CC BY
20
УДК 616-076.5:616.37-002
Ключевые слова: панкреатит, цитокины, диагностика, лейкоциты
Key words: pancreatitis, cytokines, diagnosis, leukocytes
Андреева С. Д.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ДИАГНОСТИКА ЦИТОКИНОВ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ОСТРОГО ДЕСТРУКТИВНОГО ПАНКРЕАТИТА
IMMUNOLOGICAL ASPECTS AND DIAGNOSIS OF CYTOKINES IN THE SIMULATION OF ACUTE DESTRUCTIVE PANCREATITIS
ФГБОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия» Адрес: 610017, Россия г. Киров, Октябрьский пр., 133. Тел. (8332) 57-43-29
Vyatka State Agricultural Academy Address: 610006, Russia, Kirov, October pr., 133. Tel. +7 8332 57-43-29
Андреева Светлана Дмитриевна, к. в. н., проф. РАЕ, доцент каф. диагностики, терапии, морфологии и фармакологии
Andreeva Svetlana D., Ph.D. in Veterinary Science, Professor of the Russian Academy of Natural Sciences, Associate Professor of the Dept. of Diagnosis, Therapy, Morphology and Pharmacology
Аннотация. При моделировании острого деструктивного панкреатита у экспериментальных животных определено содержание цитокинов в сыворотке крови, что может быть ценным диагностическим и прогностическим критерием оценки тяжести патологического процесса.
Summary. In the simulation of acute destructive pancreatitis in experimental animals the content of cytokines in the blood serum was determined which can be a valuable diagnostic and prognostic criteria for assessing the severity of the pathological process.
Введение
Острый деструктивный панкреатит (ОДП) принято относить к заболеваниям реанима-толого-хирургического профиля [3]. В своих исследованиях мы посчитали необходимым обратиться к характеристикам ОДП, позволяющим рассматривать его патогенез с позиций иммунологии:
1) бимодальность патологического процесса с высокой клинической значимостью гнойно-септических осложнений, являющихся главной причиной летального исхода;
2) закономерное развитие панкреонекроза определяет патологический иммунный ответ и имеет яркое клиническое выражение;
3) диагностическое значение различных иммунологических и биохимических «маркеров» (цитокины, рецепторы, им-мунокомпетентные клетки и продукты их жизнедеятельности) позволяет производить объективную оценку тяжести ОДП, прогнозировать его течение, отвечать на важнейшие для клинициста вопросы (ожидаемая летальность, вероятность развития сепсиса, потребность в интенсивной терапии, хирургическом лечении и др.);
4) чувствительность больных ОДП к им-муноориентированной терапии (ИТ), которая способна решать как самостоятельные задачи (обеспечивать профилактику гнойных осложнений и генерализации инфекции), так и служить компонентом лечебного комплекса, улучшая переносимость хирургических вмешательств, эффективность санации деструктивных очагов, эрадика-ции патогенов и др. Прямое повреждение, задержки выделения панкреатического секрета, забрасывание в силу различных причин желчи (особенно инфицированной) в панкреатические протоки стимулирует активацию собственных протео- и липолитиче-ских ферментов и вазоактивных субстанций в самой железе. Активированный трипсин стимулирует процесс превращения других проферментов в активные агенты внутри железы, что индуцирует аутолиз паренхимы органа. К факторам защиты поджелудочной железы от самопереваривания можно отнести стойкую связь ферментов и ингибиторов, которая поддерживает энзимы в неактивном состоянии, а также синтез большинства ферментов в неактивном состоянии (трипсин,
химотрипсин, эластаза, карбоксипептидаза, фосфолипаза А и В); существование в крови неспецифических факторов инактивации протеолитических энзимов [3, 5].
В патогенезе ОДП панкреатическим ферментам отводится значительная, но не решающая роль. Повреждение мембранных структур и органоидов ациноцитов, в результате которого развивается дисхолия и пара-педез зимогенных гранул, следует рассматривать как первичный аффект панкреатита, т. к. выход ферментов из ацинарных клеток и их внутрижелезистая активация являются первичным пусковым механизмом прогрессирующего патологического процесса [2].
Исходя из современных взглядов [1, 2, 5, 7], в основе острого панкреатита лежит переход локального воспаления в системную воспалительную реакцию (systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Она в своем развитии проходит стадию активации эндотелиоцитов и клеток, участвующих в обеспечении неспецифической резистентности, с местной, а затем и системной продукцией первичных провоспалительных цитокинов (ЦК) (IL-1-a, TNF-a). Последующее накопление медиаторов в крови по принципу обратной связи активирует макрофаги, тучные клетки и тромбоциты, вызывая вторичную экспрессию цитокинов, в т. ч. IL-6, и белков острой фазы. Финалом SIRS становится генерализация воспалительной реакции, развитие диссеминированного вну-трисосудистого свертывания крови (ДВС-состояние), полиорганной дисфункции, а в последующем и полиорганной недостаточности [3, 7].
Инициация и основные этапы развития воспалительного ответа контролируются, главным образом, цитокинами, которые представляют собой группу полипептидных медиаторов, выполняющих функции месенджеров межклеточных взаимодействий, регулирующих интенсивность и продолжительность иммуновоспалительного ответа [4]. Эти медиаторы, в первую очередь, регулируют развитие местных защитных реакций в тканях поврежденной поджелудочной железы с участием различных типов клеток системы крови, соединитель-
ной ткани и эпителиев, опосредуя свои биологические эффекты через специфические рецепторные комплексы на поверхности клеток-мишеней [6, 8].
Защитная роль провоспалительных ци-токинов заключается в рекрутировании в зону повреждения эффекторных клеток (нейтрофилов, макрофагов), стимуляции их фагоцитарной и бактерицидной активности, индукции иммунного ответа, что в совокупности способствует элиминации детрита, а затем репарации поврежденной структуры тканей [10]. Избыточная и генерализованная продукция провоспалительных медиаторов приводит к развитию SIRS; дальнейшее нарастание концентрации служит причиной целого ряда патологических состояний, в частности полиорганной недостаточности, а это, в свою очередь, является причиной ранней летальности больных ОДП [5, 7, 9].
Расположение железы, тесная связь ее протоковой системы с желчевыводящей системой, прилегание к желудку и двенадцатиперстной кишке, крупным ветвям чревного ствола и воротной вене создают условия для вовлечения этих образований в патологические процессы [3]. Обширная сеть лимфатических сосудов, дренирующих интерстиций железы непосредственно в систему грудного лимфатического протока, способствует быстрому попаданию в циркулирующую кровь продуктов распада тканей, цитоки-нов, ферментов и других активных веществ. Еще один путь резорбции осуществляется через систему воротной вены: цитокины быстро поступают в портальный кровоток и по грудному лимфатическому протоку в системную циркуляцию, что способствует вовлечению печени в патологический процесс при острых и хронических заболеваниях и повреждениях ПЖ [10].
Среди медиаторов SIRS ведущую роль играют цитокины (ЦК) [2, 4, 5], что обусловливает особый интерес к ним как со стороны клиницистов, так и со стороны экспериментаторов. Однако при моделировании патологического процесса на мелких лабораторных животных объема полученной при взятии сыворотки крови зачастую недостаточно для выполнения всего комплекса исследований,
в связи с чем внимание ученых привлекают новые методы лабораторного анализа, основанные, в частности, на использовании мультиплексных технологий [6].
Материалы и методы
Мультиплексный анализ - тип медико-биологических аналитических подходов, позволяющих одновременно измерять многочисленные анализы в одном образце. Мультиплексные анализы предназначены для детектирования в биологическом образце различных биомолекул (от 10 до 1000) одного класса (ДНК, РНК или белков). В соответствии с типом детектируемых молекул, анализ базируется на использовании набора нуклеиновых кислот или белков. Например, мультиплексный иммунологический метод основан на применении латексных микрошариков, каждый из которых покрывается определенным типом антител и кодируется определенной комбинацией флуоресцентных квантовых точек. Метод позволяет проанализировать от 10 до 100 биологических маркеров в капле крови пациента в течение нескольких минут. Мультиплексная технология - очень перспективное направление в биологии. Она уже получила большое распространение в ПЦР-анализе (полимераз-но-цепная реакция) и завоевывает ведущие позиции в проточной цитометрии. Мультиплексный анализ позволяет оценивать несколько растворимых аналитов одновременно в образце небольшого объема.
Принцип мультиплексной технологии состоит в том, что последовательные реакции иммунологического связывания (формирование «сэндвича») проводятся на искусственных микросферах. Имеются две группы мелкодисперсных микрошариков (микросфер), отличающихся по размерам, одна из них состоит из шариков диаметром 5,5 мкм, другую составляют шарики диаметром 4,4 мкм, внутри каждой группы шарики различаются по интенсивности красной флуоресценции. Проточный цитометр по размеру и интенсивности флуоресценции определяет принадлежность микросфер к одной из 10 групп.
Сначала на цитограмме светорассеивания происходит разделение частиц по размеру:
A (5,5 мкм) и B (4,4 мкм). На следующих цитограммах частицы размеров A и B рассматриваются отдельно. На цитограмме флуоресценции отображаются 5 групп частиц одного размера. ЦК идентифицируется по собственной красной флуоресценции микрошариков. Концентрация рассчитывается по средней интенсивности красно-оранжевой флуоресценции меток.
Для удобного и быстрого проведения всех этих расчетов набор включает в себя специальное программное обеспечение. Оно полностью исключает ручную калибровку и прочие вычисления. Результаты исследования выдаются в форматах XLS (Microsoft ®Excel) и PDF (Adobe).
Таким образом, данная методика мультиплексного анализа, как уже отмечалось, чрезвычайно удобна для определения уровня ЦК в эксперименте, когда речь идет о мелких лабораторных животных (крысы, мыши), где зачастую для комплексных исследований требуется сыворотки больше, чем можно получить от животного.
В частности, нами был проведен опыт по моделированию острого деструктивного панкреатита на крысах с изучением целого ряда гистологических, иммунологических, биохимических, гематологических показателей, а также применена диагностика оценки цитокинового статуса сыворотки, полученной при взятии крови экспериментальных животных.
Исследование было выполнено на 25 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г, содержащихся в виварии факультета ветеринарной медицины Вятской государственной сельскохозяйственной академии (г. Киров).
Все операции проводили под эфирным наркозом, при создании модели панкреатита выполняли верхне-срединную лапарото-мию, иммобилизовывали поджелудочную железу и орошали последнюю хлорэтилом в течение одной минуты. После оттаивания железу погружали в брюшную полость и ушивали рану.
Забой животных производили на 1, 3, 7 и 14 сутки после операции, при декапитации забирали кровь, затем отделяли сыворотку,
в которой оценивали концентрацию следующих ЦК: интерферона-гамма (INF-y), фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a), интерлейкина-1-альфа (IL-1-a), интерлей-кина-4 (IL-4), гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и моноцитарного хемоаттрак-тантного протеина-1 (MCP-1); единица измерения ЦК - пг/мл.
Анализ проводили на цитометре Becman Coulter EPICS® XL™ в Кировском институте гематологии и переливания крови Минсоц-развития РФ. Для исследования сыворотки был использован набор «Rat Cytokines 6plex Kit» (Bender MedSystems, Австрия).
Результаты исследования
При анализе полученных данных был определен цитокиновый статус опытных животных, который приведен в таблице 1.
TNF-a относится к классу провоспали-тельных ЦК, которые продуцируются и действуют на иммунокомпетентные клетки, инициируя воспалительный ответ. Динамика TNF-a в ходе ОДП показала резкое повышение уровня ЦК в 1 сутки (1,05±0,12); данный показатель оставался высоким в течение всего эксперимента (3 сутки - 2,1±0,1; 7 сутки - 2,9±0,41; 14 сутки - 1,9±0,5). Во все сроки наблюдения имеет место достоверность различий (p < 0,05) по сравнению с нормой (0,31±0,065).
Высокий уровень этого ЦК является отражением активности и тяжести патологического процесса. Превышение нормы почти в 6 раз данного показателя в последнем сроке
наблюдения, с одной стороны, свидетельствует о том, что даже через 2 недели после воспроизведения патологического процесса воспаление в поджелудочной железе не купировано. С другой стороны, лишь к этому сроку повышается до нормы ГЬ-4, который является противовоспалительным ЦК и, соответственно, ограничивает развитие воспаления. Угнетение же данного показателя в более ранние сроки свидетельствует о том, что у экспериментальных животных в этот период времени катаболические процессы преобладали над анаболическими, что подтверждают и результаты морфологических исследований (наличие некрозов вплоть до последнего срока наблюдения). Динамика ГЬ-4 следующая: 1сутки - 0,04±0,01; 3 сутки - 0,02±0,017; 7 сутки - 0,001±0,005; 14 сутки - 0,07±0,09. Во все сроки наблюдения, кроме последнего, имеет место достоверность различий (р < 0,05 по сравнению с нормой (0,06±0,03)).
ГЬ-1-а также относится к провоспалитель-ным ЦК, как ТКР-а, инициирует и регулирует воспалительные процессы, активирует Т-лимфоциты и обладает аутокринным и паракринным действием. Динамика ГЬ-1-а в течение первой половины эксперимента была регрессивной (1 сутки - 0,6±0,06; 3 сутки - 0,3±0,14; 7 сутки - 0,27±0,08). Увеличение уровня ЦК ГЬ-1-а ко 2 неделе свидетельствует о развитии воспалительного процесса (14 сутки - 1,4±0,9). Во все сроки, кроме первых суток наблюдения, имеет место достоверность различий (р < 0,05) по сравнению с интактными животными (0,56±0,03).
Таблица 1.
Содержание цитокинов в сыворотке крови крыс при моделировании острого деструктивного панкреатита, М±т (п = 5 животных в каждой группе)
Вид цитокина, пг/мл Интактные животные Этап эксперимента, сутки
1 3 7 14
TNF-a 0,31±0,065 1,05±0,12* 2,1±0,1* 2,9±0,41* 1,9±0,5*
IL-1-a 0,56±0,03 0,6±0,06 0,3±0,14* 0,27±0,08* 1,4±0,9*
IL-4 0,06±0,03 0,04±0,01* 0,02±0,017* 0,01±0,005* 0,07±0,09
MCP-1 22,75± 4,85 28,7±1,9 33,2±4,7* 49,25±2,55* 47,6±1,68*
GM-CSF 1,4±0,2 1,9±0,4* 2,9±0,4* 2,3±2,8* 1,8±0,7*
INF-y 0,025±0,008 0,05±0,03 0,05±0,03 0,05±0,01 0
Примечание: * - p < 0,05.
МСР-1 характеризуется как моноцит-специфический хемоаттрактант, в основном продуцируемый в ответ на широкий спектр цитокинов (ТОТ'-а, ГЬ-1-а). Повышение уровня данных ЦК свидетельствует о высокой тканевой инфильтрации моноцитами, что подтверждается гематологическими показателями (моноцитоз). В ходе эксперимента, начиная с первых суток (28,7±1,9), данный показатель ЦК неуклонно возрастал (3 сутки - 33,2±4,7; 7 сутки - 49,25±2,55). По окончании опыта МСР-1 остался выше, чем у интактных крыс в 2 раза (14 сутки -47,6±1,68). Во все сроки наблюдения, кроме первых суток, имеет место достоверность различий (р < 0,05) по сравнению с нормой (22,75±4,85).
GM-GSF индуцирует рост и дифферен-цировку незрелых костно-мозговых клеток, а также ускоряет процесс созревания гра-нулоцитов и мононуклеарных макрофагов. Увеличение данного показателя прямопро-порционально развитию воспаления у экспериментальных животных. С началом ОДП его значение возрастает в 1,3 раза (1 сутки -1,9±0,4); максимального значения GM-GSF достигает к 3 суткам (2,9±0,4) и остается высоким в течение последующих двух недель (7 сутки-2,3±2,8; 14 сутки-1,8±0,7). Во все сроки наблюдения имеет место достоверность различий (р < 0,05) показателя GM-GSF в сыворотке крови опытных животных по сравнению с интактными крысами (1,4±0,2).
ГЫБ-у относится к интерферонам II типа. Он продуцируется макрофагами, КК и ТЫ-лимфоцитами непосредственно после их активации вирусными, бактериальными или паразитарными агентами, вызывающими воспаление. В нашем эксперименте панкреатит вызывался физическими методами, а не инфекционными агентами, поэтому уровень ГЫБ-у незначителен (табл. 1). Во все сроки наблюдения нет достоверности различий (р > 0,05) по сравнению с нормой (0,025±0,008).
Обсуждение
На основании приведенных данных мы можем сделать заключение о том, что высо-
кий уровень продукции провоспалительных цитокинов как феномена «цитокинового взрыва» и интенсивность развития панкреатита у экспериментальных животных находятся в прямой зависимости. Секреция интерлейки-нов в раннем посттравматическом периоде носит защитный характер и направлена на усиление антипротеазной активности сыворотки крови [2]. Возникновение генерализованного деструктивного очага значительно ослабляет резервы макрофагальной системы, «обезоруживает» нейтрофилы, подавляет функции лимфоцитов. Запуск ци-токинового каскада вызывает активизацию фибронолизина, комплемента и калликреин-кининовой системы [5, 7]. Результатом активации этих систем является выброс гистамина, серотонина, брадикинина, вызывающих генерализованную вазодилатацию и разобщение межклеточных связей в эндотелии сосудов [1]. Это способствует увеличению проницаемости микроциркуляторного русла и миграции из сосудов жидкости и плазменных белков, повышенной экссудации в брюшную полость, а также формированию отека и воспаления поджелудочной железы и близлежащих органов. Таким образом, определение цитокинов в сыворотке крови может быть ценным диагностическим и прогностическим критерием оценки тяжести патологического процесса.
Выводы
1. При моделировании острого деструктивного панкреатита наблюдается гиперци-токинемия, что является одним из показателей развития полиорганных изменений.
2. В ходе эксперимента по созданию модели ОДП увеличивается концентрация провоспалительных цитокинов (ТОТ'-а, ГЬ-1-а) как признак развития синдрома системной воспалительной реакции.
3. При остром деструктивном панкреатите в сыворотке крови крыс снижается уровень интерферона-гамма (ЮТ-у), что свидетельствует об угнетении пролиферации лимфоцитов и подавлении иммунитета животного.
Список литературы
1. Гринберг, Л. М. Сепсис и теория системной воспалительной реакции: попытка клинико-морфологи-
ческого консенсуса / Л. М. Гринберг, В. А. Руднов // Арх. патол. - 2007, № 4. - С. 56-59.
2. Долгих, Т. И. Роль фактора некроза опухоли, интерлейкинов-4 и 10 в развитии и прогрессировании воспаления у больных хроническим панкреатитом / Т. И. Долгих, Н. В. Ширинская, Н. Г. Гордиенко и др. // Цитокины и воспаление. - 2003, т. 2, № 4. - С. 40-43.
3. Канаян, А. С. Патологическая анатомия и патогенез панкреатита (экспериментальное исследование) : автореферат дисс... докт. мед. наук / Канаян А. С. -1985. - Москва. - 37 с.
4. Повещенко, А. Ф. Цитокины - факторы ней-роэндокринной регуляции / А. Ф. Повещенко, В. В. Абрамов, В. В. Козлов // Успехи физиологических наук. - 2007 - № 3. - С. 40-46.
5. Салиенко, С. В. Иммунологические аспекты патогенеза острого деструктивного панкреатита и коррекция нарушений рекомбинантным ГЬ-2 / С. В. Сали-
енко, Е. В. Маркелова, Б. А. Сотниченко // Цитокины и воспаление. - 2006, т. 5 - № 4. - С. 46-50.
6. Симбирцев, А. С. Цитокины - новая система регуляции защитных реакций организма / А. С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2002- № 1. - С. 9-14.
7. Тарасенко, В. С. Особенности иммунного статуса при остром панкреатите / В. С. Тарасенко,
A. И. Смолягин // Хирургия. -2000. - № 8. - С. 51-55.
8. Юшков, Б. Г. От иммунофизиологии к иммуно-патофизиологии / Б. Г. Юшков, В. Г. Климин // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2004 - № 4. - С. 101-104.
9. Bradley, JR. TNF-mediated inflammatory disease / JR. Bradley // J. Pathol. - 2008 - № 2. - P.149-0.
10. Sotnichenko, B. A. Application of interleukine-2 in all-inclusive treatment of acute destructive pancreatitis /
B. A. Sotnichenko, S. V. Salienko, E. V. Markelova // Pacific Medical Journal. - 2003 - № 4. - P. 39-41.
Jf
4
Ветеринарное Дерматологическое Общество стран СНГ Российский ветеринарный журнал Журнал JSAP /Российское издание
Уважаемые коллеги!
Представляем вашему вниманию Российскую версию официального издания Европейского Общества Ветеринарной Дерматологии, Американской Академии Ветеринарной Дерматологии, Всемирной Ассоциации Ветеринарной Дерматологии -журнал «Veterinary Dermatology».
Главный редактор российского издания - Дипломант Европейского колледжа Ветеринарной Дерматологии, Президент Ветеринарного Дерматологического Общества стран СНГ, Заведующая дерматологическим отделением сети клиник «Белый клык» Кузнецова Е. С.
E-mail: [email protected] Тел/факс: (495) 220-4816, 689-0575
СРВЖ)
Veterinary Dermatology
