CC BY
8
Б1ОЛОГ1Я
DOI 10.29254/2077-4214-2018-1-2-143-52-55 УДК 636.92:591.441 Дунаевська О. Ф.
1МУНОГ1СТОХ1М1ЧНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ СЕЛЕЗ1НКИ СВИН1 Житомирський нацiональний агроекологiчний унiверситет (м. Житомир)
Зв'язок публшацм з плановими науково-дослщ-ними роботами. Виконане дослiдження е части-ною науковоТ тематики кафедри анатомп i пстологп факультету ветеринарноТ медицини Житомирсько-го нацiонального агроекологiчного унiверситету «Розвиток, морфологiя та гiстохiмiя органiв тварин у нормi та при патологи», № державноТ реестрацп 0113У000900.
Вступ. Важливим напрямком фундаментальних дослiджень селезшки е iмуногiстохiмiя. Сучаснi iму-ногiстохiмiчнi методи дослiдження створюють мож-ливост для з'ясування стромальних взаемозв'язкiв в орган [1]. Це зумовлено тим, що iмунна система, в тому чи^ лiмфоíдна тканина селезiнки, мае уш-кальну здатнiсть розпiзнавати антигени i специфiчно реагувати на них. Молекули (маркери) СD е рецепторами лiмфоцитiв, якi вiдображають стан зршосл клiтин та ступiнь Тх диференщаци. Клiтинну ланку iмунiтету характеризують Т-лiмфоцити, зокрема СD4+ (Т-хелпери), СD8+ (Т-кiлери або цитотоксичнi клiтини). Серед Т^мфоцилв СD8+ важливими е кли тини пам'ятi [2,3]. За гуморальну iмунну вiдповiдь вiдповiдають В-лiмфоцити, для яких маркерами е СD19+, СD20+. Зараз проводиться iмунофенотипу-вання лiмфоцитiв у нормi, за патологiчних сташв органiзму, пiд впливом рiзних чиннимв [4,5,6,7]. До-слiдження останнiх рошв дозволили встановити, що в Т-залежнш зонi селезiнки (перiартерiальнi лiмфо-Тдш пiхви (ПАЛП) домiнують лiмфоцити СD3+ i СD4+, у зовнiшнiх вщдмах зони бiльш полiморфний склад, присутш популяцп В-лiмфоцитiв. В Т-незалежнiй зон (свiтлий центр (СЦ), мантiйна зона (МанЗ) лiмфоíд-ного вузлика (ЛВ) виявлявся рiзноманiтний популя-цiйний склад лiмфоцитiв: В-лiмфобласти; дендритнi клiтини, як фiксують антиген i зберiгають його про-тягом тривалого часу; вшьш макрофаги; невелика кiлькiсть Т-лiмфоцитiв [2,8]. Т^мфоцити СD8+ лока-лiзуються не тшьки в бiлiй (БП), а й у червонш пульпi (ЧП) селезшки [9]. Необхщними для морфолопчноТ характеристики селезiнки е iмуногiстохiмiчнi досли дження, якi дозволяють встановити розподш та вмiст Т- i В-жмфоцилв.
Мета дослiдження. З'ясувати особливостi iмуногiс-тохiмiчноí характеристики селезiнки свинi свшськоТ, що грунтуеться на вивченнi локалiзацíí, розподiлу, ктькос-тi субпопуляцiй лiмфоцитiв СD4+, СD8+, СD19+, СD20+.
Отримаш данi будуть включенi до показнишв тест-системи органу в нормк
Об'ект i методи дослщження. Для дослiдження здiйснювали вiдбiр селезiнки в стади морфофункци ональноТ зрiлостi у кл^чно здорових статевозрiлих свиней домашшх Sus scrofa, forma domestica L., 1758 (8-10 мкящв, кiлькiсть 56) обох статей у стввщно-шенш 1:1 ТОВ «Волиньагрохолдинг» с. Маяки Луць-кого району ВолинськоТ обласл, ТОВ «Агрофiрма Брусилiв» смт. Брусилiв Брусилiвського району Жи-томирськоТ обласл. Матерiал фiксували в 10-12 %-му охолодженому розчиш нейтрального формалшу, в подальшому заливали в парафiн [10]. Зрiзи виготов-ляли на санному мiкротомi МС-2 товщиною не бшь-ше 5 мкм. Для виявлення субпопуляцш лiмфоцитiв при свiтловiй мтроскопи за допомогою мiкроскопiв МБИ-10 та Мк^ МС-50 (Австрiя) використовува-ли мишиш моноклональнi антитiла датськоТ фiрми DAKO, маркери CD4+, CD8+, CD19+, CD20+. Визначали розмiщення та вмiст (абсолютну i вiдносну кiлькiсть) [10].
Уся експериментальна частина дослщження була проведена зпдно з вимогами мiжнародних принци-пiв «бвропейськоТ конвенцп щодо захисту хребет-них тварин, як використовуються в експериментi та шших наукових цтях» (Страсбург, 1986 р.) та вщпо-вiдного Закону УкраТни «Про захист тварин вiд жор-стокого поводження» (№ 3447-IV вщ 21.02.2006 р., м. КиТв).
Результати дослщжень та ix обговорення. Нашими попереднiми дослiдженнями встановлено, що вщносна площа БП селезiнки становила 11,11±1,5 %, ЧП - 78,87±2,36 %, вiдносна площа Т-залежних зон - 5,5 %, В-залежних зон - 5,61 % [11]. Зпдно наших iмуногiстохiмiчних дослщжень селезшки свиней, у яких пстоархп"ектошка селезшки вже сформована, клп"ини з маркерами CD4+ розмщеш дифузно (рис. 1). Характерним е i розташування у невеликш кшь-костi Т-клiтин з маркерами CD4+ в маргшальнш зонi (МЗ) ЛВ. При лм в перiартерiальнiй зонi (ПаЗ) ЛВ спо-стеркаеться велика концентрацiя клiтин з маркерами CD4+, CD8+, якi ткно прилягають до адвентицiю судин (рис. 1). В центральнш зонi вузлика мiстяться клiтиннi скупчення з 2-3 лiмфоцитiв CD8+. В окремих випадках поодинок клiтини з маркерами CD4+, CD8+ виявляються i поза зоною ЛВ. В СЦ, МанЗ, МЗ скон-
центрован! л'|мфоцити з маркерами CD19+, CD20+. В ЧП селез'шки л'|мфоцити CD4+, CD8+, CD19+, CD20+ мають розр'щжене розташування.
Зпдно цитоморфометричного анал'ву селез'шки свин'|, л'|мфоцити з маркерами CD4+ розпод'тялись в пульп1нер1вном1рно: переважна б'тьш'юъ лока-л'вувалась в ЛВ (66,97 %), в ПАЛП БП селез'шки ви-являлось 30,73 % в'|д загально! к'тькосп популяцш пульпи, незначна решта (2,30 %) розташовувалась в ЧП (рис. 2). У структур'1 ЛВ так л'|мфоцити розпо-д'теш також нер'|вном'|рно. Так, 39,95 % було лока-л'вовано в ПаЗ, що нараховувало 26,17±7,43 шт. на ум. од. пл. Найменша кшьшсть таких л'|мфоцит'|в ви-являлась в МанЗ ЛВ (6,52 % або 4,24±1,28 шт. на ум. од. пл.). В СЦ ЛВ !х к'тьк'юъ дор'тнювала 20,43±5,12 шт. на ум. од. пл., в МЗ - 14,63±3,07 шт. на ум. од. пл. Л1мфоцити CD8+ були переважно сконцентроваш в ЛВ БП (60,28 %). В ПАЛП нараховувалось 22,28±4,17 шт. на ум. од. пл. (38,1 % в'щ загально! к'тькосп популяцп в пульп селез'шки), в ЧП вм'ю дор'|внював 1,62 %, що становило лише 0,95±0,78 шт. на ум. од. пл. В ЛВ селез'шки !х к'тьк'юь переважала майже в 1,5 рази у пор'|внянн'| з ПАЛП i становила в'щпов'щно 35,25±9,26 шт. на ум. од. пл., i розташовувались вони щ'тьшше. Морфометричними досл'щженнями вста-новлено, що в МанЗ ЛВ дано!' популяцп було значно менше у пор'тнянш з СЦ ЛВ у 5,95 раз'|в (2,39±0,85 шт. на ум. од. пл. i 10,86±2,83 шт. на ум. од. пл. в'щпо-в'|дно). В ПаЗ ЛВ к'тьк'юь л'|мфоцит'|в CD8+ становила 14,21±2,38 шт. на ум. од. пл., що становила 40,3 % в'|д загально! к'тькосп ЛВ БП селез'шки.
Серед популяцш В-л'|мфоцит'|в пульпи селез'шки свиш дещо переважали СD19+-лiмфоцити у пор'тнянш з л'|мфоцитами CD20+ (75,14±7,13 i 71,95±7,36 шт. на ум. од. пл. в'щпов'щно). Найб'|льша к'|льк'|сть таких л'|мфоцит'|в знаходилась в ЛВ (58,56±8,49 шт. на ум. од. пл.), найменша в ЧП (6,46±2,17 шт. на ум. од. пл.), що становило 77,93 % i 8,6 % в'щпов'щно. В ПАЛП БП !х частка дор'|внювала 13,47 %, що нараховувало 10,12±3,28 шт. на ум. од. пл. В ЛВ л'|мфоцити CD19+ дом'|нували в МЗ, !х к'|льк'|сть становила 26,33±5,43 шт. на ум. од. пл., що складало 44,96 % в'|д популяцп ЛВ БП селез'шки свин'|. В СЦ ЛВ к'тьмсть л'|мфоци-т'|в СD19+ становила 29,92 % в'|д загально!' к'|лькост'| таких л'|мфоцит'|в ЛВ БП i дор'|внювала 17,52±3,41 шт. на ум. од. пл. В МанЗ i ПаЗ ЛВ л'|мфоцити з маркерами СD19+ займали 14,38 % та 10,74 % в'|д загально!' 1'х к'тьмсп ЛВ (8,42±2,73 i 6,29±1,84 шт. на ум. од. пл. в'|дпов'|дно). 1мунопстох'|м'|чн'|досл'|дження встано-вили розпод'|л л'|мфоцитами з маркерами СD20+ на-ступним чином: 76,96 % локал'вовано в ЛВ БП, 13,0 % в ПАЛП БП i 7,23 % в ЧП, що дор'|внювало 55,37±7,21, 9,35±2,17 i 7,23±1,14 шт. на ум. од. пл. в'щпов'щ-но. Дан'| л'|мфоцити в ЛВ розпод'тялись под'|бно до л'|мфоцит'|в з маркерами СD19+, тобто, найб'|льша частка виявлялась в МЗ (43,83 %), найменша - в ПаЗ ЛВ - 9,08 %, !х к'|льк'|сть при цьому нараховувала 24,27±4,06 шт. на ум. од. пл. i 5,03±1,29 шт. на ум. од. пл. в'|дпов'|дно.
Рис. 1. Розмiщення лiмфоцитiв CD4+, CD8+ навколо артерГ| ПАЛП. Гематоксилiн з дофарбовуванням гематоксилiном Майера. х160.
Рис. 2. Розподiл лiмфоцитiв в пульпi селезiнки свинi (%).
Висновки
1. Популяцп л'|мфоцит'|в СD4+, СD8+, СD19+, СD20+ розташовувались поодиноко та дифузно в червонш пульп'|, утворювали ланцюги i скупчення в б'тш пуль-п'| селез'|нки свин'|.
2. К'|льк'|сть л'|мфоцит'|в СD4+ в ПАЛП селез'шки в'|д загально!' к'тькосп популяц'|й пульпи становила 30,73 %, решта л'|мфоцит'|в СD4+ розташовувалась в ЛВ та червонш пульп'|. Кл'|тини СD8+ локал'|зувались переважно в ЛВ (60,28 %), в ПАЛП ця к'тьмсть була значно меншою (38,1 %)., в ЧП не перевищувала 1,62 %.
3. Серед популяцш В-л'|мфоцит'|в дещо переважали СD20+-лiмфоцити у пор'|внянн'| з СD19+. Най-б'|льше вони були сконцентроваш в ЛВ - 76,96 %. Л'|мфоцити СD19+ дом'|нували в ЛВ - 77,93 %. В ЧП селез'шки к'тьк'юъ л'|мфоцит'|в СD19+ та СD20+ була б'|льшою за к'тьк'юъ л'|мфоцит'|в СD4+, СD8+ майже вдв'|ч'|. Сл'|д зазначити, що в марг'шальнш зон'| ЛВ БП зустр'|чались вс'| субпопуляцй' у майже однакових к'тькостях, що зумовлено функц'|ею кооперативно!' взаемодп Т- i В-л'|мфоцит'|в.
Перспективи подальших досл1джень. Подальш'| досл'|дження плануемо спрямовувати на вивчення 1нших субпопуляц'|й л'|мфоцит'|в селез'|нки у свиней з врахуванням р'|зних в'|кових та породних груп.
Лггература
1. Kvaratsheliya AG, Klochkova SV, Nikityuk DB, Alekseeva NT. Morfologicheskaya harakteristika timusa i selezyonki pri vozdeystvii faktorov razlichnogo proishozhdeniya. Zhurnal anatomii i gistopatologii. 2016;5(3):77-83. [in Russian].
2. Panikar II. Morfogenez organiv imunnoyi sistemi sviyskoyi svini na rannih etapah postnatalnogo periodu ontogenezu [avtoreferat]. K.: NYBiP; 2015. 42 s. [in Ukrainian].
3. Brinza L, Djebali S, Tomkowiak M, Mafille J, Loiseau C, Schicklin S, et al. Immune signatures of protective spleen memory CD8 T cells. Scientific Reports. 2016. DOI: 10.1038/srep37651
4. Dunaievska OF. Imunogistohimichna harakteristika subpopulyatsiy limfotsitiv selezinki kroliv. Visnik problem biologiyi i meditsini. 2017;3;2(138):60-3. [in Ukrainian].
5. Dunaievska OF. Imunogistohimichna harakteristika subpopulyatsiy limfotsitiv selezinki golubiv ta kurey. Ukrainian Journal of Ecology. 2018;8(1):282-8. Dostupno: DOI: http://dx.doi.org/ 10.15421/2018_213 [in Ukrainian].
6. Xiaoxu D, Gao S, Li J, Wu L, Zhang Y, Li W, et al. Acute arsenic exposure induces inflammatory responses and CD4+Tcell subpopulations differentiation in spleen and thymus with the involvement of MAPK, NF-kB, and Nrf2 / Nrf2. Molecular Immunology. 2017;81:160-72. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm. 2016.12.005 0161-5890
7. Benkisser-Petersen M, Buchner M, Dorffel A, Duhren-von-Minden M, Claus R, Klasener K, et al. Spleen Tyrosine Kinase Is Involved in the CD38 Signal Transduction Pathway in Chronic Lymphocytic Leukemia. PLOS ONE. 2016 December 30. DOI: 10.1371/journal.pone.0169159
8. Fedorovskaya NS, Dyakonov DA. Immunomorfologicheskaya harakteristika selezyonki pri tsitopeniyah immunnogo genezisa. Kirov: Avers; 2013. 101 s. [in Russian].
9. Seo YJ, Jothikumar P, Suthar MS, Zhu C, Grakoui A. Local Cellular and Cytokine Cues in the Spleen Regulate In Situ T Cell Receptor Affinity, Function, and Fate of CD8+ T Cells. Immunity. 2016 [cited 10 Dec 2016];45:988-98. Available from: http://dx.doi.org/10.1016 /j.immuni.2016.10.024
10. Goralskiy LP, Homich VT, Kononskiy OI. Osnovi gistologichnoyi tehniki i morfofunktsionalni metodi doslidzhen u normi ta pri patologiyi. Zhitomir: Polissya; 2012. 288 s. [in Ukrainian].
11. Dunaievska OF. Morfometrichni osoblivosti selezinki sviney. Visnik Lvivskogo un-tu. Ser.: biologichna. 2016;72:202-9. [in Ukrainian].
1МУНОГ1СТОХ1М1ЧНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ СЕЛЕЗ1НКИ СВИН1 Дунаевська О. Ф.
Резюме. Представлен результати розмщення, кшьшсного вмкту субпопуляцш лiмфоцитiв CD4+, CD8+, CD19+, CD20+ селезшки статевозртих свиней втом 8-10 мкящв, вирахувано iмунорeгуляторний шдекс. Встановлено, що лiмфоцити CD4+, CD8+ бтьше зосереджувалися в пeрiaртeрiaльних лiмфоTдних nixBax та пeрiaртeрiaльних зонах лiмфоTдного вузлика. 1мунорегуляторний шдекс пульпи селезшки дорiвнювaв 1,71. Серед популяцш В^мфоцилв незначно переважали CD 19+. Найбтьше лiмфоцитiв CD19+, CD20+ локaлiзувaлось в мaнтiйнiй, мaргiнaльнiй зонах та св^лому цeнтрi лiмфоTдних вузликiв.
Ключовi слова: сeлeзiнкa, iмуногiстохiмiя, CD-лiмфоцити, морфологiя, морфомeтрiя, свиня, пульпа, лiмфоTдний вузлик.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЕЛЕЗЕНКИ СВИНЬИ Дунаевская О. Ф.
Резюме. Представлены результаты размещения, количественного содержания субпопуляций лимфоцитов CD4+, CD8+, CD19+, CD20+ пульпы селезёнки половозрелых свиней возрастом 8-10 месяцев, рассчитан иммунорегуляторный индекс. Установлено, что лимфоциты CD4+, CD8+ больше сосредоточивались в пери-артериальных лимфоидных влагалищах и периартериальных зонах лимфоидного фолликула. Иммунорегу-ляторный индекс пульпы селезёнки был равен 1,71. Среди популяций В-лимфоцитов незначительно преобладали CD19+. Больше всего лимфоцитов CD19+, CD20+ локализовалось в мантийной, маргинальной зонах и светлом центре лимфоидных фолликулов.
Ключевые слова: селезёнка, иммуногистохимия, CD-лимфоциты, морфология, морфометрия, свинья, пульпа, лимфоидный фолликул.
IMMUNOHISTOCHEMICAL INVESTIGATION OF THE PIG'S SPLEEN Dunaievska О. F.
Abstract. Immunohistochemical studies should be carried out at the pathological states of the organism, first of all, with violations in the work of the immune system, the study of the impact on the population of various factors. It is especially important to implement it for productive farm animals in order to obtain safe food products.
Object and methods. For research was selection of mature spleens of pig (8-10 months) of both sexes (ratio female: male was 1:1).
For histological studies, pieces of material are recorded in a 10-12% refrigerated neutral formalin solution, with subsequent filling in paraffin. The paraffin sections were made at the sledge microtome MC-2, with a thickness of fewer than 5 microns. For the detection and study of lymphocyte subpopulations, light microscopy used mouse monoclonal antibodies from the Danish firm DAKO, markers of CD4 +, CD8 +, CD19 +, and CD20 +. The placement and content (absolute and relative quantity) and the quantitative population ratio were determined.
Research results. Subpopulations of lymphocytes with CD4+, CD8+, CD19+, and CD20+ were isolated and diffuse, often forming chains or clusters. The lymphocytes with markers CD4+, CD8+, CD19+, CD20+ have a rarefied location in the red pulp of the spleen.
CD4+ lymphocytes were unevenly distributed in the pulp: the overwhelming majority was localized in lymphoid nodule (66,97 %), in lymphoid sheats near the vessels of white splenic pulp was 30,73 % of the total number of pulp populations, the smallest remainder (2,30 %) was located in red pulp. In the structure of lymphoid nodule, these lymphocytes were also distributed unevenly: 39,95 % were localized in the zone near the vessels, 6,52 % - in mantle zone of lymphoid nodule (or 4,24±1,28 pieces per unit area), in the light centre of lymphoid nodule their number was equal to 20,43±5,12 pieces per unit area, in the marginal zone - 14,63±3,07 pieces per unit area). The CD8+ lymphocytes were predominantly concentrated in the lymphoid nodule of white pulp (60,28 %), the remainder - in lymphoid sheats near the vessels, to wit 38,1 % or 22,28±4,17 pieces per unit area and insignificant in red pulp -1,62 %, which was only 0,95±0,78 pieces per unit area. The morphometric studies have shown that in the mantle zone of the lymphoid nodule of this population was significantly less in 5,95 times the light center of the lymphoid nodule (2,39±0,85 pieces per unit area and 10,86±2,83 pieces per unit area, respectively). The amount of lymphocytes CD8+ in the in a zone near the vessels of the lymphoid nodule was 14,21±2,38 pieces per unit area, which was 40,3 % of the total number of lymphoid nodule white pulp spleen.
Among the populations of B-lymphocytes, the spleen of the pig's spleen was slightly superior to CD19 + -lymphocytes compared with lymphocytes with markers of CD20+ (75,14±7,13 and 71,95±7,36 pieces per unit area, respectively). The largest number of these lymphocytes were found in the lymphoid nodule (77,93 %), and the lowest - in red pulp (8,6 %). In lymphoid sheats near the vessels of the white pulp, their share was 13,47 %. In lymphoid nodule, lymphocytes CD19+ were dominated in the marginal zone (44,96 %). In the light center of a lymphoid nodule, the number of lymphocytes CD 19+ was amounted to 29,92 % of the total number of this lymphoid nodule in white pulp lymphocytes and was 17,52±3,41 pieces per unit area. In the mantle zone and zone near the vessels of lymphoid nodule lymphocytes with markers CD19+ were occupied 14,38 % and 10,74 % of their total lymphoid nodule number. Immunohistochemical studies have established the distribution of lymphocytes with markers of CD20+ as follows: 76,96 % was localized in the lymphoid nodule of white pulp, 13,0 % in a zone near the vessels of white pulp and 7,23 % in red pulp.
Key words: spleen, immunohistochemistry, CD-lymphocytes, morphology, morphometry, pig, pulp, lymphoid follicles.
Рецензент - проф. Блаш С. М.
Стаття наджшла 20.03.2018 року
DOI 10.29254/2077-4214-2018-1-2-143-55-61 УДК 57.017.053:615.91 Кратенко Р. I.
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ЗАГАЛЬНОТ ТОКСИЧНО1' ДМ
КРАУН-ЕТЕР1В НА ОРГАН1ЗМ ТЕПЛОКРОВНИХ ТВАРИН Хармвський нацюнальний педагопчний ушверситет iMeHi Г.С. Сковороди (м. Хармв)
Зв'язок публшацм з плановими науково-до-слщними роботами. Робота е фрагментом НДР «Мехашзм бюлопчноТ дм ксенобютишв на оргашзм теплокровних тварин» (№ державноТ реестраци 0111и011921).
Вступ. Попередш нашi повщомлення стосувались бюлопчноТ активност краун-етерiв у шд гострому [1,2] та хрошчному [3] токсиколопчних експеримен-тах, i було показано негативний вплив цих речовин на стан мембран кл^ин, процеси мтросомального окиснення, деяк ланки ендокринноТ системи щурiв.
Метою даного дослщження було вивчення за-гальноТ токсичноТ дм речовин на оргашзм теплокровних тварин в умовах гострого та пщ гострого токсиколопчних експерименлв.
Об'ект i методи дослщження. Токсиколопчш до-слщження з визначенням параметрiв токсичност ви-конаш на статевозртих щурах популяцп Wistar, бтих мишах та морських свинках з урахуванням методич-них вказiвок О.М. eлiзаровоТ [4]. У кожнш груш було
по 10 тварин. Тваринам перорально за допомогою зонда вводили водш розчини речовин одноразово у дiапазонi доз 1,0-10,0 г/кг маси у випадку гострого експерименту та щоденно протягом 30 дiб у дозах 1/10, 1/100 i 1/1000 LD50 у випадку тдгострого. Тваринам контрольноТ групи вводили вщповщш об'еми води. Дослщження бiохiмiчних параметрiв здшсню-вали через 30 дiб тсля початку експерименту, а для деяких - ще й на 15-ту добу у кров^ яку вщбирали з пщ'язиковоТ вени.
Клiнiчнi прояви гострого отруення вивчали з урахуванням методичних рекомендацш eлiзаровоí [4]. Дози були обраш таким чином, щоб визначити летальний ефект в iнтервалi доз LD0-LD100. Спосте-реження за тваринами проводили протягом 15 дiб. Реестрували час загибелi тварин i сумарну кшьшсть введеноТ речовини. Оцшювання результат проводили на пща^ середнього ефективного часу заги-белi тварин [5].
