CC BY
82
Шеламова С.А.1, Тырсин Ю.А.2
1Воронежская государственная технологическая академия 2Московский государственный университет пищевых производств E-mail: [email protected]; [email protected]
ИНДУКЦИЯ БИОСИНТЕЗА ЛИПАЗ МИКРОМИЦЕТОМ
Биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 индуцируется триглицеридами, жирными кислотами и их производными - твинами. Самый высокий эффект дали оливковое масло, твин 80 и олеиновая кислота. Этот продуцент способен синтезировать два липолитических фермента. Молекулярная масса была одинаковой у двух изоферментов и равнялась 44±2 кДа. Между изоформами наблюдалось большое соответствие в аминокислотном составе.
Ключевые слова: липаза, Rhizopus, биосинтез.
Синтез липолитических ферментов микроорганизмами, за некоторыми исключениями [1], является индуцибельным. Для каждого продуцента необходим выбор индуктора [2-5]. Эффективность индукции, кроме того, зависит от состава питательной среды [6]. По данным многих исследователей биосинтез липазы стимулируют жиры, масла, жирные кислоты и их полиоксиэтилено-вые эфиры на основе сорбита - твины [1, 7-11]. Есть данные по добавлению твинов в среды как отдельного компонента, так и вместе с маслами (в качестве поверхностно-активных веществ). В первом случае увеличение активности составляет от
2,5 до 6 раз [12, 13]; во втором - на 25% [14].
Для некоторых продуцентов липаз установлено наличие нескольких изоформ этого фермента [15-18]. Они отличаются структурой, молекулярной массой, каталитическими свойствами, стабильностью. Количество работ, посвященных связи между условиями культивирования штаммов-продуцентов липаз и профилем изоферментов, ограничено. Однако это имеет очень большое значение для надежности оценки свойств неочищенных препаратов одного и того же продуцента, так как они могут содержать различное соотношение изоформ.
Методы исследования
Продуцент получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Набор калибровочных белков «Amercham» (США), твины Sigma Chemical Co (США), реагенты для электрофореза «Sigma» (США); масла: оливковое «Aceites Borges Pont» (Испания), подсолнечное и хлопковое «ЭФКО», льняное «Эколен», горчичное «Родос ТД», касторовое «Тульская фармацевтическая фабрика» (Россия); другие реагенты отечественного производства марки х.ч.
Выращивание продуцента проводили глубинным способом на лабораторной качалке (скорость вращения 1,7-1,8 с-1) в колбах Эрленмейе-ра объемом 500 см3, содержащих 100 см3 питательной среды; 72 ч при температуре 30 еС и рН 7,0.
Для выявления множественности форм липазы препараты, полученные из фильтрата культуральной жидкости осаждением ацетоном в соотношении 1:2,5 об./об., подвергали электрофорезу в ПААГ в градиенте концентраций геля 5-20%. Полосы с липазной активностью обнаруживали по цветной реакции [19].
Определение молекулярной массы липаз проводили методами гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-100 Superflu (Pharmacia, Щвеция) [20] и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS [19].
Аминокислотный состав липаз определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-339Т МИКРОТЕХНА (Чехословакия).
Гидролитическую активность липазы определяли модифицированным методом Yamada и Machida [21]. Субстрат - оливковое масло. За единицу активности липазы принимали такое количество фермента, которое освобождает 1 ммоль жирной кислоты за 1 мин.
Результаты и их обсуждение
Индуцированность биосинтеза липазы Rh. oryzae 1403 исследовалась в присутствии твинов (они были взяты в качестве источников жирных кислот, которые являются твердыми при температуре 30 °С); растительных масел, жирных кислот. Исследования проводились на среде с пептоном (3%) и солями (%): (NH4)2HPO4 - 0,5; MgSO4 - 0,05; FeSO4 - 0,01; KH2PO4 - 0,1. Из представленных результатов видно (табл. 1 и рис. 1), что биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 ин-
дуцируется как субстратами - триглицеридами, так и продуктами их гидролиза - жирными кислотами и их производными - твинами.
Активность увеличивалась в 2,3-4,0 раза. Самый высокий эффект дали оливковое масло, твин 80 и олеиновая кислота. По всей вероятности, химическая структура жирной кислоты имеет значение: по мере возрастания длины углеводородной цепи от 12:0 (Твин 20) до 18:0 (Твин 80) индукция усиливалась. По-линенасыщенные жирные кислоты и оксикис-лоты на этом фоне выделялись меньшим положительным влиянием: льняное масло давало увеличение активности по сравнению с пеп-тонно-солевой средой в 2,7 раза, а касторовое - в 1,4 раза. На среде с соевой мукой наблюдалось даже уменьшение активности в присутствии касторового масла. Глицерин на биосинтез липазы стимулирующего действия не оказывал.
На биосинтез липаз микроорганизмами могут оказывать влияние поверхностно-активные вещества. Однако эти сведения весьма противоречивы [3, 4, 12, 22]. Даже у одного и того же продуцента - Acinetobacter calcoaceticus ПАВ из одной - полиэтоксилатной - группы вызывали повышение активности до 15 раз или полное подавление роста. Имеет значение концентрация: в присутствии твина 80 при 0,008% активность увеличивалась в 2,5 раза, а при 1% снижалась более чем на 50% [13]. При культивировании Pseudomonas sp, штамма 109 добавление соевого масла или неионного детергента (Noigen HC) приводило к увеличению содержания внеклеточной липазы в 56 раз [23].
ПАВ в составе питательной среды при культивировании продуцентов липаз могут оказывать разностороннее действие: и непосредственно на клетки, и на доступность нерастворимого в воде липидного индуктора для микроорганизма, и на процесс выделения фермента из клеток, и, возможно, на сам фермент.
Нами было исследовано влияние различных ПАВ на биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 на фоне среды (%): соевый жмых (2), кукурузный экстракт (1,0), (NH4)2HPO4 (0,5) и подсолнечное масло (0,5). Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что ПВС и фосфатидный концентрат оказывали слабое влияние на биосинтез липазы грибом. Отрицательное действие проявлял бридж. Тритоны сильно отличались
1 2 3 4 5 6 7
Рисунок 2. Выявление липазы после электрофореза фильтрата культуральной жидкости при выращивании КН. отугае 1403 на различных средах: 1 - пептонно-солевая;
2 - с соевым жмыхом без тритона; 3 - то же, с тритоном Х-305; 4 - пептонно-солевая с твином 80; 5 - то же с твином 60; 6 - то же с твином 40;
7 - то же с твином 20
' 1 ,
1 1
ш — — — _ *
Рисунок 1. Липазная активность при культивировании КЫгорш отугае 1403 на пептонно-солевой среде (1) и с добавлением масел (0,5%): оливкового (2); горчичного (3); подсолнечного (4); хлопкового (5); льняного (6); касторового (7)
Таблица 1. Влияние жирных кислот и твинов на биосинтез липазы КН. отугае 1403
Компонент Массовая доля, % ЛА, ед./см3 ЛА, %
Среда без индуктора - 12,0 100
Олеиновая кислота 0,5 41,8 350
Линолевая кислота 0,5 27,8 230
Твин 20 1,0 33,6 280
Твин 40 1,0 43,7 360
Твин 60 1,0 39,3 330
Твин 80 1,0 47,4 395
по эффекту. При добавлении тритона Х-100 удалось повысить активность фермента в 1,35 раза.
Исследования состава липолитического комплекса Rh. oryzae 1403 при культивировании на средах с добавлением различных индукторов и без них показали, что на пептонно-солевой среде и с твином 20 образовывалась одна форма липазы. При введении в питательную среду оливкового масла, олеиновой кислоты и других твинов синтезировалась еще одна форма липазы (рис. 2).
Для Candida rugosa А.Т.С.С. 14830 также показано, что профиль изоформ сильно зависит от состава среды. На питательной среде без липидов была обнаружена одна форма липазы, при добавлении твина 20 выявилась еще одна форма фермента, а в присутствии твина 80 идентифицирована совершенно иная липаза [16].
Разносторонние исследования образования множественности изоформ липазы проведены для Candida rugosa. Сначала у этого продуцента было описано два, а позже - семь генов, кодирующих липазы и эстеразы (пять из них - липазы). Они в настоящее время полностью охарактеризованы [18]. Geotrichum candidum F0401B образует внеклеточные липазы А и С, которые предпочтительно расщепляют связи по положениям sn-1,3 и sn-2 триглицерина соответственно [24]. Множественность изоформ липаз может быть обусловлена изменениями в экспрессии генов, различным количеством ковалентно связанных
Рисунок 3. Определение молекулярной массы липаз: а) - электрофорез: 1 - маркерные белки; 2 - Липаза I; 3 - Липаза II; б) - калибровочный график: 1 -лизоцим; 2 - соевый ингибитор трипсина; 3 -карбоангидраза; 4 - овальбумин; 5 - сывороточный альбумин; 6 - целлюлаза
углеводов, частичным протеолизом и другими трансляционными модификациями. Отмечается, что гетерогенность изоформ липаз, обнаруженных у грибов и дрожжей, может быть частично связана с гетерогликозилированием и нековалентными ассоциациями гликозидных примесей с липазным компонентом [25, 26]. Липазы Rhizopus о^ав 1403 были получены в гомогенном виде с помощью последовательных стадий гель-фильтрации на БерЬаёех G-150 и ионооб-
Таблица 2. Влияние ПАВ на биосинтез липазы грибом Rh. oryzae 1403
Наименование ПАВ Массовая доля ПАВ, % ЛА, ед./см3 ЛА, %
Среда без ПАВ - 66,8 100
ПВС 0,1 70,5 105
Фосфатидный концентрат 0,1 69,7 104
Тритон Х-100 0,1 0,01 76,8 90,2 115 135
Тритон Х-405 0,1 0,01 59,3 63,5 89 95
Бридж 35 0,1 0,01 16,7 23,4 25 35
Бридж 58 0,1 0,01 13.0 20.1 20 30
Таблица 3. Аминокислотный состав (%) липаз Rhizopus oryzae 1403
Аминокислота Rhizopus oryzae 1403 Rhizomucor miehei [258]
Липаза I Липаза II
Ala 6,19 6,60 5,43
Cys 1,13 1,63 1,91
Asx 10,56 9,43 10,78
Glx 9,78 7,99 8,94
Phe 7,61 7,36 5,22
Gly 4,91 5,38 3,89
His 2,11 2,25 2,10
Ile 6,53 7,17 6,21
Lys 2,92 3,38 3,30
Leu 7,23 7,85 8 OO 8,
Met 1,75 1,15 1,68
Pro 4,98 7,74 6,23
Arg 3,43 4,56 5,27
Ser 9,52 8,14 9,01
Thr 8,86 9,10 8,86
Val 8,21 6,52 8,52
Tyr 3,38 2,66 7,36
Trp 0,88 1,05 1,84
менной хроматографии на ДЭАЭЦ ДЕ-52. Гомогенность ферментов подтверждена повторной гель-фильтрацией и электрофорезом. Удельная активность составила для Липазы I 3600 и Липазы II 2150 ед./мг белка.
Молекулярная масса Липаз I и II, определенная гель-фильтрацией на Sephadex G-150, находилась в пределах 40-45 кДа. Исследования молекулярной массы методом электрофореза в присутствии SDS показали, что она практически была одинаковой у двух изоферментов и равнялась 44±2 кДа (рис. 3).
Аминокислотный состав Липазы I и Липазы II представлен в табл. 3.
В обоих изоферментах содержание неполярных аминокислот (35,77 и 35,50 %) было невысоким. Подобные данные сообщены для липазы Rh. delemar и Humicola lanuginosa [27], Mucor hiemalis [28], Candida parapsilosis [29]. Гидрофобных аминокислот в изоферментах было больше в 1,34-1,4 раза, чем полярных заряжен-
ных. У липаз Rh. microsporus количество неполярных остатков было больше полярных в 1,3-
1,6 раза [30, 31]; для панкреатических липаз свиньи и крысы оно практически одинаково [32].
Между изоформами наблюдалось большое соответствие в аминокислотном составе за исключением Asx, Pro, Gk, Arg, Ser и Val. Подобие состава аминокислот наблюдается иногда не только между изоферментами, но и видами, принадлежащими к одному роду грибов. Высокое сходство (около 50%) у липаз Rh. oryzae 1403 наблюдается с липазой Rhizomucor miehei [33].
Таким образом, доказано, что биосинтез липаз микромицетом Rh. oryzae 1403 носит ин-дуцибельный характер. С большой достоверностью можно утверждать, что этот продуцент способен синтезировать два липолитических фермента. По всей видимости, в данном случае происходит контроль на уровне экспрессии генов липазы.
4.08.2011
Список литературы:
1. Zhang Y., Liu J., Qiu L., Shi Y., Su Z., Xia Y., Li F. Optimisation of cultivation conditions of a mutant of Trichosporon laibachii CBS 5791 for enantioselective resolution of ketoprofen ester // Ann. Microbiol. - 2005. - V. 55, №2. - P. 101-106.
2. Iwai M., Tsujisaka Y., Okamoto Y., Fukumoto Y. Lipid reguirement for lipase production by Geotrichum candidum // Agr. Biol. Chem. - 1973.- V. 37, №4.- Р. 929-931.
3. Рубан Е. Л. Микробные липиды и липазы. - М.: Наука, 1977. - 216 с.
4. Вецозола А. О., Лука В. Т. Сравнительное изучение влияния растительных масел и ПАВ на биосинтез липазы дрожжами Candida paralipolytica 739 // В сб.: Влияние условий культивирования на активность продуцентов.- Рига, 1980.- С. 156-159.
5. Yang X.-h., Yin C.-h., Fu S.-z., Wang B.-w., Tan T.-w. Оптимизация культуральной среды для продукции липазы иммобилизованными клетками Rhizopus arrhizus и свойства липазы // Zhongguo youzhi = China Oils and Fats. - 2004. - V 29, №7. - P. 29-32.
6. Ксандопуло Г. Б. Влияние некоторых жиров и поверхностно-активных веществ на липазную активность грибов рода Geotrichum // Микробиология. - 1974.- Т. 43, №6.- С. 1001-1004.
7. Dalmau E., Montesinos J. L., Lotti M., Casas C. Effect of different carbon sources on lipase production by Candida rugosa // Enzyme Microb. Technol. - 2000. - V. 26, №9-10. - P. 657-663.
8. Yasser Refaat A.-F. Optimization of thermostable lipase production from a thermophilic Geobacillus sp. using Box-Behnken experimental design // Biotechnol. Lett. - 2002. - 24, №14. - P. 1217-1222.
9. Zhang L. Y., Wei D. Z., Tong W. Y. Effective inducers for lipase production by Candida rugosa // Ann. Microbiol. - 2003. - V. 53, №4. - P. 499-504.
10. Dai D., Xia L. Enhanced production of Penicillium expansum PED-03 lipase through control of culture conditions and application of the crude enzyme in kinetic resolution of racemic allethrolone // Biotechnol. Progr. - 2005. - V. 21, №4. - P. 1165-1168.
11. Hasan F., Shah A. A., Hameed A. Influence of culture conditions on lipase production by Bacillus sp. FH5 // Ann. Microbiol. -2006. - V. 56, №3. - P. 247-252.
12. Султанова И. Г., Зубенко Т. Ф. Влияние некоторых поверхностно-активных веществ на биосинтез липазы грибом штамм Rhizopus microsporus УзЛТ-1 // Узбекский биолог. журнал.- 1976.- №5.- С. 71-72.
13. Haperburg D., Kleber H.-P. Exracellu^re lipase aus Acinetobactercalcoaceticus // Acta Biotechnologica. - 1982. - V. 2, №4. - P. 337-342.
14. Wang H.-j., Mei Z.-q., Liu X.-z., Huang Y.-b., Piao Z.-s. Условия синтеза липазы Plancoccus migula in vitro // Jilin daxue xuebao. Lixue ban = J. Jilin Univ. Sci. Ed. - 2002. - V. 40, №4. - P. 430-432.
15. Longhi S., Fusetti F., Grandon T., Lotti M., Vanoni M., Alberghina M. Cloning and nucleotide sequence of two lipase genes from Candida cylindracea // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - V. 1131. - P. 227-232
16. Chang R.-C., Chou S.-J., Shaw J.-F. Multiple forms and functions of Candida rugosa lipase // Biotechnol. Appl. Biochem. -1994. - V. 19. - P. 93-97.
17. Ibrik A., Chahinian H., Rugani N. et al. Biochemical characterization of triacylglycerol lipase from Penicillium cyclopium // Lipids. - 1998. - V. 33. - P. 377-384.
18. Sanchez A., Ferrer P., Serrano A., Pernas M. A., Valero F., Rъa M. L., Casas C., Sok C. Characterization of the lipase and esterase multiple forms in an enzyme preparation from a Candida rugosa pilot-plant scale fed-batch fermentation // Enzyme Microb. Technol. - 1999. - V. 25, №3-5. - P. 214-223.
19. Гааль Э. Электорофорез в разделении биологических макромолекул. - М.: Мир, 1982. - 446 с.
20. Детерман Г. Гель-хроматография. - М.: Мир, 1970. - 320 с.
21. Yamada K., Machida H. // Nippon ^geikagaku Kaishi (in Japanese). - 1992. - V. 36. - P. 858-860.
22. Lin S.-F., Chion C.-M., Tsai Y.-C. Effect of triton X-100 on alkaline lipase production by Pseudomonaspseudoalcaligenes F-111 // Biotechnol Lett. - 1995. - V. 17, №9. - P. 959-962/
23. TanakaJ., Sudo T., Ihara F., Nihira T., Yamada Y. Increased production of lactonizing lipase (Lip I) from Pseudomonas sp. strain 109 by lipids and detergents // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1999. - V. 63, №5. - P. 900-904.
24. Ota Y., Sawamoto T., Hasuo M. Tributyrin specifically induces a lipase with a preference for the sn-2 position of triglyceride in Geotrichum sp. F0401B // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2000. - V. 64, №11. - P. 2497-2499.
25. Kohno M., Kugimiya W., Hashimoto Y., Morita Y. Purification, characterization, and crystallization of two types of lipase from Rhizopus niveus // Bioici. Siatech. Blochem. - 1994. - V. 58, №6. - P. 1007-1012.
26. Lotti M., Tramontane A., Longhi S, Fusetti F., Brocca S., Pizzi E., Alberghina L. Variability within the Candida rugosa lipases family // Protein Engineering. - 1994.- V. 7, №4. - P. 531-535.
27. Derewenda U., Swenson L., Green R. et al. Conformational lability of lipases observed in the absence of an oil-water interface: crystallographic studies of enzymes from the fungi Humicola lanuginosa and Rhizopus delemar//J. Lipid Res. - 1994. - V. 35. -P. 524-534.
28. Hiol A., Jonzo M. D., Druet D., Comeau L. Production, purification and characterization of an extracellular lipase from Mucor hiemalis f. hiemalis // Enzyme Microb. Technol. - 1999. - V. 25, №1-2. - P. 80-87.
29. Neugnot V., Moulin G., Dubreucq E., Bigey F. The lipase/acyltransferase from Candida parapsilosis. molecular cloning, purification and characterization of purified recombinant enzymes // Eur. J. Biochem. - 2002. - V. 269. - P. 1734-1734.
30. Давранов К. Д., Куйлибаев И. Т., Розмухамедова Б. Х., Махсумханов А. А. Некоторые свойства внеклеточной липазы Rhizopus microsporus УзЛТ-3 // Прикл. биохимия и микробиол. - 1995. - Т. 31, №4. - С. 405-411.
31. Диеров Ж. Х., Циоменко А. Б., Давранов К. Д., Кулаев И. С. Очистка и свойства внутриклеточных липаз гриба Rhizopus microsporus // Биотехнология. - 1993. - №7. - С. 26-30.
32. Брокерхоф К., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М.: Мир, 1978.-396 с.
33. Herrgard S., Gibas C. J., Subramaniam S. Role of an electrostatic network of residues in the enzymatic action of the Rhizomucor miehei lipase family // Biochemistry. - 2000. - V. 39, №11. - P. 2921-2930.
Сведения об авторах Шеламова Светлана Алексеевна, доцент кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии, кандидат технических наук, доцент 394017, г. Воронеж, пр-т Революции, д. 19, тел. (473)2555557, e-mail: [email protected] Тырсин Юрий Александрович, заведующий кафедрой органической и пищевой химии Московского государственного университета пищевых производств (МГУПП),
доктор технических наук, профессор г. Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, тел. (499)1587134, e-mail: [email protected]
UDC 577.153.2 Shelamova S.A.1, Tyrsin Yu.A.2
1Voronezh state technological academy; 2Moscow state university of food production; e-mail: [email protected]; [email protected]
INDUCTION OF BIOSYNTHESIS OF LIPASE BY MICROMICETES
Biosynthesis of lipazy Rh oryzae 1403is induced by triglycerides, fat acids and their derivatives - twins. The highest effect was produced by olive oil, twin 80 and oleic acid. The producer is able to synthesize the two produce lipolytic enzymes, molecular weight was the same of both isoenzymes, and was 44 ± 2 kDa. Between izoformsi there was great satisfaction in amino acid content.
Key words: lipase, Rhizopus, biosynthesis.
