CC BY
209
ДИАГНОСТИКА ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МАММОЛОГИЯ 4 ’2006
ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Н.Н. Волченко, М.В. Савостикова
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена
IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDY IN BREAST CANCER
N.N. Volchenko, M.V. Savostikova
P.A. Herzen Moscow Research Oncological Institute
The paper presents the results of500 immunocytochemical (ICC) studies of the receptors of estrogens, progesterone, proliferative activity protein, and the oncoprotein C-erB-2 in 150 patients with breast cancer (BC). Receptor expression of estrogen, progesterone, proliferative activity protein, and the oncoprotein C-erb-2 was observed in 44, 42, 86, and 54% of cases, respectively. Comparison of the data of ICC and immunohistochemical studies showed that on determining the receptors of estrogen and progesterone, the results agreed in 88.3% of the patients and on determining those of proliferative active protein and the oncoprotein C-erb-2, the results accorded in 83.0 and 93.2%, respectively.
The use of an ICC study makes it possible to extend the capabilities of current morphological studies, to assess prognostic factors before surgery, and to determine sensitivity to chemohormonal treatment.
За последние годы достигнут значительный прогресс в клиническом использовании различных биологических маркеров. В их числе онкогены, рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), маркеры апоптоза, рецепторы факторов роста и т. д. Все эти показатели позволяют более детально изучить молекулярно-биологические особенности злокачественных опухолей, ассоциируются со степенью дифференцировки, способностью к инвазии и метастазированию, чувствительностью к химиотерапии, а следовательно, с особенностями течения и прогнозом заболевания в каждом конкретном случае [1—3]. В настоящее время имеется несколько сотен различных моно- и поликлональных антител, выявляющих экспрессию тех или иных белков, связанных со структурными компонентами клетки, продуктами клеточного синтеза (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов), рецепторами и т. д. Однако наивно полагать, что с помощью антител можно прямо идентифицировать раковые клетки, скорее антитела лишь указывают на изменения картины генной экспрессии [4].
В связи с этим особое значение приобретает изучение клинического течения, лечения, гормонального статуса и факторов прогноза при раке молочной железы (РМЖ), эндометрия, легкого, толстой кишки и т.д. Экспрессия онкобелков семейства C-erbB-2, различных маркеров апоптоза — Ь^-2, bcl-x, p-53, CD-95 и др., а также показатели пролиферативной активности опухолевых клеток Ю-67, PCNA коррелируют с исходом заболевания, т.е. выживаемостью и вероятностью возникновения рецидива у пациента [5]. У больных распространенным РМЖ особенно актуальным является определение гормональной и лекарственной чувствительности опухолей для индивидуального подбора схем терапии [6—9]. Лучшие результаты эндокринной терапии РМЖ дос-
тигаются при РЭ+- и РП+-статусе, чем при других вариантах рецепторного фенотипа [10]. Положительные результаты лечения получены у 77% больных с наличием экспрессии в опухолевых клетках обоих рецепторов, при этом 5-летняя безрецидивная выживаемость возросла на 20—30% [11]. Рецепторположительные опухоли молочной железы имеют более высокую диффе-ренцировку и более благоприятное клиническое течение [5, 12, 13]. Эффективность гормонотерапии составила 27% при опухолях с РЭ+ и РП- и 46 % при статусе РЭ- и РП+. При статусе РЭ- и РП- адекватный ответ на лечение наблюдали в 10—15% случаев соответственно [11]. В практических целях для установления положительного гормонального статуса опухоли достаточно иметь 5—10% четко окрашенных клеток [5].
В настоящее время в клиниках и лабораториях используется большой арсенал диагностических методик. Так, для определения гормонального статуса опухолей молочных желез в равной мере используются три метода: радиоли-гандный, иммуноферментный и иммуногистохи-мический (ИГХ). Первые два метода — биохимические, основанные на реакции связывания лиганда в гомогенате (цитозоле) опухолевых клеток, позволяют количественно оценить рецепторный статус, тогда как ИГХ-метод определяет принадлежность гормонорецепторов именно к опухолевым клеткам, что практически невозможно при биохимических исследованиях [5, 12, 14]. ИГХ-исследование, широко применяемое в клинической практике, также имеет ряд недостатков, среди которых основными являются потеря и маскировка антигена при приготовлении препаратов, а также более длительное время определения молекулярных маркеров. В качестве альтернативы ИГХ-методу все больший практический интерес приобретает метод определения
Рис. 1. Слабая экспрессия белка пролиферативной активности Ю-67 в клетках РМЖ, х 100
Рис. 2. Умеренная экспрессия РЭ в клетках РМЖ, х 400.
Рис. 3. Выраженная экспрессия онкопротеина C-erbB-2 в клетках РМЖ, х 400
экспрессии молекулярных маркеров на клеточном уровне — иммуноцитохимический (ИЦХ) [15]. Тот факт, что пункционная биопсия более простая, малотравматичная процедура, практически не сопровождающаяся осложнениями, позволяющая получить достаточное количество клеточного материала для ИЦХ-исследования, говорит о неоспоримых преимуществах ИЦХ. Иммуноцитохимия не требует больших временных затрат, выполняется быстро в течение 2—3 ч. Замечено, что мембранные и цитоплазматические маркеры чаще положительно окрашиваются в цитологических, чем в гистологических препаратах. Возможно, это связано с более щадящей обработкой цитопрепаратов, отсутствием потери и маскировки антигенов при проводке и депара-финизации материала с использованием агрессивных химических реагентов, что негативно сказывается на мембранных и цитоплазматических рецепторах [15, 16]. Иногда возможности ИЦХ-метода ограничиваются плохим качеством мазков или малым количеством клеток в цитопрепаратах [15, 17]. Для решения этой проблемы
Рис. 4. Слабая экспрессия РП в клетках РМЖ, х 100
на сегодняшний день широко используются так называемые жидкостные системы, когда пункта-ты, полученные под контролем УЗИ, вносят в специальную среду накопления и затем центрифугируют ее для концентрации малого количества клеток в одном мини-поле на стекле. Многие авторы отмечают большие преимущества таких препаратов: клетки располагаются в монослое, сохраняется их архитектоника, уменьшаются фон и количество элементов крови, концентрация клеток в одном месте значительно экономит дорогие сыворотки, улучшается качество результатов ИЦХ-исследования [17—20].
Сопоставление результатов экспрессии молекулярных маркеров при ИЦХ- и ИГХ-методах проводилось рядом исследователей [21, 22]. Получена хорошая корреляция: совпадение результатов ИЦХ- и ИГХ-исследований составило от 61 до 92% [22—27].
Цель настоящей работы — определить возможности ИЦХ-метода в оценке некоторых прогностических факторов РМЖ на доопера-ционном этапе.
ДИАГНОСТИКА ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МАММОЛОГИЯ 4 ’2006
ДИАГНОСТИКА ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МАММОЛОГИЯ 4 ’2006
Таблица 1. Частота и характер экспрессии РЭ, РП, белка пролиферативной активности Кi-67 и онкопротеина C-erbB-2 при РМЖ
РЭ РП Ki-67 C-erbB-2
Экспрессия абс. % абс. % а о\ . % абс. %
Отрицательная 84 56 87 58 21 14 69 46
Положительная 66 44 63 42 129 86 81 54
Слабая 27 44 33 53 66 51 19 24
Умеренная 25 38 21 32 45 35 35 43
Выраженная 12 18 9 15 18 14 27 33
Таблица 2. Анализ совпадений и несовпадений результатов ИЦХ- и ИГХ-исследования
ИЦХ+ ИГХ- ИЦХ- ИГХ+ Число несовпадений Число совпадений
абс. % абс. % абс. % абс. %
РЭ 4 6,7 3 5 7 11,7 53 88,3
РП 5 8,3 2 3,3 7 11,7 53 88,3
Ki-67 1 1,7 9 15,5 10 17 49 83
C-erbB-2 4 6,8 0 4 6,8 55 93,2
Выполнено 500 ИЦХ-исследований материала, полученного от 150 больных. Все ИЦХ-иссле-дования проводили на дооперационном этапе с целью уточняющей диагностики и назначения не-оадъювантной химиогормонотерапии. В работе были использованы моноклональные кроличьи и мышиные антитела (DAKO): к рецепторам эстрогенов (клон 1D5, разведение 1:35), к рецепторам прогестерона (клон 636, разведение 1:50), к белку пролиферативной активности Ki—67( клон MiB-1, разведение 1:50—1:75), онкопротеину C-erbB-2 (разведение 1:250—1:350). Для визуализации иммунной реакции использовали систему LSAB+ Detection System (DAKO) согласно инструкции, пе-роксидазную активность выявляли с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB), цитопрепараты докрашивали гематоксилином Майера и заключали в бальзам. Реакции проводили на цитологических монослойных мазках, полученных при накоплении пунктатов в специальной питательной среде с последующим центрифугированием на системе «Cytospin-3» в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин.
Антитела к РЭ и РП использовали в 150 исследованиях. Для изучения факторов прогноза анализировали экспрессию белка пролиферативной активности Ki-67 и онкопротеина C-erbB-2 у 100 пациенток. Подсчет иммунопозитивных клеток проводили в областях с максимальным проявлением диаминобензидина на 200—300 опухолевых клеток на микроскопе «Axioskop» (OPTON, West Germany). Экспрессию с антителами к РЭ, РП и белку пролиферативной активности Ki—67 оценивали как положительную при интенсивном темно-коричневом окрашивании ядер, реакцию с
антителами к С-егЪВ-2 отмечали при четком окрашивании мембран в опухолевых клетках. Результаты считались отрицательными при полном отсутствии или экспрессии антигена менее чем в 5%, слабо положительными — при реакции в 5—24%, умеренно положительными — в 25—74% опухолевых клеток, выраженная реакция отмечалась при экспрессии антигена более чем в 75% раковых клеток (рис. 1—4).
При оценке гормонального статуса карцином молочной железы ИЦХ-методом положительная экспрессия РЭ была выявлена в 44% (66) исследований, РП — в 42% (63), пролиферативная активность с антителами Ю-67 отмечена в 86%, экспрессия онкопротеина С-егЪВ-2 — в 54% исследований (табл. 1).
Сопоставление данных ИЦХ- и ИГХ-иссле-дования у 60 больных РМЖ показало совпадение результатов при определении РЭ и РП в 88,3% случаев (табл. 2).
Процент совпадений и несовпадений результатов определения экспрессии РП при ИЦХ- и ИГХ-исследованиях мало чем отличался от такового при экспрессии РЭ (см. табл. 2). Расхождения в результатах ИЦХ- и ИГХ-исследований рецепторного статуса при РМЖ объясняются гетерогенностью опухоли.
Расхождение результатов определения экспрессии Ю-67 ИЦХ- и ИГХ-методами было наиболее значимым по сравнению с другими маркерами и составило 17%, причем в 9 случаях результаты были положительными при ИГХ- и отрицательными — при ИЦХ-исследовании. Только в одном наблюдении экспрессия белка Ю-67 выяв-
лялась ИЦХ- и не выявлялась ИГХ-методом, что объясняется асинхронностью митотической активности в опухолевых клетках и, как следствие, значительным разбросом в значениях индекса Ю-67 в пределах одной опухоли.
Высокий процент совпадений — 93,2% (55) исследований ИЦХ- и ИГХ-исследований наблюдался при анализе экспрессии онкопротеина С-егЪВ-2 (см. табл. 2).
Результаты нашего исследования свидетельствуют о больших возможностях ИЦХ-метода в предоперационной диагностике и оценке некоторых факторов прогноза течения опухолевого процесса. Возможность до начало лечения опреде-
лить рецепторный статус опухоли и важнейшие факторы, влияющие на прогноз и разработку схем химиотерапии, позволяет адекватно спланировать лечение до получения гистологического заключения. Между результатами ИЦХ- и ИГХ-исследо-ваний прослеживаются четкие корреляции: доля совпадений составляет от 83 до 93%.
Таким образом, использование ИЦХ-метода позволяет расширить возможности современных морфологических методов исследования и на до-операционном этапе оценить прогностические факторы, выявить агрессивные свойства опухоли и прогнозировать чувствительность к химиогор-мональному лечению.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зборовская И.Б., Ельчева И.А., Татосян А.Г. Новое в терапии рака молочной железы. Под ред. Н.И. Переводчиковой. М., 1998. с. 11—8.
2 Казанцева И.А., Федосенко А.К., Гуревич Л.Е. Иммуноцитохимические исследования в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных поражений щитовидной железы. Арх патол 2001; 4:18.
3. Gasparini G., Pozza F., Harris A.L. Evaluating the potential usefulness of new prognostic and predictive indicators in node-negative breast cancer patients. J Natl Cancer Inst 1993;85(15):1206—19.
4. Cемиглазов В.Ф. Карцинома in situ молочной железы — морфологические и клинические проблемы. Практич онкол 2002;3(1):60—8.
5. Петров С.В.
Иммуногистохимическая диагностика опухолей щитовидной железы, матки, яичников, яичек. В кн.: Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань, РИЦ «Титул»; 2000. с. 72.
6. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по
иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань, 2000. с. 13—4.
7. Cooper L.S., Gillett C.E., Patel N.K. et al. Survival premenopausal breast carcinoma patients in relation to menstrual cycle timing of surgery and estrogen receptor/progesterone receptor status of the primary tumor. Cancer 1999;86(10):2053—8.
8. Elisei R., Pinchera A., Romei C. et al. Expression of thyrotropin receptor (TSH-R), thyroglobulin, thyroperoxi-dase, and calcitonin messenger ribonucleic acids in thyroid carcinomas: evidence of the TSH-R gene transcript in medullary histotype. J Clin Endocrinol Metab 1994;78(4):867—71.
9. Guiter G.E., Gatscha R.M.,
Zakowski M.F. ThinPreRpvs. conventional smears in fine-needle aspirations of sarcomas: A morphological and immunocytochemical study. Diagn Cytopathol 1999;21(5):351—4.
10. Bozzetti C., Nizzoli R., Naldi N. et al. Fine-needle aspiration technigue for the concurrent immunocytochemical evaluation of multiple biologic parameters in primary breast carcinoma. Breast Cancer Res Treat 1994;32;221—8.
11. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. Статистика рака молочной железы. В кн.: Новое в терапии рака молочной железы. М., 1998. с. 6—10.
12. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы. Практич онкол 2002;3(1):38—44.
13. Пожарисский К.М., Леенман Е.Е. Значение
иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний. Арх патол 2000; 62(5): 3—11.
14. Bai H., Sung C.J., Steinhoff M.M. ThinPrepR Pap Test promotes detection of glandular lesions of the endocervix. Diagn Cytopathol 2000;23(1):19—22.
15. Глухова Е.И. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, при раке молочной железы. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2003.
16. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А., Крячок И.А. Диагностическая
иммуноцитохимия опухолей. Киев, Морион; 2003. с. 28—31.
17. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. Опыт применения иммуноцитохимического исследования в онкологической практике. Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии. Томск, 2003.
18 Хериет Э.Р., Гаттер К.С. Молекулярная клиническая
диагностика. Методы. Под ред.
С. Херрингтона и Дж. Макги. М.,
Мир; 1999. с. 20—1.
19. Gasparini G., Toffoli G., Berlanda G., Rossi C. A pharmacological rationale for neoadjuvant chemotherapy with adri-amycin in locally advanced breast cancer. Anticancer Res 1990;10(1):193—6.
20. Ozaki O., Ito K., Mimura T. et al. Anaplastic transformation of papillary thyroid carcinoma in recurrent disease in regional lymph nodes: a histologic and immunochemical study. J Surg Oncol 1999;70(1):45—8.
21. Allred D.C., Harvey J.M., Berardo M., Clark G.M. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohisto-chemical analysis. Mod Pathol 1998;11(2):155—68.
22. Makris A., Allred D.C., Powles T.J. et al. Cytological evaluation of biological prognostic markers from primary breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat 1997;44:65—74.
23. Gown A.M. Diagnostic immunocy-tochemistry: manual. Seattle, Pheno Path, 1999.
24. Harris L.N., Liotcheva V., Broadwater G. et al. Proc. ASCO. 1999;18: abstr. 407.
25. Droese M. Aspiration Cytology of the Thyroid. Atlas and Manual. Stuttgart, N Y, 1995. p. 256.
26. Nizzoli R., Bozzetti C., Naldi N. et al. Comparison of the results of immunocytochemical assays for biologic variables on preoperative fine-needle aspirates and on surgical specimens of primary breast carcinomas. Cancer Cytopathol 2000;90:61—6.
27. Nizzoli R., Bozzetti C., Savoldi L. et al. Immunocytochemical assay of estrogen and progesterone receptors in fine needle aspirates from breast cancer patients. Acta Cytol 1994;38:933—8.
28. McGuire W.L. Hormone receptors: their role in predicting prognosis and response to endocrine therapy. Semin Oncol 1978;5:428—33.
ДИАГНОСТИКА ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МАММОЛОГИЯ 4 ’2006
