CC BY
1214. Clarke M.B., Hughes D.T., Zhu C. et al. The QseC sensor kinase: abacterial adrenergic receptor. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006,103:10420-10425.
15. Durham-Colleran M.W., \ferhoeven A.B., van Hoek M.L. Francisella novicida forms in vitro biofilms mediated by an orphan response regulator. Microb Ecol. 2010, 59 (3): 457-465.
16. Jones B.D., Faron M., Rasmussen J.A., Fletcher J.R. Uncovering the components of the Francisella tularensis virulence stealth strategy. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014, 4: 1-10. doi: 10.3389/fcimb.2014.00032.
17. Margolis J.J., El-Etr S., Joubert L.-M. et al. Contributions of Francisella tularensis subsp. novicida chitinases and secretion system to biofilm formation on chitin. Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76 (2): 596-608.
18. OToole G A, Kolter R. Initiation of biofflm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds viamultiple, convergent signalling pathways: agenetic analysis. Mol. Microbiol. 1998, 28 (3): 449-461.
19. HoekM.L. Biofilms. An advancement in our understanding of Francisella species. Virulence. 2013,4 (8): 833-846. http://dx.doi.org/10.4161/viru.27023.
Поступила 15.01.16
Контактная информация: Клюева Светлана Николаевна, к.б.н.,
410005, Саратов, ул. Университетская, 46, р.т. (8452)51-52-12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
А А. Бывалое1-2, Л.Г-Дудина1, С.ГЛитвинец1, Е.А. Мартинсон1
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЕЦЕПЦИИ БАКТЕРИОФАГА ЧУМНОГО ПОКРОВСКОЙ
'Вятский государственный университет, Киров; 2Институт физиологии, Сыктывкар
Цель. Исследование механизма рецепции бактериофага чумного Покровской к клеткам Yersinia pestis с использованием панели моноклональйых антител. Материалы и методы. С помощью метода конкурентного ингибирования оценена способность моноклональйых антител к антигенным эпитопам наружной мембраны бактерий рода Yersinia ингибировать адгезию исследуемого бактериофага к клеткам Y. pestis штамм EV. Результаты. Подтверждена ключевая роль структуры углеводной природы в рецепции бактериофага Покровской. Установлено, что из пяти линий мо^оклональных антител к белковым эпитопам две вызывают существенную инактивацию адгезии бактериофага к бактериальным клеткам. Заключение. Высказано предположение о возможности участия в рецепции бактериофага Покровской клетками чумного микроба структуры полипептидной природы.
Журн. микробиол., 2016, № 4, С. 16—21
Ключевые слова: бактериофаг, Yersinia pestis; моноклональные антитела, адгезия AA.Byvalov12, LG.Dudina1, S.G.Litvinets1, E.A.Martinson'
IMMUNOCHEMICAL STUDY OF RECEPTION OF PLAGUE BACTERIOPHAGE POKROVSKY ,
'Vyatsky State University, Kirov; institute of Physiology, Syktyvkar, Russia
Aim. Study of mechanism of reception of plague bacteriophage Pokrovsky to cells of Yersinia pestis using a panel of monoclonal antibodies. Materials and methods. Using a method of competitive inhibition, the ability of monoclonal antibodies against antigenic epitopes of outer membrane of Yersinia genus bacteria to inhibit adhesion of the studied bacteriophage to cells of Y. pestis EV strain, was evaluated. Results. A key role ofstructure ofcarbohydrate nature in reception ofPokrovsky
bacteriophage was confirmed. Among 5 lines of monoclonal antibodies against protein epitopes 2 were established to cause significant inactivation of bacteriophage adhesion to bacterial cells. Conclusion. An assumption is proposed regarding participation of a structure of polypeptide nature in reception of Pokrovsky bacteriophage by cells of plague microbe.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 4, P. 16-21
Key words: bacteriophage, Yersiniapestis, monoclonal antibodies, adhesion ВВЕДЕНИЕ
Yersinia pestis — один из трех видов бактерий рода Yersinia, патогенных для человека. Эволюционно это самый «молодой» представитель вирулентных иерсиний [6], резко отличающийся от своих филогенетических предшественников — энтеропатогенов по эпидемиологическим и патогенетическим особенностям. Вызываемое Y. pestis заболевание — самая тяжелая в истории человечества бактериальная инфекция, три пандемии которой унесли жизни более 200 млн людей. Сохранение природных очагов чумы, ежегодно регистрируемые вспышки заболевания вызывают необходимость не только поддержания на существующем уровне, но и совершенствования всей системы противочумных мероприятий. Последнее приобретает особую актуальность в связи с широким распространением явления антибиотикорезистентности возбудителей многих инфекционных заболеваний, в том числе и чумы [13].
Указанная проблема чрезвычайно значима для чумной инфекции вследствие способности возбудителя передаваться воздушно-капельным путем, а также быстрого развития болезни в постинкубационный период, что может привести к невозможности своевременно выбрать и применить эффективную схему лекарственной терапии. В этой связи, в последние годы возобновился интерес исследователей и врачей-инфекционистов к возможности применения специфических фагов для лечения чумы [7], что предлагалось уже вскоре после выделения первых специфических чумных бактериофагов [14]. Однако в последующие десятилетия эта идея должного развития не получила. Вместе с тем, практика клинического применения бактериофагов для лечения людей от некоторых инфекционных заболеваний насчитывает без малого 100 лет [10].
Внедрение в современную лечебную практику новых средств, в том числе и бактериофагов, предполагает проведение широких исследований, включающих изучение механизмов и условий адгезии частиц бактериофага на микробной клетке. Общий механизм защиты бактерии основан на предотвращении адсорбции фага и/ или инъекции его генома в клетку путем выключения экспрессии соответствующего рецептора, секреции внеклеточных полисахаридов, ограничивающих доступ фага к рецептору, биосинтеза мембранных белков, препятствующих инъекции генетического материала фага в клетку и др. В свою очередь, бактериофаги располагают арсеналом способов преодоления иммунитета прокариотической клетки. Так, для повышения эффективности адгезии они могут использовать различные рецепторы на поверхности микроба, продуцировать ферменты, деградирующие внеклеточные полисахариды [11]. Механизмы взаимодействия специфических бактериофагов с клетками возбудителя чумы, в первую очередь, с использованием иммунохимических и биофизических методов, исследованы недостаточно. Вместе с тем, в последнее десятилетие секвенирован геном пяти чумных бактериофагов, наиболее востребованных в диагностической практике [15]. Идентифицированы рецепторы шести бактериофагов, локализованные на различных участках молекулы
2.ЖМЭИ 4 № 25-2016
17
липополисахарида (ЛПС) Y. pestis [9]. В предшествующих исследованиях нами был получен набор гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к ряду неидентичных антигенных эпитопов наружной мембраны иерсиний углеводной и белковой природы [2, 3].
Цель настоящей работы состояла в изучении способности к конкурентному ингибированию названными моноклональными антителами рецепции клетками штамма EV Y. pestis бактериофага Покровской.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали штамм Y. pestis EV, бактериофаг чумной Покровской и поликлональную лошадиную агглютинирующую сыворотку к цельным клеткам Y. pestis (ПЧС), полученные из коллекции Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», а также моноклональные антитела девяти линий (МКАт 1 — 9) к поверхностным антигенам бактерий рода Yersinia, полученные нами ранее [2, 3]. Культуру Y. pestis выращивали в течение 2 сут при температуре 27°С на плотной питательной среде — БТН-агаре (Биотехновация, Россия), затем инактивировали 0,3% формальдегидом.
Для обработки бактерий протеиназой К («Serva», США) 1 мл убитой культуры (-2-109 микробов/мл) осаждали центрифугированием, осадок ресуспен-дировали в 1 мл фосфатного буферного раствора (ЗФР) рН 7,3, содержащего протеиназу К в концентрации 0,2 мг/мл. Обработку ферментом проводили в течение трех часов при температуре 37°С. В контрольной пробирке клетки
выдерживали в ЗФР без добавления протеиназы К при температуре 37°С.
При обработке периодатом натрия («Acros Organics», США) 1 мл исследуемой бактериальной культуры (-2-109 микробов/мл) осаждали центрифугированием, и осадок ресуспен-дировали в 1 мл 50 мМ ацетатного буферного раствора (АБР) рН 5,2 со 100 (или 10) мМ NaIÜ4. Контролем служили клетки, ресуспендированные в ацетатном буфере без добавления периодата натрия. Препараты выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре в защищенном от света месте. Общим контролем служил препарат убитых клеток, ресуспенди-рованных в ЗФР и не подвергавшихся нагреванию при температуре 37°С.
После обработки бактерий протеиназой К и периодатом натрия все препараты (опытные и контрольные) отмывали один раз в ЗФР и ресуспен-диррвали в ЗФР до оптической плотности 1,2. при длине волны 600 нм. Смешивали 500 мкл суспензии бактериальных клеток и 100 мкл раствора бактериофага, содержащего 8-Ю5 БОЕ.
140л
120-100
Рис. 1. Влияние обработки клеток У. ревМв штамм ЕУ периодатом натрия и протеиназой К на адгезию бактериофага Покровской.
По оси абсцисс — препараты бактериофага: контроль — без микробных клеток; ЗФР — с клетками в ЗФР при комнатной температуре; АБР — с клетками в АБР; N3104-10 и N8104-100 с клетками, обработанными периодатом натрия в концентрации 10 и 100 мкг/ мл соответственно; 37"С — с клетками в ЗФР 37°С; ПрК — с клетками, обработанными протеиназой К. По оси ординат — остаточное кол-во бактериофага в над осадочной жидкости (здесь и на рис. 2). ,
Растворы инкубировали в течение 1,5 часов при температуре 37°С на термо-шейкере, после чего бактериальные клетки осаждали центрифугированием. Концентрацию оставшихся в надосадочной жидкости частиц бактериофага определяли по методу Грациа [4], результаты учитывали через 17 — 20 час.
Для оценки возможности конкуренции МКАт и бактериофага за сайты связывания на поверхности клеток Y.pestis суспензию инактивированных бактерий в ЗФР в концентрации (2 — 3)-109 микробов/мл инкубировали с МКАт (в виде асцитной жидкости) в разведении 1:100 для МКАт 1, 2, 5 — 7, 9и 1:50 для МКАт 3,4,8 или с ПЧС в разведении ЫООвтечение 1,5 часов при температуре 37°С в термошейкере. После центрифугирования осадок клеток ресуспендировали в ЗФР до оптической плотности 1<2 при длине волны 600 нм. Адсорбцию бактериофага на микробные клетки и определение концентрации бактериофага проводили по вышеописанной методике.
На рис. 1 и 2 представлены результаты в виде средних арифметических с доверительным интервалом для р=0,95. - ; .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Учитывая то, что использованные в работе МКАт комплементарны как углеводным (МКАт 1 — 4), так и полипептидным (МКАт 5 — 9) эпитопам наружной мембраны Y. pseudotuberculosis, предварительно представлялось целесообразным с помощью указанных выше методических подходов определить химическую природу рецепторов бактериофага Покровской. Полученные результаты (рис. 1) согласуются с данными Филиппова А.А. и др. [9], показавших с использованием мутантов штамма С092 Y. pestis, что рецептор бактериофага Покровской ассоциирован с областью Hep II/ Hep III на внутренней части кора ЛПС. Обработка клеток протеиназой К не оказывала влияния на уровень адгезии бактериофага, в то же время, предварительная инкубация бактериальной суспензии с периодатом натрия даже в минимальной из использованных концентраций (10 мМ) полностью отменяла способность клеток адгезиро-вать бактериофаг (рис. 1). Эти данные указывают на углеводную природу рецептора бактериофага Покровской.
Результаты оценки конкурентного ингиби-рования рецепции бактериофага предшествующей обработкой препаратами, содержащими антитела различной спе-цифичности, показали, что ни один из них не предотвращал полностью адгезию бактериофага (рис. 2). Так, ПЧС, содержащая поликло-нальные антитела к жиз-
1(ХЬ
I "•* I
¿ь А Д; Л >• А А Л А А чО # # # # 4
Рис. 2. Конкуренция антител и бактериофага Покровской за сайты связывания на поверхности клеток У. ревНв штамм ЕУ.
По оси абсцисс — препараты бактериофага: контроль — без микробных клеток; ЕУ — с интактными клетками, МКАт 1 — 9, ПЧС — с клетками, обработанными соот-: ветствующими антителами. ; ^
неспособным клеткам Y. pestis, лишь в 4 раза повышает количество неприсоединившихся к бактериальным клеткам частиц бактериофага (в среднем с 6,5 до 25,7%). МКАт 1 — 4, как и ожидалось, не оказали выраженного влияния на адгезию бактериофага. Вместе с тем, следует отметить тенденцию к неспецифическому ингибированию связывания с микробной клеткой бактериофага препаратами МКАт (во всяком случае, МКАт 3,4), комплементарных эпитопам О-боковых цепей Y. pseudotuberculosis, не экспрессируемых клетками Y. pestis (рис. 2).
Среди МКАт 5 — 9, выявляющих белковые антигенные детерминанты наружной мембраны Y. pestis и Y. pseudotuberculosis [3], МКАт-5 и МКАт 8 вызывали подавление рецепции бактериофага.
ОБСУЖДЕНИЕ
Некоторое снижение адгезивности бактериофага к клетам штамма EV после их обработки моноклональными антителами к О-боковым цепям ЛПС Y. pseudotuberculosis (МКАт 3, 4) может происходить за счет Fc-фрагментов антител либо иных компонентов асцитной жидкости. Эти данные подтверждают известную способность нескольких поверхностных белков бактерий Y. pseudotuberculosis, например, шаперона Skp, неспецифически связывать иммуноглобулины G [5] или белка рН 6,0 Y. pestis — иммуноглобулины подклассов G 1 — 3 и аполипопротеин В100 из неиммунных сывороток человека и животных [1].
Существенное подавление рецепции бактериофага путем обработки клеток МКАт 5, 8 объясняется, по-видимому, стерическим экранированием антителами, провзаимодействовавшими со своими специфическими белковыми эпитопами, пространственно соседствующими с коровой областью ЛПС, включающей рецепторную структуру бактериофага.
Иное и, возможно, менее вероятное толкование частичного ингибирования рецепции бактериофага с использованием вышеуказанных МКАт может состоять в том, что бактериофаг Покровской обладает способностью адгезиро-вать к бактерии посредством распознавания не только упомянутого рецептора углеводной природы (и связывания с ним), но и иного, глубже расположенного белкового участка наружной мембраны. Так, показано, что в акте адгезии чумного бактериофага Yep-phi к микробной клетке участвуют не только ЛПС, но и идентифицированные структуры белков наружной мембраны Ail и OmpF [15]. Правда, в отличие от представленных нами данных, такой вывод сделан авторами, в том числе, и на основании результатов опытов, в которых адгезия бактериофага подавлялась предварительной обработкой бактерий как протеиназой К, так и периодатом натрия. '
Довольно невысокую специфичность псевдотуберкулезного бактериофага R1-37, способного инфицировать бактерии Yersinia similis 0:9 и Yersinia enterocolitica нескольких серотипов [8], авторы объясняют двояко. Во-первых, пространственным (но не химическим) сходством рецепторной структуры ЛПС в области наружного кора Y. enterocolitica Ye03-c-Rl и О-антигена Y. similis R708. Второе и более вероятное, по мнению авторов, объяснение состоит в том, что вышеуказанный бактериофаг экспрессирует несколько белков, способных связываться с различными участками ЛПС.
Более того, есть данные литературы, указывающие, в частности, на способность одного из бактериофагов семейства Т4 с одинаковой эффективностью использовать в качестве рецептора ОшрС или ЛПС Escherichia coli [12]; В связи с выше изложенным, отсутствие в наших опытах инактивации адсорб-
ции бактериофага после инкубации клеток с протеиназой К прямо не означает неучастия белковых структур наружной мембраны Y. pestis в рецепции специфического бактериофага. Частичное блокирование рецепции бактериофага МКАт 5 и МКАт 8, а также ПЧС может свидетельствовать об обратном. Во всяком случае, требуется проведение дальнейших специальных исследований механизма взаимодействия бактериофага Покровской с клеткой Y. pestis с использованием иных методических подходов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Молекул, генетика. 2002, 3:3-23.
2. Бывалов А.А., Дудина Л.Г., Литвинец С.Г., Новикова О. Д., Хоменко В. А., Портнягина О. Ю., Оводов Ю. С. Исследование поверхностных антигенных эпитопов Yersinia pseudotuberculosis с помощью моноклональных антител. Прикладная биохимия и микробиология. 2014, 50 (2): 203-210.
3. Бывалов. А. А., Дудина Л. Г., Чернядьев А. В., Конышев И. В., Литвинец С. Г., Оводов Ю.С. Иммунохимическая активность Б-антигена Yersinia pseudotuberculosis. Молекул, генетика. 2015, 2: 32-38.
4. Лабинская А.С. Титрование бактериофага. В кн.: Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., Медицина, 1978, с. 77-79.
5. СидоринЕ.В., Зиганшин Р.Х., Набережных Г.А., Лихацкая Г.Н., Трифонов Е.В., Анастюк С.Д., Черников О.В., Соловьева Т.Ф. Белок шаперон Skp из Yersinia pseudotuberculosis обладает способностью связывать иммуноглобулины G. Биохимия. 2009, 74 (4): 501-514.
6. Achtman М., Zurth К., Morelli G. et al.-Yersinia pestis, the cause of plague, is a resently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999,96:14043-14048.
7. Anisimov A.P., Amoako K.K. Treatment of plague: promising alternatives to antibiotics. J. Med. Microbiol. 2006,55:1461-1475.
8. Beczala A., Ovchinnikova O.G., Datta N. et al. Structure and genetic basis of Yersinia similis serotype 0:9 O-specific polysaccharide. Innate Immunity. 2015,21 (1): 3-16.
9. Filippov A.A., Seigueev K.V., He Y. et al. Bacteriophage-resistant mutants in Yersinia pestis: identification of phage receptors and attenuation for mice. PLoS One. 2011, 6 (9): E25486.
10. Golkar Z., Bagasra O., Pace D.G. Bacteriophage therapy: a potential solution for the antibiotic resistance crisis. J. Infect. Dev. Ctries. 2014, 8 (2): 129-136.
11. Marraffini L.A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 2015, 1; 526 (7571): 55-61.
12. Montag D., Hashemolhosseini S., Henning U. The receptor-recognition area of protein 37 of phage T4 Tula and Tulb. Receptor-recognition proteins of T-even type bacteriophages. J. Mol. Biol. 1990, 216 (2): 327-334.
13. Welch T.J., Fricke W.F., McDermott P.F. et al. Multiple antimicrobial resistance in plague: an .■> emerging public health risk. PLoS One. 2007,2 (3): E309.
14. Summers W.C. Bacteriophage therapy. Annu. Rev. Microbiol. 2001, 55:437-453.:
15. Zhao X., Cui Y., Yan Y. et al. Outer membrane proteins Ail and OmpF of Yersinia pestis are involved in the adsorption ofT7-related bacteriophage Yep-phi. J. Virol. 2013,87 (22): 12260-12269.
Поступила 23.02.16
Контактная информация: Бывалов Андрей Анатольевич, д.м.н., проф., 610000, Киров, ул. Московкая, 36, р.т. (8332)64-50-69 / ,
