CC BY
31
УДК 616.411 — 003.971: 615.28
EFFECT OF DIC ARB AMIN8 ON REDUCION OF APOPTOSIS AND INDUCTION OF MYELOID CELLS DIFFERENTIATION IN BONE MARROW OF THE PATIENTS RECEIVING CYTOTOXIC CHEMOTHERAPY
N. T. Raikhlin', V.A. Gorbounova', II.M. Treshalina1, MB. Bychkov',E.A. Smirnova1, N.V. M indr a', S. V. Topchieva1, G.N. Zubrikhina1, V.E. Nebolsirr 'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS 2 "Pharmenterprises Ltd»
ABSTR.4CT
Dicarbamin is a new chemical compound with pseudo-peptide molecular structure 4-{N-[2-(imidazol)-4-yl]-carbomayl}-butyric acid. Previously untreated patients with morphologically proven stage II1-IV ovarian cancer received cytotoxic chemotherapy with Carboplatin 400 mg/m: + Cyclophosphamide 600 mg/m; every 4 weeks with Dicarbamin 100 mg daily per os or without it. CBC and ANC were taken weekly throughout all courses of CT. Five patients in each group underwent bone marrow aspiration from sternum before treatment and two weeks after the second course of chemotherapy for accessing bone marrow function on the peak of toxicity. The use of Dicarbamin leads to statistically significant decrease in incidence of severe (gr. II1-1V) neutropenia (/7=0.047) and has no influence on figures of leucopenia and thrombocytopenia (/7=0,92 and 0,505, correspondingly). The obtained results show that Dicarbamin decreases apoptosis in hemopoietic cells in bone marrow and induce the differentiation, mostly of the granular ceils. These events are the base of protective effect in terms of cytotoxic neutropenia.
ИНДУКЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ДИКАРБАМИНОМ™
У БОЛЬНЫХ В УСЛОВИЯХ МИЕЛОСУПРЕССИВНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ
Н.Т. Райхлин', В.А. Горбунова', Е.М. Трещалина1, М.Б. Бычков', Е.А. Смирнова', Н.В. Миндра', С. В. Топчиева', Г. II. Зубрихина', В.Е. Небольсин2 ‘ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН : ООО «Фарминтерпрайсез»
РЕЗЮМЕ
В рамках II фазы клинического изучения препарата Дикарбамин у больных раком яичников было выявлено уменьшение частоты возникновения глубокой нейтропении — в 1,8-2,2 раза — при проведении цнтостати-ческой терапии по схемам Циклофосфамид + Карбоплатин (1ДФ+КП) или Доксорубшшн + КП.
Задачей работы явилось изучение влияния Дикарбамина на гемопоэтические клетки костного мозга у больных раком яичников, получающих миелосупрессивную комбинированную химиотерапию ЦФ+КП.
Материалом для исследования служили пунктаты костного мозга, взятые от больных, получающих химиотерапию по схеме ЦФ + КП (группа А) и пациентов, получающих такую же химиотерапию, но на фоне ежедневного приема Дикарбамина (группа Б). В обеих группах исследование проводилось до начала терапии и через 2 недели после второго курса лечения, на пике падения показателей периферической крови. Полученные пунктаты костного мозга изучались электронно-микроскопически для выявления ультраструктурных особенностей гемопоэтнческих клеток гранулоцнтарного, лимфоидного и эритрондного ряда.
Результаты В клетках костного мозга больных в результате химиотерапии развиваются выраженные дистрофические изменения в цитоплазме, наблюдается гибель специфических гранул, усиливаются явления апоптоза. Эти изменения наиболее выражены в гранулоцитарных клетках на ранних стадиях их дифференци-ровки — образования бластных клеток, пролимфоцитов, миелоцитов, что сопровождается развитием лейкопении. нейтропении и других нарушений гемопоэза у данной группы больных. В костном мозге больных, получающих химиотерапию с Дикарбамином, накапливаются молодые (властные) клетки гранулоцнтарного ростка и. что особенно важно, усиливается ихдифференцировка до функционально полноценных форм, а также снижается активность апоптоза.
Выводы. Результаты исследования свидетельствуют о том. что Дикарбамин индуцирует дифференцировку в гемопоэтических клетках костного мозга, особенно гранулоцитарного ряда, и снижает явления апоптоза, которые лежат в основе протекторного эффекта Дикарбамина по отношению к цитотоксической нейтропении.
Введение
В последние десятилетия химиотерапия стала основным методом лечения пациентов Ш-1У стадий онкологических заболеваний. Однако возможности этого метода в большой степени лимитируются развитием токсических побочных эффектов, из которых наиболее частое — миелосупрессия. Одно из морфологических проявлений миелосупрессии в костном мозге
— уменьшение клеточности, высокий процент апоптоза в клстках-предшественниках и снижение дифферен-цировки молодых форм в зрелые [1; 8; 9; 10].
Особую проблему представляет защита кроветворения при проведении химиотерапии больным раком яичников, поскольку функциональная способность ми-елошггов в крови этих больных недостаточна. Это подтверждается снижением числа маркеров миелоидной дифференцнровки. особенно на 111-1V стадиях болезни [3]. В связи с этим коррекция миелосупрессии при химиотерапии этим больным должна быть направлена не только на предупреждение гибели клеток, но и на восстановление утраченных функций клеток-предше-ственников миелоидного ряда.
Используемые в настоящее время в клинической практике колониестнмулирующие факторы уменьшают степень гематологической токсичности, в основном за счет стимуляции пролиферации клеток-предше-ственников, поврежденных в результате цитотокснчес-кой химиотерапии, а также частично за счет диффе-ренцировки и выброса в периферическую кровь зрелых гранулонитов из депо [4; 13]. Недостаток этих препаратов — невозможность их использования с профилактической целью до введения цитостатиков. а также наличие побочных эффектов п высокая стоимость лечения [2; 13]. В связи с этим актуален поиск препаратов, способных оказывать протекторное влияние на клетки костного мозга в момент проведения интоток-сической миелосупрессивной химиотерапии путем ин-
дукции дифференцнровки клеток-предшественников и снижения процента апоптоза.
Нами проводится серия исследовании по созданию и изучению потенциальных индукторов дифференциров-ки клеток в ряду аминоацильных производных биогенных аминов [5; 6]. Один из них. Дикарбамин -4- {Ы[2-(ими-дазол)-4ил-]-карбамоил | масляная кислота—представляет собой псевдопептнд. Пероральная лекарственная форма препарата под названием Дикарбамин разработана и изучена ООО «Фарминтерпрайсез». Экспериментальные исследования фармакологических свойств проведены в НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН и НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Наиболее значимо токсикомодифицируюшее действие препарата в отношении ряда противоопухолевых цитостатиков. Так, для циклофосфамида (ЦФ) Дикарбамин оказался дозомодифииирующим фактором (ФУД=1,35) [7]. На фоне приема Дикарбамина расширяется диапазон терапевтических доз ЦФ. увеличивается ЛД.Г, и терапевтический индекс (ТИ^) ЦФ.
Апоптоз в клетках костного мозга был изучен нами ранее на интактных мышах при однократном внутрибрюшинном введении ЦФ в дозе 100 мг с Ди-карбамином и без него. В контрольной группе животным вводили ЦФ. животные опытной группы получали Дикарбамин в дозе 0.5 мг/кг ежедневно, начиная за 5 дней до ЦФ. и затем в течение 10 дней. Индекс апоптоза рассчитывали как пропорциональное количество клеток с признаками апоптоза и апоптоз-ных тел на 500 клеток костного мозга. Было показано также, что апоптоз под воздействием Дикарбами-на снижается до 1-1,5% по сравнению с 5-8% при введении одного ЦФ.
Описанные результаты послужили основанием для клинической апробации Дикарбамина в качестве средства снижения гематологической токсичности у больных раком яичников при проведении химиотерапии ЦФ+КП.
Таблица 1
Дозомодифнинрунинее действие Дикарбамина в отношении Циклофосфамида
Показатель Дозы, мг/кг Фактор увеличения дозы (ФУД)
Циклофосфамид Цикл офосфамид+Дикарбамин
ДДзо 400 450 1,13
ДДю 300 400 1,26
ТДтах 300 400 1,33
ТДтіп 120 40 0,33
ТДорПт 180-220 180-300 -
ЕДзо 140 150 1,07
ТИ50 2,82 2,93 -
Примечания. Токсические дозы рассчитаны для мышей самок Бь терапевтические дозы - для мышей с перевиваемым внутрибрюшшшым лимфолейкозом Ь-1210, подвергнутых лечению на 5 сутки после прививки ЦФ в диапазоне доз от 40 до 450 мг/кг [11]; животные получали Дикарбамин в дозе 0,5 мг/кг ежедневно, начиная за 5 дней до ЦФ, и затем в течение 10 дней.
Материалы и методы
В рамках открытого сравнительного исследования больные с морфологически подтвержденным раком яичников Ш-1V стадии получали лечение в двух группах — А и Б. В группе А (контроль) проводилась химиотерапия по схеме циклофосфамид 600 мг/м2 + карбоплатип 400 мг/м: каждые 28 дней. В группе Б пациенты получали химиотерапию по той же схеме на фоне перорального приема Ди-карбамина 100 мг в сутки на протяжении всего курса лечения. Еженедельно производили клинический анализ периферической крови и подсчет лейкоцитарной формулы. Гематологическую токсичность оценивали по критериям ВОЗ.
Дпя оценки функции костного мозга 5 больным в каждой группе дважды за время лечения производили стернальные пункции: первую — до начала терагпш, вторую — через 2 недели после II курса лечепия (на пике падения показателей периферической крови). Пунктаты костного мозга служили материалом для электронной микроскопии.
Свежие пунктаты костного мозга помешали на предметное стекло и многократно помешивали стеклянной палочкой до получения небольших плотных фрагментов. Последние фиксировали сперва в 2,5%-ном растворе глютаральдегнда и дополнительно фиксировали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия: промыв фосфатным буфером pH 7,4, обезвоживали в спиртах восходяшей концентрации и заключали в смесь эпоксидных смол ЭПОН-812. Полутонкие и ультра-тонкие срезы готовили на ультрамикротоме ЛКБ-Ш (Австрия). Полутонкие срезы окрашивали метиленовым или толуидиновым синим, ультратонкие срезы контрастировали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца.
Полутонкие срезы просматривали в световом микроскопе «Поливар» (Австрия), ультратонкие—в электронном микроскопе ДЖЕОЛ-1200 СХ-11 (Япония).
Результаты и обсуждение
К настоящему моменту 16 пациенток в группе А получили 65 курсов химиотерапии (в среднем 4.0), гематологическая токсичность по критериям ВОЗ была оценена по результатам 58 курсов. В группе Б 18 пациенток получили 98 курсов ХТ (в среднем 5,4), оценены 88. Частота развития гематологической токсичности в обеих сравниваемых группах приведена в табл. 2. Видно, что в группе Б отмечается статистически зна-
чимое изменение показателей нейтропении (/>=0,047). Это проявляется уменьшением частоты возникновения глубокой нейтропении (Ш-1У степени ВОЗ) и увеличением числа случаев, в которых количество нейтрофи-лов не снижалось (степень 0). Необходимо отметить, что в обеих группах не было эпизодов фебрильной пей-тропении. Показатели лейкопении и тромбоцитопснии не различались. При применении Дикарбамина отмечали относительное увеличение частоты анемии, которое может быть связано с неравнозначным числом курсов лечения в сравнении с группой А (5,4 против 4,0). Вследствие этого нарастающая по мере проведения последующих курсов кумулятивная токсичность в отношении красного ростка крови в группе Б была выше. В настоящее время продолжается проведение химиотерапии пациенткам группы А, что позволит уточнить реальную частоту развития глубокой анемии.
Результаты электронной микроскопии пунктатов костного мозга
1. Исследование костного мозга до начала лечения (контрольное) в группах А и В
В пунктатах костного мозга определяются гемо-поэтические клетки различной степени зрелости и направления дифференцировки. часть клеток с признаками вакуолизации и дистрофии. Встречаются властные недифференцированные клетки крупных размеров с узким ободком цитоплазмы, содержащим главным образом рибосомы. Основную часть цитоплазмы в этих клетках -занимает ядро округло-овальной формы с диффузным хроматином и отдельными ядрышками. Часть клеток дифференцируется в направлении гранулоци-тарного ряда лейкоцитов различного типа и степени дифференцировки. Видны промислониты и миелоциты с округло-овальными ядрами, диффузным хроматином, в цитоплазме которых содержится различное количество специфических гранул. Вокруг этих клеток часто располагаются эритроциты и более зрелые гранулоциты. Часто видны скопления более дифференцированных гранулоцитов: метамиелоцитов — палочкоядерных и сегментоядерных. В их цитоплазме имеются специфические гранулы различного типа, характерные для нейтрофилов, эозинофилов. базофилов. Среди гранулоцитов располагаются лимфоидные клетки разной степени дифференцировки (маленькие, средние, крупные — лимфобластные). Встречается много зрелых эритроцитов часто различной формы, а также нормобласты, содержащие ядра, и тромбоциты.
Таблица 2
Частота гематологической токсичности (%) схемы циклофосфамил+карбоплатин (группа А) и Циклофосфамил+Карбоилатин+Дикарбамин (группа Б) у больных раком яичников
Вид токсичности Степень гематологической токсичности (критерии ВОЗ)
0 1-11 Ш-ГУ
Группы
А Б А Б А Б
Лейкопения 15,52 17,05 63,80 65,91 20,69 17,05
Нейтропения 17,86 37,80 44,65 41,46 37,50 20,73
Т ромбоцитопения 51,72 48.86 37,93 38,64 10,4 12,5
Анемия 20,69 22,99 67,74 56,32 12,07 20,69
2. ГпутиI А Исследование костного мозга после химиотерапии без Дикарбамина
В пунктатах костного мозга после курса химиотерапии в сохранившихся гемопоэтических клетках различного типа (гранулоцнты. лимфоциты, нормоблас-ты. эритроциты, тромбоциты) встречаются признаки дистрофии и низкой степени зрелости.
В властных клетках цитоплазма содержит рибосомы. она часто вакуолизирована. Ядра крупные, с диффузным хроматином или скоплениями гетерохроматина. иногда неправильной формы, с втяжениямн. В промпелоцитах и миелоцитах количество специфических гранул незначительное, цитоплазма часто с выраженными дистрофическими изменениями (рис. 1).
В сохранившихся гранулошггах типа палочкоядерных и сегментоядерных также наблюдаются дистрофические изменения и незначительное количество специфических гранул. Часто имеющиеся гранулы дистрофически изменены, вакуолнзнрованы (рис. 2). Сохранившиеся нормобласты бывают неправильной формы. с отростками и выпячиваниями цитоплазмы (рис. 3). Следует подчеркнуть, что в пунктатах костного мозга, особенно среди гранулоцитов, встречаются клетки с признаками апоптоза (рис. 4). В них отмечается маргинация гетерохроматина, явления фрагментации ядра и цитоплазмы, образование апоптозных тел.
3. Группа Б. Исследование костного мозга после химиотерапии па фоне Дикарбамина
В пунктатах костного мозга встречаются гемопоэ-тические клетки различной степени и типа диффереппи-ровки (гранулошггы. лимфоциты, тромбоциты, нормобласты, эритроциты). Клетки властного типа крупные, содержат округлые ядра с диффузным хроматином и отдельными ядрышками, цитоплазма узкая, в ней вид-
Рис. 2. Г руппа А. Сегментоядерный лейкоцит с вакуолизацией цитоплазмы и гибелью гранул.х 12000
Рис. 1. Грунна А. Нентрофильнын миелоцит с резко ваку-олизированной цитоплазмой н отдельными гранулами. х 6000
Рис. 3. Г руппа А. Нормобласты (эршроблаеты) неправильной формы с отростками и выпячиванием цитоплазмы. х 8000
ны рибосомы, отдельные митохондрии, иногда единичные первичные плотные гранулы. Промиелоцитов и миелоцитов много, от! содержат округлые или овальные ядра с диффузным или конденсированным хроматином. в их цитоплазме достаточно много специфических гранул—первичных (темных) и меньше зрелых (более светлых). Часто встречаются палочкоядерные и сегментоядерные лейкоциты. Ядро — вогнутое (бобовид-
Рис. 4. Г рунпа А. Каргина апоптоза нейтрофнльных лейкоцитов. Марпшаиии конденсированного гсіеро\ро\іа піна н фрагментация ядра и клетки.х 8000
Рис. 6. Группа Б. Сегментоядерный неГгтрофнл с большим количеством гранул. х 10000
ное) или сегментированное, в цитоплазме обилие специфических фанул. преимущественно нейтрофнльпо-го пша. реже эозинофильного с кристаллоидш<1мн структурами (рис. 5; 6: 7). Лимфоциты различной степени
Рис. 5.1 руппа Б. 11а. ючкоялерный нейтрофильныи лейкоцит с большим количеством специфических гранул. х10000
Рис. 7. Группа Ь. Эозинофильный на.ючкоялерный эозн-нофнл с большим количеством I ранул. В некоторых нз них видны кристаллондные структуры. “6000
дифференцировки содержат в шгтоплазме митохоидрии. структуры шероховатого эндоплазматического ретику-лума. шюгда включения в виде едшшчпых гранул. Клетки гранулоцитарного типа и лимфоциты часто образу-
ют компактные скопления. Наряду с эритроцитами встречаются нормобласты разной степени дифференци-ровкн и относительно обычной формы (рис. 8). Клетки с признаками апоптоза встречаются редко.
Рис. 8. Г рунна Б. І Іормобласт (эритробласт) с гладкой поверхностью. х 8000
Выводы
Клиническое исследование Дикарбамнна было проведено у 34 больных раком яичников, получавших ми-елосупресснвную химиотерапию по схеме никлофосфа-мид 600мг/м: + карбоплатин 400 мг/м:. Показано, что ежедневный прием Дикарбамнна в дозе 100 мг/сутки по профилактической схеме, начиная за 5 дней до химиотерапии, на фоне проведеїшя химиотерапии и затем до следующего курса приводит к статистически значимому снижению частоты нейтропении Ш-1У степени по ВОЗ (р=0,047) и не влияет на показатели лейко- итром-боиитопении (р=0,92 и 0,505 соответственно).
Сравнительное электронно-микроскопическое исследование гемопоэтнческих клеток костного мозга больных раком яичников при комбинированной химиотерапии с применением Дикарбамнна и без него позволило выявить механизм его защитного эффекта от цитотоксического влияния использованных препаратов.
Показано, что схема ЦФ+КП вызывает выраженное цитотоксическое действие на различные типы ге-мопоэтических клеток гранулоцитарного, лимфоидного и эритроидного ряда, которое проявляется в виде дистрофических изменений в цитоплазме и гибели специфических гранул. Эти изменения наиболее выражены в гранулоцнтарных клетках и уже на ранних стади-
ях их дифференцировки. В результате образуется дефицит дифференцированных функционально полноценных форм гемопоэтнческих клеток. Кроме того, в элементах гранулоцитарного ряда усиливается генетически запрограммированная клеточная гибель — апоптоз. В целом дистрофические изменения и апоп-тоз ведут к развитию лейкопении, нейтропешш. тром-боцитопении и других нарушений гемопоэза и ограничивают возможности химиотерапии.
Дикарбамин, применяемый до. на фоне и после химиотерапии, защищает гемопоэтические клетки от миелосупрессивного действия и. что особенно важно, способствует дифференцировке молодых форм нейтрофильного ростка в зрелые клеточные элементы и снижает явления апоптоза. Этот феномен обусловливает защитный эффект Дикарбамнна в отношении клеток-предшественннков гранулоцитарного ряда. Полученные данные позволяют заключить, что Дикарбамин может рассматриваться в качестве протектора от гематологической токсичности у онкологических больных, получающих мнелосупрессивную химиотерапию.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю В II Иммунологические про-блемы апоптоза. — М.: Эдиториал УРСС. 2002. —С. 320.
2. Белоусова А.Е. II Молекулярно-биологические подходы к терапии опухолей. — М.: НПЦ «МедБиоСпектр». — ВИНИТИ, 1993,— С. 180.
3. Блиндарь В Н, Зубрихина ГН, Зарядьева ЕА идр Функциональная характеристика нейтрофилов периферической крови больных раком яичников // Вестник Р011Ц им. Н Н Блохина РАМН. —2000. — № 2. — С. 46-52.
4 Варфоломеева СР. Добренькое А . В . Тимиков А М идр Опыт применения колониестимулирующих факторов (Г-КСФ и ГМ-КСФ) у детей с гематоонкологическими заболеваниями II Российский онкологический журнал.
— 1998, —№2. —С. 50-3.
5. Небольсин В.£.. Гарин А. М., Горбунова В. А. идр. II Патент РСТ. Способ индукции дифференцировки клетки.-МПК 7 А61 К 38/05 -\ь 2420-30039 RU/042 от 06.08.200!.
6. Небольсин В Е. Синтез и изучение свойств низкомолекулярных биологически активных пептидов и их производных II Автореферат канд.дисс. М. — 1999. — С. 25.
7. Трещалин И.Д.. Небольсин В.Е., БоднгинД.А. идр Витам
— новый модификатор токсичности циклофосфами-да. 2-й Съезд онкологов // Экспериментальная химиотерапия. — Киев. 1999. — С. 289.
8. Фильчеиков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз (физиологическая смерть клетки) II Семинары по гематопатологии.
— Вып. 2,- Киев, 1995, —С. 24.
9. Ярилин А.А Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме // Патол. фнзиол. зкпер. тер. — 1998,— Т. 2 — С. 25-9.
10. Carson D.E., Ribeiro G.M. Apoptosis and disease (review)/ / Lancet. — 1993. — Vol. 314. — P. 1251-4.
11. Experimental evaluation of aniitumor cancer drugs in the USA and USSR and clinical correlations II NCI monograph 55. edrs. A.G. Kline, Z.Sofina, A. Syrkin. — Bethesda. — Maryland. 1980. — P 110.
12. Lieschke G.J.. Burgess A H' Granulocyte colony-stimulating factor and eranulocyte-macrophage colonv-stimulating factor // N Engl J Med. — 1992. — Vol. 327, —P. 99-106.
13. Lord В I., Gurney H.. Chang J. el a I. Haemopoietic cell kinetics in humans treated with rGM-CSF II Int J Cancer.
— 1992. —Vol. 50, —P. 26-31.
