Индукция lформ микобактерий туберкулеза и их электронномикроскопическая визуализация in vitro и in vivo Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:616.98:579.873.21

В.М.Катола, А.И.Сорокина, Т.Б.Макеева, О.В.Ракова, В.П.Самсонов

ИНДУКЦИЯ L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА И ИХ ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ IN VITRO И IN VIVO

АмурКНИИ АмурНЦ ДВО РАН,

ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

РЕЗЮМЕ

Комбинированная просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия образцов, подготовленных по специальной методике, позволяет обнаружить и анализировать микро- и субмикроско-пическое разнообразие бактерий в их нативном состоянии, взаимосвязи и структуру популяций, особенности биокосного взаимодействия и прочность адгезии клеток в различных объектах окружающей среды. Доминирующей морфологической формой изменчивости бактерий в местах заселения являются различные варианты L-форм. Переход бактерий из одного морфотипа в качественно другой осуществляется через нитеобразование.

SUMMARY

V.M.Katola, A.I.Sorokina, T.B.Makeeva,

O.V.Rakova, V.P.Samsonov

TUBERCULOSIS L-FORM MYCOBACTERIA AND THEIR ELECTRONMICROSCOPIC VISUALISATION IN VITRO AND IN VIVO

Combined transmission and scanning electronic microscopy of samples prepared with special methods, allows determining and analyzing micro- and submicroscopic variety of bacteria in their native state, population structure and interaction, biococnic interaction and cell adhesion strength in different environment. L-form variants are dominating morphological forms of bacteria variability. Transition of bacteria from one morphotype into another is engineered through filament formation.

Из обширного круга вопросов, касающихся изменчивости микобактерий туберкулеза (МБТ), предлагается рассмотреть процесс индукции L-форм отходами золотодобычи (ОЗ) и результаты их визуализации в инфицированном организме с помощью электронной микроскопии. Наблюдая за состоянием бактерий в местах колонизации, мы установили, что преобладающая часть популяции существует в виде L-форм, причем в объектах окружающей среды, в том числе в ОЗ они проявляли высокую механическую устойчивость. Это ставит ОЗ в один ряд с экологическими факторами, от которых зависит общая и профессиональная заболеваемость населения. К великому сожалению, отходам рудодобычи, занимающим обширные территории в соответствующих регионах, эпидемиологи и медицинские работники до сих пор не уделяют должного внимания.

Методика

Коллекционный штамм H37Rv микобактерий туберкулеза, полученный из Государственного института им. Л.А.Тарасевича, в дозе 1 мг вносили в среду Сотона, содержащую в соотношении Т:Ж=1:7 стерильные образцы ОЗ. В качестве контроля рассматривали МБТ, растущие на одной среде Сотона. Посевы инкубировали при колебаниях комнатной температуры от +12...18°С до +25...30°С.

У МБТ изучали культуральные, морфологические, тинкториальные и патогенные (корд-фактор) признаки, в том числе вирулентность для белых мышей при внутрибрюшинном введении 0,1 мг опытной культуры.

Для исследования готовили препараты-отпечатки из лимфатических узлов, легких и печени животных, тогда как их кровь и плазму крови лиц, страдающих деструктивными формами туберкулеза легких, наносили прямо на объектные столики в объеме 0,1 мл. Как представлялось нам, такой подход позволял выявить формы, в которых микобактерии циркулируют в организме.

Визуализацию форм МБТ in vitro и in у^о осуществляли с помощью сканирующего электронного микроскопа JEOL jsm-35 C (Япония).

Результаты и обсуждение

Рост колоний опытной и контрольной культур на среде Сотона появлялся на 8 сутки в виде поверхностной пленки. Однако в присутствии ОЗ накопление биомассы было обильнее, колонии обретали буроватую окраску, повышенную хрупкость и состояли из микроскопических и субмикроскопических форм: классических туберкулезных палочек, нитевидных структур, гигантских клеток, различных по размеру гроздевидных конгломератов и бесформенных тел, шаровидных и палочковидных элементов.

Типичные микобактерии туберкулеза составляли незначительную часть колонии, располагались изолировано друг от друга и представляли собою прямые или слегка изогнутые палочки длиною 1-3 мкм. Среди них можно было обнаружить клетки с утолщенными либо раздвоенными концами, причем, отдельные особи уже слабо сегментировались.

Нитевидные формы встречались реже. Их ширина составляла 0,4-0,6 мкм, длина иной раз превышала 100 мкм, а один конец часто закручивался в причудливый завиток. По мере ухудшения условий существования культуры нити обязательно полностью или частично сегментировались, а затем вступали в следующий этап развития.

Гигантские клетки, достигающие в поперечнике до 50 мкм, имели четкие контуры, неровную поверхность и хорошо видимые дефекты в клеточной стенке (КС), что позволяло отнести их к клеткам сферопла-стного типа (рис. 1). Сферопласты соединялись между собою тонкими либо широкими тяжами и сливались в конгломераты и огромные бесформенные тела. Некоторые из сферопластов неравномерно делились пополам, на поверхности других почковались мелкие дочерние клетки.

Субмикроскопические шаровидные клетки диаметром около 0,4-0,6 мкм, реже 1 мкм в колонии преобладали. Они тесно примыкали друг к другу и формировали крупные структуры, в которых размножались почкованием, неравномерным либо смешанным делением. То есть, вместе с конгломератами (бесформенными телами) представляли варианты

Ь-форм. Кроме шаровидных клеток и конгломератов во множестве встречались элементарные тельца размером 0,32-0,167 мкм и даже меньше, не склонные к объединению. Как уже отмечалось выше, источниками их образования служат нитевидные формы, в меньшей степени сферопласты и шаровидные клетки. Мы не видели, чтобы элементарные тельца размножались, поэтому считаем их конечным этапом на пути изменений морфогенеза микобактерий туберкулеза. Следует отметить, что в эти же сроки в колони-

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия: сферопласты МусЛиЬегси1о&1&\ индуцированные отходами золотодобычи. Увеличение х 3600.

ях контрольных культур также появлялись мелкие Ь-конгломераты и элементарные тельца.

Опытная культура МБТ не красилась по Граму и Цилю-Нильсену, хотя некоторые крупные Ь-тела иногда обретали голубоватый цвет при окраске по Романовскому-Гимзе. На среде ФАСТ 3Л она формировала мелкие 8-колонии, состоящие из кокковидных клеток, которые также не красились по Граму, Цилю-Нильсену и не образовывали корд-фактор. Однако эксперименты с внутрибрюшинным введением культуры белым мышам позволили более определенно отнестись к ее вирулентности. Животные погибали на протяжение 10-90 суток, при этом в препаратах-отпечатках из лимфатических узлов, легких, печени и в крови визуализировались малочисленные родительские клетки, большие Ь-структуры, группы шаровидных клеток, элементарные тельца и палочковидные формы (рис. 2а) Следовательно, в присутствие ОЗ микобактерии туберкулеза не теряют своей вирулентности.

Визуализация Ь-форм МБТ в организме инфицированных животных послужила основанием для проверки данного факта у лиц, находящихся на лечении по поводу диссеминированного и фибрознокавернозного туберкулеза легких. Оказалось, на фоне комплексной терапии и удовлетворительного самочувствия в плазме крови циркулировали почкующиеся нити, элементарные тельца и палочковидные клетки. Ухудшение состояния пациентов совпадало с распадом нитей, формированием на их поверхности Ь-образований величиною до 5 мкм и отдельных сетевидных структур, а за одну-две недели до летального исхода в крови визуализировались огромные (до 20-60 мкм) Ь-конгломераты (рис. 2б). Таким образом, течение экспериментального туберкулеза у мышей и туберкулеза легких у человека сопровождается циркуляцией в их крови трансформированных МБТ. Этим объясняются, во-первых, отрицательные результаты бактериологических исследований с применением традиционных питательных сред. Так, по данным [2] МБТ выделялись из крови всего у 1,135,3% больных, в то время как целенаправленные исследования позволили увеличить выявляемость за счет Ь-форм [5]. Во-вторых, Ь-преобразования МБТ -причина несвоевременной диагностики туберкулеза,

а б

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия: а - крупный Ь-конгломерат и элементарные тельца в печени мышей, инфицированных опытной культурой МусЛиЬвгси1о&'1&\ Увеличение х 6000; б - большой Ь-кон-гломерат в крови больного диссеминированным туберкулезом легких. Увеличение х 3600.

неэффективного лечения и прогрессирования процесса. Ь-формы могут стать и непосредственной причиной смерти: с учетом патоморфологических изменений при активном туберкулезе легких крупные Ь-конгломераты не смогут пройти через капиллярное русло жизненно важных органов и закупорят его просвет. Это еще в большей степени усугубит нарушения микроциркуляции и обмена веществ.

Итак, под влиянием отходов золотодобычи популяция МусЛиЬвгси1о&1&' подвергается морфофизиологической изменчивости и распадается на отдельные морфотипы. Переход индуцируется факторами инкубационной среды, где в процессе выщелачивания минералов метаболитами микобактерий постепенно концентрируются водорастворимые химические элементы, новообразованные вещества, комплексные соединения и др. В таких условиях более резистентные клетки сохраняют морфологию, менее устойчивые приостанавливают деление и трансформируются либо в нити, либо в сферопласты. При усилении стресса эти структуры вступают в очередной этап преобразований. Он универсален для всех таксонов и начинается с сегментирования нитей. Затем одни из них распадаются на палочковидные клетки, у других на поверхности либо одном конце почкуются шаровидные клетки и элементарные тельца, у третьих распад и почкование сферических тел проходят одновременно. То есть, превосходящая часть популяции переходит в некое состояние «покоя». Ему, как нам видится, более полно соответствуют Ь-формы, лишенные клеточной стенки, обладающие замедленными метаболизмом и ферментативной активностью [1, 3, 4]. Значит, и способные длительно сохраняться в неадекватной обстановке. Но самое главное в перестройке популяции МБТ заключается в том, что морфологические типы могут, за исключением элементарных телец, так или иначе размножаться. Тем самым обеспечивается выживаемость патогена в экстремальной обстановке.

Несомненно, индукторами изменчивости МБТ, совместно действующими в составе отходов золотодобычи, являются продукты деградации органического вещества, метаболиты микроорганизмов, водорастворимые и подвижные Аб, Си, Сг, Со, N1, РЬ, И§, Бе и другие рудные элементы. Для индукторов Ь-

форм бактерий в инфицированном макроорганизме характерна более сложная природа [1, 3, 4].

Выводы

1. Сканирующая электронная микроскопия позволяет обнаружить и качественно оценить особенности морфофизиологической изменчивости Myc.tuberculosis, проследить за ее динамикой и механизмами появления отдельных форм как in vitro, так и in vivo.

2. В присутствии техногенных отходов золотодобычи индуцируются микро- и субмикроскопиче-ские изменения Myc.tuberculosis. Доминирующая часть популяции трансформируется в L-формы, среди которых преобладают шаровые клетки и сформированные ими крупные L-конгломераты. В незначительном количестве в колонии содержатся исходные бактериальные клетки, нитевидные структуры и сферопласты - источники шаровидных тел, палочковидных клеток и элементарных телец. Смесь всех перечисленных морфотипов патогенна для белых мышей.

3. В препаратах-отпечатках из лимфатических узлов, легких и печени зараженных животных, а также непосредственно в крови людей, страдающих деструктивными формами туберкулеза легких, визуализированы бактериальные клетки Myc.tuberculosis и их L-формы в виде почкующихся нитей, огромных конгломератов, элементарных тел и палочковидных клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. L-формы бактерий [Текст]/С.В .Прозоровский, Л.Н.Кац, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1981.-236 с.

2. Туберкулез органов дыхания у взрослых [Текст]/А.Е.Рабухин.-М.: Медицина, 1976.-С.86.

3. Биология L-форм бактерий [Текст]/

В.Д.Тимаков, Г.Я.Каган.-М.: Медгиз, 1961.-233 с.

4. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmata-ceae в патологии [Текст]/В.Д.Тимаков, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1973.-391 с.

5. L-variation in mycobacteria [Text]/Mattman L.H. [et al.]//Am. Rev. Resp. Dis.-1960.-Vol.82.-P.202.

П □ □

УДК 57.086.3+57.084

Н.Ю.Леусова, В.М.Катола

ПРЯМАЯ ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, КОЛОНИЗИРУЮЩИХ СЕМЕНА ПОВИЛИКИ ЯПОНСКОЙ CUSCUTA JAPONICA СНОКУ

Ботанический сад филиал Ботанического сада-института ДВО РАН,

АмурКНИИ АмурНЦ ДВО РАН

РЕЗЮМЕ пическая визуализация микроорганизмов, коло-

низирующих семена повилики японской Cuscuta В работе представлена электронномикроско- japonica СЬо1«у. Ультраструктура поверхности