантомография Точка взятия материала Объем опухолевого фрагмента (мм3)
Мужчина, 72 года T3N0M0 Распространение опухолевой инфильтрации по слизистой оболочке дна полости рта. Близость края опухоли к нижней челюсти Граница поражения костной и мягкой ткани 7*7*7
Мужчина, 69 лет T3N1bM0 Распространение опухоли на альвеолярный отросток нижней челюсти с костной деструкцией Мягкие ткани, окружающие альвеолярный отросток 7*7*7
Мужчина, 64 года T4N2bM1 Распространение опухоли на кость нижней челюсти с глубокой деструкцией губчатой костной ткани без четких границ Мягкие ткани, окружающие тело нижней челюсти 7*7*7
www.akvarel2002.ru
ОНКОЛОГИЯ
о
Сутки эксперемента
КК2
КК3
Рис. 1. Динамика роста первичных клеточных линий в челюсти при имплантации клеток на скаффолде
В супернатантах после осаждения клеток опухоли методом твердофазного иммуноферментного анализа определяли концентрацию фибронектина. С этой целью использовали набор реагентов ProCon фибронектин (ТОО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург).
Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 12.0 (StatSoft Inc.,
США) с расчетом медианы, межквартильного диапазона, сравнения изменения зависимых и независимых показателей с помощью критериев Вилкоксона и Манна — Уитни соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Средние значения объемов ксе-нографтов, созданных путем имплантации титановых скаффолдов с полученными первичными клеточ
ными линиями РСООРП, продемонстрированы в таблице 2.
При проведении мониторинга состояния животных-опухоленосите-лей для всех групп была показана 100 % выживаемость.
При определении средних значений объемов ксенографтов, полученных при осуществлении трансплантации трех клеточных линий на скаффол-дах, выявлено, что наибольшие значения на 60-е сутки наблюдались при имплантации клеточной линии КК3, что составило 46,1 мм3 (44,3-49,7) про -тив 33,8 мм3 (31,4-35,6) в группе с КК1 и 38,9 мм3 (36,7-41,2) в группе КК2 (p < 0,001 и p = 0,045 соответственно).
Кривые роста ксенографтов представлены на рисунке 1. В группе с клеточной линией КК1 наблюдался резкий рост ксенографтов на 45-е сутки после процедуры имплантации, однако начиная с 45-х суток темпы роста в данной группе снижались. В группах с клеточными линиями КК2 и КК3, напротив, наблюдался постепенный рост образований с формированием максимального различия показателей на 60-е сутки от начала эксперимента.
Концентрация фибронектина в супернатанте опухолей мышей с имплантированными скаффолда-ми с клеточными линиями РСООРП представлена в таблице 3.
Фибронектин представляет обязательный компонент надмолекулярной архитектоники соединительной
Таблица 2
Средние значения объемов ксенографтов (мм3) на 60-е сутки после имплантации
Клеточная линия Медиана Межквартильный диапазон (25-75) Р
КК1 33,8 31,4-35,6 КК2 против КК1, р = 0,045
КК2 38,9 36,7-41,2 КК3 против КК1, р < 0,001 КК3 против КК2, р = 0,038
КК3 46,1 44,3-49,7
Примечание здесь и в табл. 3: p — уровень статистической значимости.
Таблица 3
Концентрация фибронектина (мкг/мл) в супернатанте опухолей мышей с имплантированными скаффолдами с клеточными линиями рака слизистой оболочки органов ротовой полости
Клеточная линия Медиана Межквартильный диапазон (25-75) р
КК1 (n = 5) 115,4 109,7-123,9 КК2 против КК1, р = 0,782 КК3 против КК1, р = 0,021 КК3 против КК2, р = 0,038
КК2 (n = 5) 123,1 117,5-130,8
КК3 (n = 5) 144,7 136,4-160,3
!<^ЖРАЧ “ ОНКОЛОГИЯ
ткани, определяющий структурные и функциональные взаимодействия клеток и межклеточного матрикса [5]. Высокая агрессивность опухоли при КК3 сопровождалась значительным приростом концентрации фибронектина в опухолевом гомогенате, что косвенно указывало на усиление инвазивных свойств раковых клеток и их подвижности за счет влияния межклеточного матрикса. Так, при имплантации опухолевого материала от донора с IV стадией РСООРП уровень фибронектина возрастал по сравнению с III стадией на 25,4 % при имплантации клеточной культуры КК1 и на 17,5 % — при заселении культуры КК2.
По результатам анализа взаимосвязи между уровнем фибронектина в опухолевом гомогенате и объемом ксенографта выявлена прямая статистически значимая корреляционная связь: коэффициент корреляции составил 0,62 при p = 0,003.
Как известно, фибронектин также является маркером эпителиальномезенхимального перехода (ЭМП) — критического этапа, при котором эпителиальные клетки принимают мезенхимальный фенотип, открепляются и резко повышают свою подвижность. ЭМП связан с инвазией опухоли, ее резистентностью к терапии и развитием рецидивов.
При имплантации животным первичных клеточных линий от донора с IV стадией заболевания РСООРП в ксенографте происходит активация мезенхимального маркера фибронектина с повышением его концентрации в опухолевом гомогенате. При IV стадии РСООРП усиление экспрессии фибронектина в опухолевой ткани способствует увеличению опухолевой массы, что может обусловливать продолженный рост опухоли и ее рецидивирование.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе установлено, что агрессивность клеточных линий РСООРП и модификация поверхности скаф-фолдов, усиливающая направленность роста опухоли, сопряжена с повышением концентрации фибронектина в опухолевом гомогенате. Создание модели опухолевого поражения нижней челюсти на иммунодефицитных мышах с применением титановых скаффолдов с модифицируемой поверхностью ионами серебра позволяет сохранять не только параметры роста опухоли на экспериментальной модели, но и характер взаимодействия с компонентами внеклеточного матрикса. Полученные результаты доказывают информативность определения экспрессии фибронектина в опухолевой ткани для оценки прогрессирования роста опухоли.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Walker C., Mojares E. Role of Extracellular Matrix in Development and Cancer Progression. del R o Hernandez / DOI: 103390/ijms19103028 // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19 (10).
2. Extracellular matrix structure / A. D. Theocharis, S. S. Skandalis, C. Gialeli, N. K. Karamanos. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001 // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2016. V. 97. P. 4-27.
3. Nallanthighal S., Heiserman J. P., Cheon D.-J. The Role of the Extracellular Matrix in Cancer / DOI: 10.3389/fcell.2019.00086 // Front. Cell. Dev. Biol. 2019. V. 7. P. 86.
4. EDA-Fibronectin Originating from Osteoblasts Inhibits the Immune Response against Cancer / S. Rossnagl, E. Altrock, C. Sens, S. Kraft, K. Rau, M. D. Milsom, T. Giese, Y. Samstag, I. A. Nakchbandi. DOI: 10.1371/journal.pbio.1002562 // PLoS Biol. 2016. V. 14 (9). P. e1002562.
5. Фибронектин: структура, функции, клиническая значимость (обзор) / С. А. Васильев, Л. А. Горгидзе, Е. Е. Ефремов, Г. Ю. Белинин, Т. Н. Моисеева, Л. С. Аль-Ради, М. А. Соколова, Г. Т. Гурия, Н. И. Зозуля, А. В. Кохно. DOI: 10.21518/2307-1109-2022-12-1-138-158 // Атеротромбоз. 2022. №1 (12). С. 138-158.
6. Егорихина М. Н., Мухина П. А., Бронникова И. И. Скаффолды как системы доставки биологически активных и лекарственных веществ / DOI: 10.17802/2306-1278-2020-9-1-92-102 // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2020. №1 (9). С. 92-102.
7. Prospective Validation of an Ex Vivo, Patient-Derived 3D Spheroid Model for Response Predictions in Newly Diagnosed Ovarian Cancer / S. Shuford, C. Wilhelm, M. Rayner, A. Elrod, M. Millard, C. Mattingly, A. Lotstein, A. M. Smith, Q. J. Guo. DOI: 10.1038/s41598-019-47578-7 // Sci. Rep. 2019. V. 9. P. 11153-11166.
8. Collagen-based three-dimensional culture microenvironment promotes epithelial to mesenchymal transition and drug resistance of human ovarian cancer in vitro / M. Liu, X. Zhang, C. Long, H. Xu, X. Cheng, J. Chang, X. Wang. DOI:10.1039/c7ra13742g // RSC advances. 2018.
V. 8 (16). P. 8910-8919.
9. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in Vivo / D. Antoni, H. Burckel, E. Josset, G. Noel. DOI: 10,3390/ijms16035517 // Int. J. Mol. Sci. 2015. V. 16 (3). P. 5517-27.
10. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures / V. Charwat, K. Sch tze,
W. Holnthoner, A. Lavrentieva, R. Gangnus, P. Hofbauer, C. Hoffmann, B. Angres, C. Kasper. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2015.02.007 // J. Biotechnol. 2015. V. 205. P. 70-81.
11. Практические рекомендации по лекарственному лечению опухолей головы и шеи. Практические рекомендации RUSSCO, часть 1 / Л. В. Болотина, Л. Ю. Владимирова, Н. В. Деньгина, С. И. Кутукова, А. В. Новик, И. С. Романов // Злокачественные опухоли. 2023. №3s2 (13). С. 100-119.
12. Barros F. S. V., Brosens J. J., Brighton P. J. Isolation and primary culture of various cell types from whole human endometrial biopsies / DOI: 10.21769/BioProtoc.2028 // Bio-protocol. 2016. V. 22 (6). P. e2028-e2028.
АВТОРСКАЯ СПРАВКА
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону
Максимов Алексей Юрьевич — доктор медицинских наук, профессор, заместитель генерального директора;
e-mail: [email protected].
Гончарова Анна Сергеевна — кандидат биологических наук, заведующая отделением «Испытательный лабораторный центр»; e-mail: [email protected].
Щепляков Дмитрий Сергеевич — кандидат медицинских наук, докторант; e-mail: [email protected].
ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону
Воловик Вячеслав Георгиевич — аспирант; e-mail: [email protected].
Демидова Александра Александровна — доктор медицинских наук, доцент, заведующая кафедрой медицинской физики, математики и информационных технологий; e-mail: [email protected].
Альникин Александр Борисович — кандидат медицинских наук, главный врач клиники г. Ростов-на-Дону;
e-mail: [email protected].
