CC BY
54
нии в клетках лактата и ингибировании пируватдегидроге-назного комплекса.
Выводы:
1. Моделирование ацидоза (рН 4,0 и 5,5) и алкалоза (рН 9,0) в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток сопровождается снижением интенсивности их метаболизма по тесту МТТ.
2. L-карнитин в диапазоне концентраций 10-3-10-10 Моль/л повышает интенсивность образования солей фор-мазана в культуре ММСК во всем диапазоне рН среды инкубации.
3. Оптимальный эффект L-карнитин проявляет в дозах 10'5-10'6 Моль/л и при наименьшем отклонении рН среды от нормальных значений.
Литература
1. ISSN exercise and sport nutrition review: research and recommendations / R. Kreider [et al.] // Journal of the Society of Sports Nutrition.- 2010.- V. 7.- P.7.
2. Балыкова, Л.А. Опыт применения метаболических кардиопротекторов в детской спортивной медицине / Л.А. Балыкова, С.А. Ивянский, А.Н. Урзяева // Российский кардиологический журнал.- 2011.- № 5 (91).- С. 52-57.
3. Karlic, H. Supplementation of L-carnitine in athletes: does it make sense? / H. Karlic, A. Lohninger // Nutrition-2004.- 20(7-8).- Р. 709-715.
4. Stephens, F.B. New insights concerning the role of carnitine in the regulation of fuel metabolism in skeletal muscle / F.B. Stephens, D. Constantin-Teodosiu, P.L. Greenhaff // J. Physiol.- 2007.- 581(2).- Р. 431^44.
5. Титов, В.Н. Функция митохондрий, карнитин, коэн-зим-А, жирные кислоты, глюкоза, цикл рендла и инсулин (лекция) / В.Н. Титов // Клиническая лабораторная диагностика.- 2012.- №2.- С. 32^3.
6. Monograph. L-carnitine. // Altern. Med. Rev.- 2005.-V. 10.- № 1.- P. 42-50
7. Ивянский, С.А. Современные представления о ремоделировании миокарда у юных спортсменов / С.А. Ивян-ский, Л.А. Балыкова, А.Н. Урзяева, Н.В. Щёкина // Наука и спорт: современные тенденции.- 2013.- №1.- С. 80-88.
8. Владимирская, Е.Б. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в клеточной терапии / Е.Б. Владимирская // Онкогематология.- 2007.- № 1.- С. 4-16.
9. Горшков, А.С. Морфофункциональное состояние опухолевых и неопухолевых клеток под влиянием хорионического гонадотропина и эмбихина: дисс. ... кандидата медицинских наук / А. С. Горшков.- Киров, 2013.- 131 с.
10. Метаболическая терапия L-карнитином при переднем остром инфаркте миокарда с подъемом сегмента ST: рандомизированное клиническое исследование / G. Ta-rantini [и др.] // Российский кардиологический журнал.-2011.- № 4.- С. 77-84.
11. Балыкова, Л.А. Подходы к диагностике и коррекции патологических изменений сердца у юных спортсменов с использованием препаратов метаболического действия / Л.А. Балыкова, И.А. Маркелова // Практическая медицина.- 2010.- № 44.- С. 66-72.
12. Новые аспекты применения L-карнитина в спортивной практике / С.А. Ивянский [и др.] // Ульяновский медико-биологический журнал.- 2012.- № 3.- С. 97-103.
References
1. Kreider R, Wiiborn CD, Taylor L, Campbell B, Alma-da AL. ISSN exercise and sport nutrition review: research and recommendations. Journal of the Society of Sports Nutrition. 2010;7:7.
2. Balykova LA, Ivyanskiy SA, Urzyaeva AN. Opyt pri-meneniya metabolicheskikh kardioprotektorov v detskoy spor-tivnoy meditsine. Rossiyskiy kardiologicheskiy zhurnal. 2011;91(5):52-7. Russian.
3. Karlic H, Lohninger A. Supplementation of L-carnitine in athletes: does it make sense? Nutrition. 2004;20(7-8):709-15.
4. Stephens FB, Constantin-Teodosiu D, Greenhaff PL. New insights concerning the role of carnitine in the regulation of fuel metabolism in skeletal muscle. J. Physiol. 2007;581(2):431-44.
5. Titov VN. Funktsiya mitokhondriy, karnitin, koenzim-A, zhirnye kisloty, glyukoza, tsikl rendla i insulin (lektsiya). Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2012;2:32-43. Russian.
6. Monograph. L-carnitine. Altern. Med. Rev. 2005;10(1):42-50.
7. Ivyanskiy SA, Balykova LA, Urzyaeva AN, Shchekina NV. Sovremennye predstavleniya o remodelirovanii miokarda u yunykh sportsmenov. Nauka i sport: sovremen-nye tendent-sii. 2013;1:80-8. Russian.
8. Vladimirskaya EB. Mezenkhimal’nye stvolovye kletki (MSK) v kletochnoy terapii. Onkogematologiya. 2007;1:4-16. Russian.
9. Gorshkov AS. Morfofunktsional’noe sostoyanie opuk-holevykh i neopukholevykh kletok pod vliyaniem khorioni-cheskogo gonadotropina i embikhina [dissertation]. Kirov (Kirov region ); 2013. Russian.
10. Tarantini G, Scrutinio D, Bruzzi P. Metabolicheskaya terapiya L-karnitinom pri perednem ostrom infarkte miokarda s pod"emom segmenta ST: randomizirovannoe klinicheskoe issledovanie. Rossiyskiy kardiolo-gicheskiy zhurnal. 2011;4:77-84. Russian.
11. Balykova LA, Markelova IA. Podkhody k diagno-stike i korrektsii patologicheskikh izmeneniy serdtsa u yunykh sportsmenov s ispol’zovaniem preparatov metabo-licheskogo deystviya. Prakticheskaya meditsina. 2010;44:66-72. Russian.
12. Ivyanskiy SA, Soldatov OM, Shchekina NV. Novye aspekty primeneniya L-karnitina v sportivnoy praktike. Ul’ya-novskiy mediko-biologicheskiy zhurnal. 2012;3:97-103. Russian.
УДК 616.831.31-005.4-036.12-091.81-076.5:577.112.6
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЫРУ-СОДЕРЖАЩИХ НЕЙРОНОВ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛЕЙ КОРЫ БОЛЬШОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ
А.В. СЕРГЕЕВ, С.С. СТЕПАНОВ, В.А. АКУЛИНИН, А.В. МЫЦИК
ГБОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ, ул. Ленина, 12, г. Омск, Россия, 644043
Аннотация. Проведено иммуногистохимическое (NPY - нейропептид Y) и морфометрическое изучение распределения и
архитектоники NPY-иммунопозитивных тормозных интернейронов слоя III различных долей (поля 4, 10, 17 и 21) неокортекса человека в норме (n=5) и при хронической ишемии (n=15, перифокальная зона опухолей). Верификация NPY-позитивных тормозных интернейронов проведена по содержанию NPY, форме их тела и отростков. Во всех изученных полях коры в норме и при ишемии выявлялись корзинчатые клетки, клетки Мартинотти и нейроглиоформные интернейроны. Установлено, что при хронической ишемии во всех изученных полях коры большого мозга относительная площадь NPY-иммунопозитивных структур (меченые тела нейронов и их отростки) статистически значимо выше, чем в контроле: в поле 10 - в 1,95, поле 4 - в 1,85, поле 21 - в 2,17 и поле 17 - в 2,15 раза. Полученные результаты, вероятно, свидетельствуют о компенсаторном увеличении экспрессии NPY в неповрежденных интернейронах перифокальной зоны неокортекса человека при хронической ишемии. Увеличение объема NPY-иммунопозитивного материала происходило за счет разрастания и утолщения отростков интернейронов. Рассматривается гипотеза о возможной роли активации и гипертрофии NPY-иммунопозитивных интернейронов в регуляции баланса тормозной и возбуждающей систем поврежденной коры большого мозга и как одного из механизмов защиты ее нейронных сетей от хронического ишемического повреждения.
Ключевые слова: человек, хроническая ишемия, неокортекс, интернейроны, нейропептид Y.
IMMUNO-HISTOCHEMICAL AND MORPHOMETRIC CHARACTERISTICS NPY-POSITIVE NEURONS OF THE DIFFERENT FIELDS OF HUMAN CEREBRAL CORTEX AT THE CHRONICAL ISCHEMIA
A.V. SERGEEV, S.S. STEPANOV, V.A. AKULININ, A.V. MYTSIK Omsk State Medical Academy, 644043, Russia, Omsk, Lenin Street, 12
Abstract. Immuno-histochemical (NPY - neuropeptide Y) and morphometric study of the distribution and architectonics of NPY immune-positive brakes of interneurons layer III of various fractions (field 4, 10, 17 and 21) of neocortex human normal (n=5) and chronic ischemia (n=15, perhifocal area tumors) was carried out. Verification of NPY-positive brake interneurons held on the content of NPY, the shape of their bodies and processes. In all studied fields in norm and under ischemia the basket cells, Martinotti cells and releasing secret of inter-neurons were identified. It was established that in case of chronic ischemia in all the studied fields cortex of the relative size of NPY-immune-positive structures (labelled bodies of neurons and their appendages) are statistically significantly higher than in control: in field 10 - in 1.95, in field 4 - 1,85, in field 21 - 2,17, in field 17 - 2,15 times. The received results testify to a compensatory increase in the expression of NPY in the intact interneurons of perifocal area of human neocortex with chronic ischemia. Increase in the volume of NPY- immune-positive material was due to the expansion and thickening of the processes of interneurons. The authors examine the hypothesis about the possible role of activation and hypertrophy of NPY- immune-positive interneurons in the regulation of the balance of brake systems and exciting damaged brain cortex and as one of the mechanisms for the protection of neural networks from chronic ischemic damage.
Key words: individual, chronic ischemia, neocortex, interneurons, NPY-neurons.
В норме и при различных патологических состояниях тормозные интернейроны играют важную роль в обеспечение функционирования нейронной сети коры большого мозга млекопитающих [9]. В неокортексе млекопитающих тормозные интернейроны представляют собой разнородную популяцию непирамидных клеток, содержащих медиатор ГАМК, комедиаторы и нейропептиды (соматоста-тин, NPY, кальбиндин, парвальбумин, кальретинин, холе-цистокинин, нейропептид Y). При этом интернейроны составляют от 15 до 30% от общего числа нейронов коры [9]. Нейропептид У (NPY) в коре большого мозга содержится преимущественно в тормозных интернейронах и составляет 1-2% всех ее нейронов [4]. Наличие тормозных интернейронов показано во всех без исключения слоях неокортекса, где они образуют локальные межнейронные цепи [12]. Форма и размеры тела, характер разветвления и длина отростков различных интернейронов существенно отличаются и, вероятно, зависят от функции конкретного нейрона [1,2,9]. Это позволяет проводить их специфическую идентификацию и морфометрическую оценку с помощью иммуноги-стохимических методов [2,9,11].
Таким образом, с помощью иммуногистохимического исследования распределения NPY-иммунопозитивных клеток и их морфометрического анализа можно в определенной степени судить о состоянии тормозной системы коры большого мозга человека в норме и при патологических состояниях.
По данным литературы, с помощью иммуногистохи-мического изучения интернейронов существенно улучшились наши представления о структурной организации тор-
мозных систем различных отделов головного мозга млекопитающих и человека в процессе их онтогенетического развития, нормального и патологического функционирования [6,7,8,10,14]. Имеются сравнительные морфометрические исследования состояния нейронных популяций тормозных и возбуждающих систем головного мозга человека, в которых показана существенная роль интернейронов в реорганизации межнейронных отношений коры большого мозга после ее повреждения [6,7,11].
Таким образом, по данным литературы, верификация NPY может быть использована для выявления тормозных интернейронов коры большого мозга человека и морфометрического анализа закономерностей изменения меж-нейронной интеграции. Однако сравнительное изучение в этом аспекте различных отделов коры большого мозга человека при хронической ишемии ранее не проводилось.
Цель исследования - изучить структурнофункциональное состояние популяции интернейронов, экспрессирующих NPY, в лобной (поле 10, 4), височной (поле 21) и затылочной (поле 17) долях неокортекса человека в норме и при хронической ишемии в перифокальной зоне.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на базе ГБОУ ВПО Омской государственной медицинской академии; лаборатории молекулярно-генетических и морфологических методов исследований ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии». Интраоперационный материал получали в отделении нейрохирургии ГУЗ Омская областная клиническая больница, аутопсийный материал — Омском об-
ластном бюро судебно-медицинской экспертизы. Данное исследование одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО Омской государственной медицинской академии протокол №40, от 23.05. 2011г. и информированного согласия родственников на изъятие биологического материала.
Для исследования использовали биопсийный материал, полученный в ходе операции по удалению опухолей головного мозга (n=15, возраст пациентов 23-62 года), из поля
10, 4, 21, 17 (по Бродману) - лобная, височная и затылочная кора. В силу глубокого расположения опухолей в удаляемый материал попадали участки коры большого мозга из пери-фокальной зоны (хроническая ишемия) и частично неповрежденная кора. После лечения все пациенты были выписаны из стационара в удовлетворительном состоянии. Контролем служил мозг погибших в результате несчастных случаев (n=5). Аутопсийный материал забирали так же из поля 10, 4, 21 и 17 левого полушария спустя 5-10 ч после смерти.
Интраоперационный и аутопсийный материал фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) при температуре +4°С (в течение 1 сут) и заключали в парафин. Изготавливали серийные фронтальные срезы коры большого мозга (КБМ) толщиной 10 мкм через все слои коры большого мозга, помещали их на предметные стекла. Первый срез каждой серии (5 последовательных срезов) окрашивали по Нисслю тионином, на последующих срезах с помощью меченых антител проводили иммуногистохимическое исследование. С каждого блока готовили по 5-7 серий фронтальных срезов, с каждого среза анализировали 10-15 полей зрения.
Для иммунофлуоресцентного исследования тормозных интернейронов применяли первичные кроличьи поликлональные антитела (Neuropeptide Y, NPY; Sigma Chemicals, St. Louis, USA; diluted 1:8000). Визуализация иммунной реакции осуществлялась с помощью козлиных поликлональных вторичных антител (Goat polyclonal Secondary Antibody to Rabbit IgG - H&L (TR) № ab6719; Abcam, Cambridge, England), разведение 1:200, ассоциированных с флюоресцентным красителем Texas Red® Sulfonyl Chloride.
Интернейроны идентифицировали на основании морфологических критериев, установленных для данного типа клеток [13]. На микроскопе Axioskop 40, Karl Zeiss, оснащенном ртутной лампой HBO 100, камерой на CCD датчике - Axi-oCam MRc и объективом EC Plan-Neofluar x40, апертура 0.9, делались цифровые микрофотографии (размер поля зрения 140х125 мкм (17500 мкм2) при объективе *20. Морфометрический анализ изображений (.tif; 768*512=393216 пикселей) проводили с помощью программы ImageJ 1.46 после трансформации реального 8-битового изображения в бинарное [3]. Площадь одного пикселя цифрового изображения соответствовала 0,045 мкм2 реального поля зрения, соответственно размер пикселя - 0,21*0,21 мкм. На иммуногистохимических препаратах определяли общую численную плотность (единиц на 1 мм2) и общую площадь (мкм2) флуоресцирующих гранул маркера NPY в поле зрения препарата. Диаметр отростков и относительное содержание (%) мелких, средних и крупных дендритов NPY-иммунопозитивных нейронов в поле зрения определяли на выделенных поперечных срезах. Последнее возможно осуществить с помощью программы ImageJ 1.46 путем введения соответствующих пороговых значений (размер и кривизна контура частицы) при работе в «Analyze particles». На препаратах, окрашенных по Нисслю, проводилась общая гистологическая оценка состояния нервной ткани.
Проверку статистических гипотез осуществляли при помощи программы STATISTICA 8.0 с использованием
непараметрического ANOVA Фридмана, критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. В каждом сравниваемом случае количество измерений и полей зрения клеток определялось требованиями выявления статистической значимости при р<0,05.
Результаты и их обсуждение. В слое III изучаемых полей (10, 4, 21, 17) коры большого мозга лиц контрольной группы (группа сравнения) преобладали нормохромные и гиперхромные несморщенные нейроны, незначительная часть нейронов имела признаки аутолитических изменений цитоплазмы. При хронической ишемии (основная группа) во всех полях появлялось большое количество гиперхром-ных сморщенных (дегидратированных) нейронов и клеток-теней. Реактивным изменениям подвергались пирамидные и неприрамидные нейроны слоя III.
По данным иммуногистохимического анализа, в норме и при хронической ишемии NPY-иммунопозитивные нейроны выявлялись во всех слоях изученных полей (4, 10, 21, 17) неокортекса, но преобладали в слое III (рис. 1). Поэтому именно NPY-иммунопозитивные тормозные нейроны этот слой коры были детально изучены с помощью морфометрических методов и программы ImageJ 1.46.
А Б
Рис. 1. Иммунофлюоресцентная маркировка NPY в теле и отростках нейронов, зрительная кора большого мозга (поле 17) человека, норма, слой III. А - NPY-иммунопозитивный интернейрон (нейроглио-форная клетка) и окружающий нейропиль, Б - фрагмент нейропи-ля с NPY-иммунореактивными отростками продольной (стрелка) и поперечной ориентации, отчетливо видны очень тонкие отростки с непрерывным содержимым метки. Об. х20. Шкала - 20 мкм
В нейропиле маркер на NPY позволяет отчетливо верифицировать тела и длинные отростки только тормозных интернейронов (рис. 1а, б). Это дает возможность точно оценить количество NPY и его распределение в конкретном отделе коры большого мозга по площади или объему метки на единицу площади поля зрения или в срезе с помощью программы ImageJ 1.46. Кроме того, подсчет относительного содержания частиц различного размера дает возможность определить степень разветвления дендритного дерева тормозных интернейронов (то есть, плотность объемной сети) в норме и при ишемии.
При использовании программы ImageJ 1.46 мы сознательно ввели ограничения для нижнего значения площади частицы - 5 пикселей (около 2*3 пикселей или 0,4-0,5 мкм в диаметре). Частицы меньшей площади по диаметру приближаются к разрешающей способности микроскопа (около 0,2 мкм) и, кроме того, эти частицы трудно дискриминировать по принадлежности к конкретной структуре. Практически невозможно установить, где расположена частица - на территории клетки или в нейропиле и является ли она «шумовым» артефактом графического изображения. Поэтому на бинарном изображении самой маленькой частицей, с высокой степенью вероятности относящейся к NPY-позитивному материалу тормозного интернейрона, в настоящей работе считалась частица диаметром около 0,40,5 мкм (2-3 пикселя на цифровом изображении) (рис. 2а,
б). Это примерно соответствует диаметру синаптического контакта среднего размера. Более мелкие частицы отсекались с помощью инструментов «Analyze particles». Верхний предел площади частиц устанавливался на уровне 5000 пикселей (225 мкм2), что было больше самых крупных частиц, представленных крупными тормозными интернейронами с отростками (в норме площадь тела основной массы интернейронов была 30-40 мкм2).
зом: 1) более 1,40 мкм - 0,2-0,7%, 2) 1,13-1,40 мкм - 2,9-4,2%,
3) 0,97-1,12 мкм - 6,3-8,2%, 4) 0,84-0,96 мкм - 11,6-14,1%, 5)
0,72-0,83 мкм - 20,9-24,0%, 6) 0,50-0,71 мкм - 51,9-55,5%.
Подобное соотношение диаметра и количества ветвей дендритов свидетельствует о том, что переход на следующий уровень дендритного дерева (пять уровней) сопровождается увеличением количества дендритов примерно в два раза и уменьшением их диаметра на 0,12-0,13 мкм.
Рис. 2. Маски (бинарное изображение, 393216 пикселей) реального поля зрения (17500 мкм2) при иммунофлюоресцентной маркировке NPY, зрительная кора большого мозга (поле 17) человека, норма, слой III. В плоскости среза выявляются фрагменты тел и отростков нейронов. А - NPY-иммунопозитивный интернейрон и окружающий нейропиль, всего 426 частиц различной формы площадью от 5 до 1296 пикселей, общая площадь всех частиц составляет 3,2% поля зрения; Б - фрагмент нейропиля с NPY-иммунореактивными отростками продольной и поперечной ориентации, всего 546 частиц площадью от 5 до 314 пикселей, общая площадь - 2,8% поля зрения.
Шкала - 20 мкм
Кривизна контура частиц (отношение длины осей овалов, построенных вокруг частицы) устанавливалась в зависимости от конкретной задачи:
1) для выявления общей площади или объема NPY-иммунопозитивных частиц в поле зрения или срезе этот показатель варьировал от 0,00 до 1,0 ус.ед. (рис. 2а),
2) для выявления поперечных срезов дендритов в нейропиле - на уровне 0,90-1,0 ус.ед. В последнем случае выявлялись только округлые частицы, которые и представляли поперечные срезы дендритов (рис. 3).
Рис. 3. Маска (бинарное изображение, 393216 пикселей) реального поля зрения (17500 мкм2) при иммунофлюоресцентной маркировке ЫРУ, зрительная кора большого мозга (поле 17) человека, норма, слой III. Выявляются только поперечные срезы отростков нейронов. Всего 234 частиц площадью от 5 до 33 пикселей (диаметр 0,51,4 мкм), общая площадь - 0,6% поля зрения. Шкала - 20 мкм
Среди хорошо верифицируемых нейронов в контроле преобладали корзинчатые клетки, клетки Мартинотти и нейроглиоформные тормозные интернейроны. Все эти тормозные интернейроны имели сравнительно длинные отростки (рис. 1а). Так, на рис. 1а диаметр отростка составляет от 1,6 мкм (дистальный отдел) до 1,90 мкм (проксимальный отдел), а длина - 73,5 мкм.
В дендритном дереве на продольных срезах можно было выделить до пяти уровней, отличающихся диаметром отростков (рис. 4). При морфометрическом анализе поперечных срезов отростков интернейронов (рис. 3) установлено, что по диаметру отростки в поле зрения коры большого мозга человека в норме распределялись следующим обра-
Рис. 4. Типичный NPY-иммунопозитивный тормозной нейрон (ней-роглиофорная клетка): пять уровней дендритного дерева (отмечено стрелками), отличающихся диаметром дендритов. Продольный срез, инвертированное изображение. 17 поле зрительной коры, слой III, контроль. Об. х20. Шкала - 25 мкм
Общая численная плотность поперечных срезов денд-ритов в единице поля зрения дает представление о степени пространственного распространения отростков сети тормозных интернейронов в конкретном объеме нервной ткани коры большого мозга. Так, по данным рисунка 3, численная плотность поперечных срезов отростков в представленном участке нейропиля слоя III поля 17 составляет 13371 на 1 мм2. При такой плотности расстояние между соседними частицами в среднем составляет 8,6±2,2 мкм. Это чуть больше диаметра мелкого нейрона. Распределение поперечных срезов дендритов в нейропиле неоднородно (рис. 3). Пустые зоны на рисунке, вероятно, соответствуют расположению тел каких-нибудь нейронов. Существенно то, что NPY-иммунопозитивные отростки вблизи тел и крупных дендритов тормозных нейронов образуют фигуры очень похожие на аксосоматические и аксодендритные синапсы (рис. 4). Вполне вероятно, что это - тормозные синапсы на тормозных нейронах.
Таким образом, NPY-иммунопозитивные интернейроны, содержание которых в норме, по нашим и литературным данным [4], в коре большого мозга незначительно, формируют густую сеть отростков, по степени плотности которой можно судить о реакции тормозной системы коры большого мозга на хроническую ишемию.
Во всех изученных отделах неокортекса лиц, перенесших хроническую ишемию, появлялось большое количество гиперхромных сморщенных (дегидратированных) нейронов и клеток-теней. Это приводило к изменению характера распределения маркера в нейроне. Увеличивалось количество клеток с глыбчатым компактным распределением маркера, а так же клеток с незначительным количеством диффузно распределенных мелких флуоресцирующих частиц. Кроме того, отростки интернейронов подвергались значительным варикозным изменениям (рис. 5).
Качественные изменения сопровождались статистически значимыми изменениями параметров, характеризующих форму и размеры частиц иммунопозитивного материала, при этом общая численная плотность тел NPY-иммунопозитивных интернейронов в сравнении с контролем статистически значимо не изменялась (р>0,05, критерий Манна-Уитни). Сравнительный морфометрический анализ
показал, что хроническая ишемия приводила к существенной реорганизации отростков интернейронов. По данным ANOVA, между полями лиц контрольной группы не было выявлено статистически значимые различия по показателю относительной площади всех иммунореактивных структур, а при хронической ишемии такие различия появлялись (табл. 1). При хронической ишемии во всех изученных полях коры большого мозга относительная площадь всех NPY-иммунопозитивных структур (меченые тела нейронов и их отростки) была статистически значимо выше, чем в контроле: в поле 10 - в 1,95, поле 4 - 1,85, в поле 21 - в 2,17 и в поле 17 - 2,15 раза (табл. 1). Относительная площадь увеличивалась при ишемии за счет увеличения количества NPY-иммунопозитивных частиц и, в меньшей степени, за счет размеров этих частиц (табл. 1).
Рис. 5. Иммунофлюоресцентная маркировка NPY в отростках (стрелки) интернейронов, зрительная кора большого мозга (поле 17) человека, хроническая ишемия, слой III. Фрагментация NPY-иммунопозитивного материала, варикозные изменения отростков. Об. х20. Шкала - 20 мкм
Таблица 1
Основные морфометрические характеристики масок NPY-иммунопозитивных структур слоя III различных полей коры большого мозга человека в норме и при хронической ишемии, программа ImageJ 1.46
Поле коры Контроль Хроническая ишемия Уровень p
1. Относительная площадь всех частиц в поле зрения, %
10 2,20 (1,87; 2,50) 4,28 (3,80; 4,86) <0,001*
4 2,13 (1,66; 2,76) 3,93 (3,07; 4,61) р=0,0001л <0,001*
21 1,80 (1,50; 2,34) 3,91 (3,47; 4,67) р=0,003л <0,001*
17 1,91 (1,71; 2,41) 4,11 (3,30; 4,24) <0,001*
ANOVA Фридмана df=3; х2=5,1; p=0,16 df=3; х2=13,6; p=0,004# -
2. Количество NPY-иммунопозитивных частиц в поле зрения (17500 мкм2)
10 383 (265; 474) 670 (566; 744) <0,001*
4 352 (272; 446) 558 (492; 734) <0,001*
21 341 (237; 411) р=0,045л 505 (471; 609) р=0,003л <0,001*
17 291 (231; 431) р=0,026л 474 (419; 545) р=0,003л <0,001*
ANOVA Фридмана df=3; х2=9,3; p=0,03# df=3; х2=12,9; p=0,005# -
3. Средний размер частицы, pix
10 23,3 (21,4; 26,3) 24,5 (20,6; 29,2) >0,1
4 22,5 (20,3; 26,0) 27,3 (24,2; 29,2) <0,005*
21 25,1 (21,8; 27,7) 29,2 (24,1; 32,8) <0,05*
17 24,6 (22,3; 28,7) 31,6 (26,5; 35,4) <0,005*
ANOVA Фридмана df=3; х2=5,5; p=0,14 df=3; х2=6,6; p=0,09 -
Примечание: * - различия статистически значимы между группами (критерий Колмогорова-Смирнова для парных сравнений независимых выборок); А - различия статистически значимы в сравнении с полем 10 (критерий Вилкоксона для парных сравнений зависимых выборок); различия статистически значимы между полями коры (ANOVA Фридмана), при р<0,05
Таблица 2
Распределение (%) по диаметру (мкм) поперечных срезов отростков NPY-иммунопозитивных интернейронов слоя III различных полей коры большого мозга человека в норме и при хронической ишемии, программа ImageJ 1.46
Относительное содержание Контроль Хроническая ишемия df, х2, уровень p
1. Поле 10
0,45-0,71 мкм 54,6% (51,5-57,7%) 42,5% (39,3-45,8%) df=1; х2=26,7; p<0,0001*
0,72-0,83 мкм 22,9% (20,4-25,6%) 21,5% (18,9-24,3%) df=1; х2=0,5; p=0,5
0,84-0,96 мкм 13,4% (11,4-15,6%) 12,7% (10,6-15,0%) df=1; х2=0,1; p=0,7
0,97-1,12мкм 6,6% (5,2-8,3%) 12,2% (10,2-14,5%) df=1; х2=16,4; p=0,0001*
1,13-1,40 мкм 2,4% (1,6-3,5%) 9,5% (7,7-11,6%) df=1; х2=40,5; p<0,0001*
>1,40 мкм 0,0%- 1,6% (0,9-2,6%) df=1; х2=12,9; p=0,0003*
2. Поле 4
0,45-0,71 мкм 56,9% (53,8-59,9%) 40,8% (37,7-43,9%) df=1; х2=51,2; p<0,0001*
0,72-0,83 мкм 21,2% (18,8-23,8%) 24,4% (21,8-27,2%) df=1; х2=2,7; p=0,1
0,84-0,96 мкм 9,0% (7,3-10,9%) 15,6% (13,4-18,9%) df=1; х2=19,6; p<0,0001*
0,97-1,12мкм 9,2% (7,5-11,1%) 12,6% (10,6-14,8%) df=1; х2=5,6; p=0,03*
1,13-1,40 мкм 3,2% (2,2-4,5%) 6,5% (5,1-8,2%) df=1; х2=11,1; p=0,001*
>1,40 мкм 0,4% (0,1-1,0%) 0,1% (0,01-0,6%) df=2; х2=0,8; p=0,4
3. Поле 21
0,45-0,71 мкм 50,1% (47,0-53,3%) 41,8% (38,7-44,9%) df=1; х2=13,5; p=0,0002*
0,72-0,83 мкм 23,1% (20,5-25,9%) 20,9% (18,4-23,6%) df=2; х2=1,3; p=0,3
0,84-0,96 мкм 14,6% (12,4-17,0%) 16,2% (14,0-18,6%) df=2; х2=0,9; p=0,4
0,97-1,12мкм 7,1% (5,6-8,9%) 12,4% (10,4-14,6%) df=1; х2=15,4; p=0,0001*
1,13-1,40 мкм 4,6% (3,4-6,1%) 7,1% (5,6-8,9%) df=1; х2=5,2; p=0,02*
>1,40 мкм 0,5% (0,2-1,2%) 1,6% (0,9-2,6%) df=1; х2=4,8; p=0,03*
4. Поле 17
0,45-0,71 мкм 56,1% (52,8-59,4%) 47,8% (44,7-51,0%) df=1; х2=13,5; p=0,0002*
0,72-0,83 мкм 21,1% (18,5-24,0%) 22,9% (20,3-25,6%) df=1; х2=0,5; p=0,5
0,84-0,96 мкм 11,9% (9,8-14,2%) 14,0% (11,9-16,3%) df=1; х2=1,8; p=0,2
0,97-1,12мкм 6,4% (4,9-8,2%) 9,5% (7,8-11,5%) df=1; х2=6,2; p=0,01*
1,13-1,40 мкм 3,6% (2,5-5,1%) 4,7% (3,5-6,2%) df=1; х2=1,3; p=0,3
>1,40 мкм 0,9% (0,4-1,8%) 1,1% (0,6-2,0%) df=1; х2=0,1; p=0,8
Множественное сравнение всех полей df=15; х2=32,2; p=0,01* df=15; х2=51,3; p<0,0001* -
Множественное сравнение поля 10 и 4 df=5; х2=14,1; p=0,02* df=5; х2=15,2; p=0,01* -
Множественное сравнение поля 10 и 21 df=5; х2=15,3; p=0,01* df=5; х2=8,3; p=0,1 -
Множественное сравнение поля 10 и 17 df=5; х2=12,4; p=0,03* df=5; х2=29,1; p<0,0001* -
Множественное сравнение поля 4 и 21 df=5; х2=14,8; p=0,01* df=5; х2=7,1; p=0,2 -
Множественное сравнение поля 4 и 17 df=5; х2=5,1; p=0,4 df=5; х2=22,2; p=0,001* -
Множественное сравнение поля 21 и 17 df=5; х2=6,1; p=0,3 df=5; х2=22,6; p=0,0004* -
Примечание: * - различия статистически значимы при p<0,05 (критерий х2). В скобках даны значения 95% доверительного интервала
За счет чего в поле зрения коры увеличивается количество NPY-иммунопозитивных частиц при хронической
ишемии? Возможны два основных варианта: 1) новообразование, рост и ветвление отростков, 2) варикозная фрагментация имеющихся отростков (маска изображения - частица со значительным преобладанием длины) с трансформацией непрерывной структуры отростка (рис. 3) в цепочку округлых дискретных частиц (длина равна ширине) (рис. 5). В пользу преобладания первого варианта свидетельствует то, что при ишемии выявлялось статистически значимое увеличение медианы показателя площади частицы. То есть, несмотря на варикозные изменения, цепочки частиц (отростки) полностью не распадаются на мелкие фрагменты (табл. 1).
Анализ только поперечных срезов отростков интернейронов в нейропиле (рис. 3) показал, что в группе сравнения во всех полях коры большого мозга преобладали частицы (маска среза отростка) диаметром от 0,45 до
0,83 мкм - около 76%, более крупные частицы (0,84-1,40 мкм и выше) составляли 24% (табл. 2). Тем не менее, при множественном сравнении выявлены статистически значимые различия характера распределения данного показателя в изученных полях. В основном последнее касалось распределения крупных частиц (табл. 2). Это, вероятно, свидетельствовало о наличии индивидуальных особенностей разветвления отростков 1-3-го порядка NPY-иммунопозитивных интернейронов в лобной, височной и затылочной коре большого мозга.
Статистически значимые различия между полями по диаметру поперечно срезанных отростков выявлялись и при хронической ишемии. Однако, при множественном сравнении, структура отношений была иной. Если в контроле максимально отличались поля 10 и 21, 4 и 21 (лобная и затылочная кора), то при ишемии - 10 и 17, 4 и 17 (лобная и височная), 21 и 17 (затылочная и височная). Вполне вероятно, что это свидетельствовало о реорганизации тормозной системы коры большого мозга при хронической ишемии. Кроме того, ишемия приводила (во всех полях коры) к увеличению доли поперечно срезанных крупных дендритов (табл. 2).
Существенно то, что, несмотря на некоторое уменьшение доли самых тонких (площадь поперечного среза 58 pix) дистальных отростков интернейронов при хронической ишемии (табл. 2), их плотность на единицу поля зрения в основной группе была больше, чем в группе сравнения. Для поля 10 - на 26,7% (p<0,001), поля 4 - 12,3,% (p<0,01), поля 21 - 19,0% (p<0,01), поля 17 - 28,2% (критерий Колмогорова-Смирнова, p<0,001). Для крупных отростков столь значительное увеличение их плотности не было выявлено. Это, вероятно, свидетельствовало об интенсивном новообразовании (ветвление и рост) тонких отростков интернейронов при хронической ишемии.
По литературным данным, в неокортексе человека большая часть нейропептида Y содержится в непирамидных ГАМК-ергических (тормозных) интернейронах [2,4]. В нашем исследовании получены аналогичные данные. Среди хорошо верифицируемых нейронов в контроле и при хронической ишемии выявлено преобладание корзинчатых клеток, клеток Мартинотти и нейроглиоформных тормозных интернейронов с хорошо развитыми, дихотомически делящимися, длинными отростками.
Имеются работы, в которых установлено, что после различных патологических воздействий на головной мозг экспериментальных животных человека происходит реорганизация тормозных и возбуждающих нейронных систем неокортекса. В экспериментальных исследованиях выявлено увеличение экспрессии кальбиндина в нейронах после
ишемии [15] и деафферентации [5]. Это имеет существенное значение для обсуждения и объяснения результатов настоящего исследования. Потому, что NPY-иммунопозитивные интернейроны относятся к клеткам с высоким содержанием кальбиндина. Увеличение количества и большая сохранность интернейронов рассматривается, как результат компенсаторной экспрессии кальбиндина, регулирующего внутриклеточную концентрацию ионов кальция, который играет ключевую роль в инициации механизмов некроза и апоптоза [6,8-11].
Морфометрическое исследование распределения нейропептида Y в лобной (поле 4 и 10), височной (поле 21) и затылочной (поле 17) коре показало, что при хронической ишемии во всех изученных полях относительная площадь меченых интернейронов статистически значимо выше, чем в контроле. В поле 10 - в 1,93, поле 4 - 1,77, в поле 17 - 2,01 и в поле 21 - в 1,90 раза. Полученные результаты, вероятно, свидетельствуют о компенсаторном увеличении экспрессии и накоплении NPY в неповрежденных интернейронах не-окортекса человека при хронической ишемии. Увеличение объема NPY-иммунопозитивного материала происходит за счет утолщения и разрастания отростков интернейронов, то есть нейрон гипертрофируется. В этой связи предлагается гипотеза о роли NPY-иммунопозитивных интернейронов в регуляции баланса тормозной и возбуждающей систем коры большого мозга при хронической ишемии. Основной идеей этой гипотезы является, то, что в зоне длительных нарушений микроциркуляции коры большого мозга активируются механизмы естественной защиты нейронных сетей от чрезмерного эксайтотоксического возбуждения и повреждения, которые морфологически проявляются в виде гипертрофии тормозных интернейронов и увеличения плотности распределения их отростков. Вполне вероятно, что перифокальная зона с плотной сетью отростков тормозных интернейронов блокирует внутрикорковое распространение возбуждающей импульсации от переживающих нейронов из очага повреждения.
Кроме тог, известно, что экспрессия нейропептида Y служит защитным механизмом от кальциевой перегрузки при перевозбуждении нейронов. Действие нейропептида Y может быть связано с влиянием как на пресинаптические Y2 рецепторы, ингибирующие выделение глутамата, так и на Y1 рецепторы (в пре- и постсинаптической структуре), уменьшающие вход ионов кальция и выделение глутамата [4].
Таким образом, полученные нами данные могут служить для понимания компенсаторной реорганизации тормозной системы коры большого мозга человека при хронической ишемии.
Литература
1. Акулинин, В.А. Структурно-функциональное состояние пирамидных нейронов коры большого мозга человека в постреанимационном периоде / В.А. Акулинин, А.В. Мыцик, С.С. Степанов, П.М. Ларионов, П.В. Беличенко // Вестник НГУ.- 2012.- Т.10.- №4.- С. 21-28.
2. Калиниченко, С.Г. Нейроглиоформные клетки: нейрохимическая характеристика, пространственная организация и роль в тормозной системе новой коры / С.Г. Калиниченко, Ю.В. Дудина, П.А. Мотавкин // Цитология.- 2006.-Т. 48.- №6.- С. 508-514.
3. Мыцик, А.В. Актуальные проблемы изучения структурно-функционального состояния нейронов коры большого мозга человека в постишемическом периоде / А.В. Мы-
цик, С.С. Степанов, П.М. Ларионов, В.А. Акулинин // Журнал анатомии и гистопатологии.- 2012.- Т.1.— №1.— С. 37-47.
4. Aoki, C. Neuropeptide Y in the cerebral cortex and the caudate-putamen nuclei: ultrastructural basis for interactions with GABAergic and non-GABAergic neurons / C. Aoki, V.M. Pickel // The Journal of Neuroscience.- 1989.- Vol.9.— №12.- P. 4333^354.
5. Barbado, M.V. Changes in immunoreactivity to calcium-binding proteins in the anterior olfactory nucleus of the rat after neonatal olfactory deprivation / M.V. Barbado, J.G. Briñón, E. Weruaga, A. Porteros, R. Arévalo, J. Aijón, J.R. Alonso // Exp Neurol.- 2002.- Vol.177.- №1.- P. 133-150.
6. Buritica, E. Changes in calcium-binding protein expression in human cortical contusion tissue / E. Buritica, L. Villamil, F. Guzman, M.I. Escobar, N. García-Cairasco, H.J. Pimienta // Journal of Neurotrauma.- 2009.- Vol.26.- P. 2145-2155.
7. De Almeida, J. Quantitative analysis of glutamatergic and GABAergic neurons expressing 5-HT2A receptors in human and monkey prefrontal cortex /J. De Almeida, G. Mengod // Journal of Neurochemistry.- 2007.- Vol. 103.- P. 475-486.
8. Desgent, S. Altered expression of parvalbumin and cal-bindin in interneurons within the primary visual cortex of neonatal enucleated hamsters / S. Desgent, D. Boire, M. Ptito // Neuroscience.- 2010.- Vol.171.- №4.- P.1326-1340.
9. Druga, R. Neocortical inhibitory system (cortical interneurons / GABAergic neurons / calcium-binding proteins / neuropeptides) / R. Druga // Folia Biologica (Praha).- 2009.-Vol.55.- P. 201-217.
10. Fung, S.J. Expression of interneuron markers in the dorsolateral prefrontal cortex of the developing human and in schizophrenia / S.J. Fung, M.J. Webster, S. Sivagnanasundaram, C. Duncan, M. Elashoff, C.S. Weickert // Am J Psychiatry.-2010.-Vol. 167.- №12.- P.1479-1488.
11. Maekawa, S. Cortical selective vulnerability in motor neuron disease: a morphometric study /S. Maekawa, S. Al-Sarraj, M. Kibble // Brain.- 2004.- Vol. 127.- P. 1237-1251.
12. Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system / H. Markram, M. Toledo-Rodriguez, Y. Wang, A. Gupta, G. Silberberg, C. Wu // Nat. Rev. Neurosci.- 2004.-Vol. 5.- P. 793-807.
13. Naegele, J.R. Cell surface molecules containing N-acetylgalactosamine are associated with basket cells and neu-rogliaform cells in cat visual cortex / J.R. Naegele, L.C. Katz // J. Neurosci.- 1990.- Vol.10.- P. 540-557.
14. Sherwood, C.C. Inhibitory interneurons of the human prefrontal cortex display conserved evolution of the phenotype and related genes / C.C. Sherwood, M.A. Raghanti, C.D. Stimp-son, M.A. Spocter, M. Uddin, A.M. Boddy, D.E. Wildman, C.J. Bonar, A.H. Lewandowski, K.A. Phillips, J.M. Erwin, P.R. Hof // Proc Biol Sci.- 2010.- Vol.277.- №1684.- P. 1011-1020.
15. Yenari, M.A. Calbindin d28k overexpression protects striatal neurons from transient focal cerebral ischemia / M.A. Yenari, M. Minami, G.H. Sun, T.J. Meier, D.M. Kunis, J.R. McLaughlin, D.Y. Ho, R.M. Sapolsky, G.K. Steinberg // Stroke.- 2001.-Vol.32.- №4.- P. 1028-1035.
References
1. Akulinin VA, Mytsik AV, Stepanov SS, Lario-nov PM, Belichenko PV. Strukturno-funktsional'noe sostoyanie piramid-nykh neyronov kory bol'shogo mozga cheloveka v postreani-matsionnom periode. Vestnik NGU. 2012:10(4):21-8. Russian.
2. Kalinichenko SG, Dudina YuV, Motavkin PA. Ney-
roglioformnye kletki: neyrokhimicheskaya kharakteri-stika,
prostranstvennaya organizatsiya i rol' v tormoznoy sisteme novoy kory. Tsitologiya. 2006;48(6):508-14. Russian.
3. Mytsik AV, Stepanov SS, Larionov PM, Akuli-nin VA. Aktual'nye problemy izucheniya strukturno-funktsional'nogo sostoyaniya neyronov kory bol'shogo mozga cheloveka v posti-shemicheskom periode. Zhurnal anatomii i gistopatologii. 2012;1(1):37-47. Russian.
Aoki C, Pickel VM. Neuropeptide Y in the cerebral cortex and the caudate-putamen nuclei: ultrastructural basis for interactions with GABAergic and non-GABAergic neurons. The Journal of Neuroscience. 1989;9(1):4333-54.
4. Russian.Barbado MV, Briñón JG, Weruaga E, Porteros A, Arévalo R, Aijón J, Alonso JR. Changes in immunoreactivity to calcium-binding proteins in the anterior olfactory nucleus of the rat after neonatal olfactory deprivation. Exp Neurol. 2002;177(1):133-50.
5. Buritica E, Villamil E, Guzman F, Escobar MI, García N, Cairasco HJ. Pimienta Changes in calcium-binding protein expression in human cortical contusion tissue. Journal of Neurotrauma. 2009;26:2145-55.
6. De Almeida J, Mengod G. Quantitative analysis of glutamatergic and GABAergic neurons expressing 5-HT2A receptors in human and monkey prefrontal cortex. Journal of Neurochemistry. 2007;103:475-86.
7. Desgent S, Boire D, Ptito M. Altered expression of parvalbumin and calbindin in interneurons within the primary visual cortex of neonatal enucleated hamsters. Neuroscience. 2010;171(4):1326-40.
8. Druga R. Neocortical inhibitory system (cortical interneurons / GABAergic neurons / calcium-binding proteins / neuropeptides). Folia Biologica. 2009;55:201-17.
9. Fung SJ, Webster MJ, Sivagnanasundaram S, Duncan C, Elashoff M, Weickert CS. Expression of interneuron markers in the dorsolateral prefrontal cortex of the developing human and in schizophrenia. Am J Psychiatry. 2010;167(12):1479-88.
10. Maekawa S, Al-Sarraj S, Kibble M. Cortical selective vulnerability in motor neuron disease: a morphometric study. Brain. 2004;127:1237-51.
11. Markram H , Toledo-Rodriguez M, Wang Y, Gupta A, Silberberg G, Wu C. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat. Rev. Neurosci. 2004;5:793-807.
12. Naegele JR, Katz LC. Cell surface molecules containing N-acetylgalactosamine are associated with basket cells and neurogliaform cells in cat visual cortex. J. Neurosci. 1990;10:540-57.
13. Sherwood CC, Raghanti MA, Stimpson CD, Spocter CD, Uddin M, Boddy AM, et al. Inhibitory interneurons of the human prefrontal cortex display conserved evolution of the phenotype and related genes. Proc Biol Sci. 2010;277(1684):1011-20.
14. Yenari MA, Minami M, Sun GH, Meier TJ, Kunis DM, McLaughlin JR, et al. Calbindin d28k overexpression protects striatal neurons from transient focal cerebral ischemia. Stroke. 2001;32(4):1028-35.
