CC BY
45
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СДВИГИ ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЁЗЕ А.М. Коваленко, Д.А. Евглевский, Б.М. Тагирмирзоев
Аннотация Рассмотрены вопросы использования иммуноферментных и иммуногистохимических методов исследования при сальмонеллезе, а также данные по вовлечению в иммунологический ответ при этом заболевании субпопуляций Т-лимфоцитов, В-лимфо-цитов и макрофагов.
Ключевые слова: сальмонеллез, иммунофермент-ный метод.
Сальмонеллёзы рассматриваются как одно из наиболее важных инфекционных заболеваний коммерческого птицеводства. Этот возбудитель вызывает гибель птицы и является причиной возникновения токсикоин-фекций у человека. Причиной усиления опасности заболевания и возможности заражения человека может быть бессимптомное переболевание сальмонеллёзом и хроническое носительство возбудителей. Длительное проживание сальмонелл в организме больного может иметь врожденный характер.
Важным обстоятельством, усложняющим меры борьбы с сальмонеллёзом, является многообразие серо-варов сальмонелл у птиц в различных странах и в различное время. Помимо основных возбудителей сальмонеллёза S. enteritidis, S. pullorum, S. gallinarum, а в настоящее время всё чаще ещё и S. typhimurium, от птиц выделяют около десяти различных сероваров этого микроорганизма.
Всё вышесказанное подчеркивает важность и сложность организации мер профилактики сальмонеллёза птиц, базирующихся, прежде всего, на создании высокочувствительных и специфических методов диагностики, создании активных иммунизирующих препаратов, изучении особенностей иммунной реакции при этом заболевании. Методологической базой таких работ всё больше становится использование иммуноферментных методов в микробиологических, иммунологических и иммуногистохимических исследованиях с применением поликлональных и моноклональных антител.
В настоящее время иммуноферментный сорбционный метод (ИФА) получил признание и применение при диагностике сальмонеллёза. Этот тест с использованием антилипополисахаридных и антифлагеллино-вых антител оказался по сравнению с серологическим тестом более чувствительным и специфичным. Чувствительность этого теста при диагностике сальмонеллёза в ИФА составила 93,6%, а специфичность - 94,9%. Испытание теста ИФА с использованием липополисаха-ридов сальмонелл показало, что с его помощью можно выявлять 100% инфицированных поросят. Специфичность метода составила 94%, а чувствительность - 97% (Proux К. и др., 2000). Высокую активность показали при испытании в ИФА липополисахариды, О-полисахариды или мембранные седиментированные антигены, которые позволили идентифицировать антитела, связанные с естественной инфекцией птиц и анти-тельным ответом на вакцину (Solano С. и др., 2000). Преимуществом метода ИФА является то, что он позволяет выявлять антитела при послеинфекционных осложнениях, когда невозможно выявить микроорганизмы (Isoniaki О. и др., 1989). Диагностику сальмонеллёза можно проводить путём применения в ИФА IgG антител к S. enteritidis, используя липополисахаридный и экстрагированный теплом антигены (Nicholas R. А. и др., 1991). ИФА тест позволил осуществлять скрининговые исследования при выполнении программ
контроля и ирадикации сальмонеллёза в Голландии (van Zijederveld F. G. и др., 1992) и Дании (Feld N.C. и др., 2000).
Достаточно широкое применение получил метод ИФА при исследовании на обсеменённость мяса, молока и кормов (Sachsenweger О. и др., 1994; Brigmon R. L. и др., 1995). Заслуживает внимания программа контроля сальмонеллёза в свиноводстве (Германия, Дания), которая основывается на исследовании с помощью ИФА мясного сока (Steinbach G. и др., 2000).
Общепризнано, что энзим-связанный иммуносор-бентный тест (ИФА) с использованием липополисахаридного (ЛПС) антигена сальмонелл более чувствительный, чем капельный (пластинчатый) или агглюти-национный тест. Он позволяет выявлять большее количество птицы, которая давала отрицательные результаты в реакции на стекле или при постановке реакции агглютинации в пробирке, и обнаруживает высокие титры у части птицы, от которой после смерти не изолировали сальмонелл.
Почти одновременно с разработкой техники ИФА для детекции антигенов, сорбированных на полимерную твердофазную основу (плашки), начали проводиться исследования по разработке методов иммуно-ферментного анализа для выявления антигенов в клетках (и на их поверхности), а также в тканевых срезах и мазках больных животных. Здесь также нашли применение одноступенчатый, двухступенчатый и трехступенчатый методы иммунного окрашивания. Наиболее чувствительным и широко применяемым является метод, основанный на комплексе авидин-биотина, связанного с пероксидазой.
При изучении гистопрепаратов, обработанных им-мунопероксидазой, следует учитывать, что эритроциты и гранулоциты обладают собственной эндогенной пероксидазой и это может приводить к появлению неспецифической окраски и затруднению их оценки. В этом случае применение вместо пероксидазы хрена щелочной фосфатазы может явиться хорошей альтернативой с применением в этом случае в качестве хромогена неофуксина и красного прочного.
Для энзимного маркирования антигенов в срезах были разработаны различные иммуногистохимические методы (Vandesande F., 1983). Простейшим методом является прямое соединение (конъюгирование) энзима с первичным антителом (одноэтапный метод). Энзим может также присоединяться в дальнейшем к вторичному антителу, который вступает в реакцию с первичным антителом (двухэтапный метод) и который в данном случае выполняет роль антигена.
В иммуногистохимических исследованиях успешно используется и иммунофлюоресцентная техника, которая позволяет обнаруживать небольшое количество антител в пробах материала.
Однако наиболее оправдал себя и получил широкое применение во многих лабораториях мира авидин-биотиновый метод (Avidin-biotin complex - ABC). С помощью него можно быстро обнаруживать антигены. Он обладает высокой специфичностью и чувствительностью.
Последним достижением иммуногистохимии является метод гибридизации in situ (ISH), используемый, в частности, для детекции хламидиозных антигенов (A. Bemdt, 2001). "In situ" гибридизация принадлежит к молекулярно-биологическому методу детекции хлами-дий в срезах ткани или в клеточных препаратах. Обнаружение окрашенных хламидий проводится с помощью
светового микроскопа. ISH требует больших затрат времени и предполагает участие лабораторного персонала, владеющего молекулярно-биологическим опытом. Оценка препаратов при плохом морфологическом сохранении ткани, в том числе и клеточной культуры -затруднена.
Метод обнаружения спаренных видоспецифических ДНК- или РНЕС-зондов с комплементарными ДНК или РНК отрезками в гистологических препаратах. Для детекции зонды должны быть конъюгированы с маркирующими молекулами (например, дигиксигенином, биотином или флюоросцеином). В случае применения дигиксигенина (DJG) последний комплементарно спаривается с зондом целевой ДНК или РНК, и при добавлении связанных с энзимом анти-DJG-антител энзим-субстрата -становится возможной реакция с соответствующим хромогеном. Киг-системы для этой реакции производятся фирмами Luxo в Доссенгейме и Kreatech в Гамбурге.
Тип использованного иммунно гистохимического метода в исследованиях может быть различным и зависит как от возможностей, так и от характера поставленных задач.
Однако всё же нельзя не отметить, что наиболее рутинным становится авидин-биотиновый тест, которому отдают предпочтение большинство учёных, особенно в тех случаях, когда возникает необходимость выявить небольшое количество антигена. Этот тест стал также применяться для обнаружения антигенов возбудителей болезней в тканях при диагностике таких заболеваний, как инфекционный ринотрахеит (G.H. Smith, J. К. Со1-lirigirs, J. Carman, 1989), губчатая энцефалопатия скота, хламидиоза (A. Bemdt, 2001).
Данных по применению иммуногистохимических методов для обнаружения в тканях антигенов сальмонелл в доступной литературе мы не обнаружили.
Однако имеются публикации о применении иммуногистохимических методов при изучении особенностей формирования иммунитета после вакцинации или заражении цыплят сальмонеллёзом. И среди них особый интерес представляют пока ещё немногочисленные работы по использованию методов иммуногистохими-ческого анализа для определения изменений субпопуляций лимфоцитов при этом заболевании с применением моноклональных антител, позволяющих проводить их кластер-дифференциацию по поверхностным антигенам (Sasai К. и др., 1997).
Исследования были проведены в птицеводческом хозяйстве ЗАО «Краснояружский бройлер» Белгородской области на разновозростном поголовье тттицьт. Для проведения исследований брали по 100 голов тттицьт из двух площадок, куда входили иммунизированные и не иммунизированные против сальмонеллеза особи. Изучали изменения субпопуляций лимфоцитов при развитии постинфекционного и поствакцинального иммунитета с помощью общепринятых методов иммуногистохимии при развитии сальмонеллезной инфекции и специфического противосальмонеллезного иммунитета (A. Bemdt U. Methner, 2001, Babu U. 2003). Также проводили иммунизацию лабораторных белых мышей и изучали соотношение CD4/CD8 субпопуляций лимфоцитов крови.
Наши исследования клеточных композиций субпопуляций лимфоцитов крови (CD4+CD8+; CD4'CD8+; CD8+TcRl+; CD8TcRl+; CD8+TcRl') после орального применения неаттенуированного штамма Salmonella typhimurium и аттенуированного вакцинного штамма Salmonella vac® однодневным цыплятам по сравнению с необработанными цыплятами с помощью метода проточной цитофлюорометрии согласовались с данными A. Bemdt U. Methner (2001). Одновременно изучали Т-клеточные субпопуляции (CD4+, CD8+, TcRl+ (у5), TcR2+ (a|3)) в слепой кишке, селезёнке и Фабрициевой
бурсе) с применением методов иммуногистохимии. У цыплят, зараженных Salmonella typhimurium 421 или вакциной против сальмонеллёза, установлено увеличение процента CD8+TcRl+ в крови на 7-9 или на 10 день по сравнению с контрольными животными. Соотношение CD4 к CD8 составляло около 3:1 у инфицированных животных 5-дневного возраста. В органах обработанных животных количество CD8+ и TcRl+ клеток заметно увеличивалось на 4 и 5 день в слепой кишке на 8 и 9 - в бурсе, на 9 и 12 - в селезёнке.
Следует сделать вывод, что иммунизация однодневных цыплят вакциной приводит к таким же изменениям в клеточном составе, как и после инфицирования неаттенуированным эпизоотическим штаммом сальмонелл. Заметное увеличение процента CD8+TcRl+ клеток с двойной позитивностью у обработанной птицы указывает на важную роль этой субпопуляции клеток в иммунологической защите против заражения сальмонеллёзом
Увеличение соотношения CD4/CD8 наблюдали после иммунизации и инфицирования мышей Salmonella typhi, что согласуется с данными зарубежных исследователей. Эти данные коррелируют с исследованиями Babu U. с соавт. (2003), где было показано, что применение живой вакцины против сальмонеллёза сопровождается повышением содержания количества CD4 и TcR2 и соотношения CD4/CD8, уменьшением TcRl, в то время как введение убитой вакцины приводило к заметному увеличению CD8, TcRl и TcR2.
Полученные данные по клеточному иммунитету при сальмонеллёзе и использовании живых и убитых противосальмонеллёзных вакцин, на основании определения изменений субпопуляций лимфоцитов в иммунитете этого заболевания, представляют большой научный интерес и в значительной мере определяют подходы к дальнейшему развитию этого перспективного направления исследований в ветеринарной и гуманной медицине.
Поверхностные маркеры лимфоцитов и макрофагов при сальмонеллёзе изучали и другие исследователи. Иммунохи-мическое изучение зоба при сальмонеллёзе птиц проводили К. Н. Seo с сотр. (2003), кластерные маркеры дендритных клеток селезёнки при этом заболевании исследовали U. Yrlid с соавт. (2002), индукция CD8+ лимфоцитов у иммунизированных мышей определялась Odilia L. С с соавт. (2002), динамику субпопуляций CD3+, CD8+ и CD4+, а также процентное содержание IgG+ и IgM+ в цекальной тонзиле после заражения цыплят S. enteritidis детально исследовали K. Sasai с соавт. (2000).
Список использованных источников
1 Babu Ü., Scott М. et al. Effects of live and killed Salmonella vaccine on lymphocyte mediated immunity in laying hens. II Veterinary immunology and immunopathology. - 2003,-№91. - P.39 - 44.
2 Bemdt A., Methner U. Gamma/delta T cell response of chickens after oral administration of attenuated and non-attenuated Salmonella typhimurium strains. II Veterinary immunology and immunopathology. - 2001,- №78. - P. 143-161.
3 Bemdt A. Microscopische Verfahren zum Nachweis von Chlamydien in Geweben und Zellkulturen. II Fachbeitrag Chlamydieninfectionen, W4, 2001, S.48 - 55.
Информация об авторах
Коваленко Анатолий Михайлович, доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».
Евглевский Дмитрий Анатольевич, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник Курского НИИ АПП.
Тагирмирзоев Багир Маилович, студент 5 курса факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».
