CC BY
53
Иммуногистохимическая характеристика пролиферативной активности В-лимфоцитов селезенки и лимфатических узлов у домашних свиней при экспериментальном воспроизведении африканской чумы свиней
В.В. Пронин1, доктор биологических наук, Е.В. Рыжова1, кандидат ветеринарных наук, Г.В. Корнева1, кандидат ветеринарных наук, Д.В. Колбасов2, доктор ветеринарных наук, С.А. Белянин2.
1 ФГБОУ ВПО «Ивановская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.К. Беляева».
2 ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (Покров).
Ключевые слова: африканская чума свиней, иммуногистохимическая характеристика, В-лимфоциты Сокрашения: АЧС — африканская чума свиней, в/м — внутримышечно, ГАЕ — гемадсорбирующая единица, ИП — индекс пролиферации, МТ — масса тела, CВЧ — сверхвысокочастотное излучение
Введение
Африканская чума свиней (лат. Реэиэ аМсапа эиит) — острое вирусное заболевание домашних и диких свиней, характеризующееся поражением ретику-ло-эндотелиальной системы. По распространенности, уровню заболеваемости, тяжести течения и летальности АЧС занимает одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний вирусной этиологии и представляет собой одну из наиболее серьезных и нерешенных проблем современной ветеринарии [2...4]. В настоящее время в Российской Федерации циркулируют высокопатогенные изоляты вируса АЧС второго генотипа, вызывающие у восприимчивых животных преимущественно острую форму течения болезни [1].
Важной составляющей в диагностике АЧС являются клинические и патолого-анатомические признаки, а для более полного понимания патогенеза заболевания необходимы данные патогистологических и им-муногистохимических исследований [2].
При АЧС первичная репликация вируса происходит в моноцитах и макрофагах лимфатических узлов, расположенных недалеко от места проникновения возбудителя. Вначале вирус инфицирует моноциты и макрофаги миндалин, нижнечелюстных, околоушных и мезентериальных лимфатических узлов, затем с кровью и лимфой распространяется во вторичные места репликации — селезенку, костный мозг, лимфатические узлы, легкие, печень и почки — и вызывает дистрофические и некротические изменения в этих органах. По мере развития морфологических измене-
ний в лимфатических узлах и селезенке наблюдают процессы ингибирования пролиферации лимфоидных структур и массивный кариопикноз и кариорексис лимфоцитов и клеток ретикулоэндотелия. Кариопикноз и кариорексис лимфоцитов — характерный признак АЧС, который на ранних стадиях болезни выражен в такой степени, что свидетельствует о начавшемся инфекционном процессе. Независимо от путей проникновения вируса постоянно отмечают изменения в селезенке и лимфатических узлах желудка, печени, почек [1.4].
Цель исследования
Изучить в динамике изменение пролиферативной активности В-лимфоцитов селезенки и лимфатических узлов при острой форме течения АЧС у домашних свиней, экспериментально инфицированных высоковирулентными полевыми изолятами вируса АЧС второго генотипа, которые циркулируют на территории РФ.
Материалы и методы
В работе были использованы: подсвинки (п=6) крупной белой породы с МТ 25.30 кг, полученные из сектора подготовки подопытных животных ГНУ ВНИИВ-ВиМ; гемадсорбирующий изолят вируса АЧС (Абхазия 02/07); моноклональные антитела К1-67 («ОАКО»).
Подсвинков №№ 1.4 заражали в/м в дозе 1000 ГАЕ50, №№ 5 и 6 поместили в бокс, где ранее содержали больных АЧС животных. Подсвинки № 1 и 2 были подвергнуты эвтаназии на 5-е и 7-е сутки после заражения; подсвинки № 3, 4, 5 и 6 пали на 8-е, 9-е, 11-е и 13-е сутки, соответственно. В течение эксперимента животных ежедневно подвергали клиническому осмотру Для гистологического и иммуногис-тохимического исследований отбирали пробы соматических (нижнечелюстных), висцеральных (порталь-
Иммуногистохимическая характеристика пролиферативной активности В-лимфоцитов селезенки и лимфатических узлов у домашних свиней при экспериментальном воспроизведении африканской чумы свиней
ных, желудочных и почечных) лимфатических узлов, а также селезенки. Весь отобранный материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, уплотняли в парафине, изготавливали срезы толщиной 4.5 мкм на роторном микротоме. Для гистологического исследования препараты окрашивали гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое исследование (определение пролиферативной активности клеток) проводили с помощью иммунопероксидазного метода на срезах селезенки и лимфатических узлов (толщиной 4.5 мкм) с использованием моноклонального антитела Ki-67, который идентифицирует ядерный антиген, присутствующий на всех стадиях клеточного цикла кроме G0. После депарафинизации и обезвоживания блокировали эндогенную пероксидазу, обрабатывая срезы 0,3 %-м раствором Н2О2, затем промывали их дистиллированной водой и для демаскировки антигенных детерминант подвергали температурной обработке в буферах pH 6,0 в СВЧ-печи длительностью 20 мин при 98°С, после чего промывали. наносили моноклональные антитела Ki-67 и инкубировали во влажной камере. После инкубации с антителами срезы промывали, наносили авидин-биотиновый комплекс, конъ-юнгированный с пероксидазой, ядра докрашивали гематоксилином. Конечный продукт реакции — окрашивание в коричневый цвет ядер клеток, где выявляется антиген Ki-67. Пролиферативную активность В-лимфоцитов во вторичных лимфатических фолликулах лимфатических узлов и селезенки оценивали по ИП, который представляет собой долю Ki-67-позитив-ных клеток в общей популяции клеток вторичных лимфатических фолликулов селезенки и лимфатических узлов, при подсчете 100 клеток в 10 рандомизированных полях зрения по методике Г.Г. Автандилова. Гистопрепараты изучали под микроскопом Leica DM1000, для микрофотографирования использовали цифровой аппарат Leica DMB.
Результаты исследований обрабатывали статистически с применением программного комплекса Microsoft Exel 7.
Результаты
Висцеральные лимфатические узлы у домашних свиней характеризуются развитием лимфаденита — вначале серозного (5...7-е сутки), затем серозно-геморрагического (8...9-е сутки) и геморрагического (11_13-е сутки). В соматических лимфатических уз-
лах изменения появляются несколько позднее в виде серозного, а затем серозно-геморрагического лимфаденита. Гистологическая структура висцеральных лимфатических узлов у домашних свиней на 5_7-е сутки характеризуется наличием лимфоидных фолликулов с четкими границами, частью со светлыми центрами размножения. По мере развития заболевания отмечают редукцию фолликулов, в которых отсутствуют центры размножения (8_9-е сутки), затем картину подострого неспецифического лимфаденита с преобладанием продуктивно-васкулярного компонента и минимальной реакцией фол-
Рис. 1. Желудочный лимфатический узел свиньи при АЧС, иммунопероксидазный метод окраски, об. х20, ок. х15: а — на 5...9-е сутки после заражения: экспрессия маркера пролиферации Ю-67
б — на 11...13-е сутки после заражения: экспрессия маркера пролиферации Ю-67 отсутствует
ликулов (центры размножения в них не определяются), интенсивный кариопикноз и кариорексис лимфоцитов, ядерную пыль в синусах (11...13-е сутки). Изменения в соматических лимфатических узлах появляются позднее, выражены менее интенсивно. На 5 ... 7-е сутки отмечают гиперплазию лимфоидных фолликулов, они четко очерчены, в некоторых незначительно выражены светлые центры размножения; на 8.9-е сутки фолликулы небольшие, без центров размножения; на 11.13-е сутки наблюдают редукцию фолликулов, они без центров размножения, ядерную пыль в синусах.
При иммуногистохимическом исследовании в лимфатических узлах зараженных свиней, по сравнению с контролем, на 5.9-е сутки степень экспрессии антигена Ы-67 выражена слабо, преобладают процессы ка-риопикноза и кариорексиса лимфоцитов, что свидетельствует о процессах ингибирования пролиферации клеток в лимфатических узлах (рис. 1а). На 11.13-е сутки антиген Ы-67 в ядрах клеток лимфатических узлов не выявляется, а кариопикноз и кариорексис лимфоцитов ярко выражен (рис. 1б). Полученные данные отображены графически, где четко прослеживается динамика уменьшения пролиферативной активности клеток (график 1).
Селезенка у домашних свиней в начальный период болезни либо без видимых изменений (5.7-е сутки), либо характеризуется незначительной гиперплазией (8.9-е сутки) и по мере развития заболевания — геморрагическим спленитом, при этом геморрагический компонент ярко выражен на 11.13-е сутки. Гистологически в начале заболевания отмечена гиперплазия фолликулов (5.7-е сутки), а по мере развития болезни — редукция фолликулов, кариопикноз и кариорексис лимфоцитов (8.10-е сутки), обшир-
График 1. ИП В-лимфоцитов в лимфатических узлах
РВЖ • СХЖ • № 1/2013
В.В. Пронин, Е.В. Рыжова, Г.В. Корнева, Д.В. Колбасов, С.А. Белянин
График 2. ИП в селезенке: 1.6 — животные №1.6, соответственно
ные кровоизлияния с отложением гемосидерина (11.13-е сутки). При иммуногистохимическом исследовании на 5.9-е сутки заболевания наблюдали слабую экспрессию К1-67, в дальнейшем (11.13-е сутки) экспрессия К1-67 не выявлена. На графике 2 отображена динамика уменьшения пролиферации В-лимфо-цитов.
Обсуждение
При остром течении АЧС происходит ингибирование пролиферации В-лимфоцитов в лимфоузлах и селезенке, на финальных стадиях болезни отмечено большое количество лимфоцитов в стадиях апопто-за, редукция фолликулов в лимфоузлах и селезенке. Полученные нами сведения согласуются с данными других авторов, свидетельствующих о массированном апоптозе В-клеток, который обусловлен тем, что клетками-мишенями для вируса АЧС являются клетки системы мононуклеарных фагоцитов: моноциты крови, а также тканевые макрофаги [6]. Разрушение макрофагов вызывает высвобождение ци-токинов, индуцирующих апоптоз сначала Т-клеток, а затем ингибирование пролиферации и индуцирование апоптоза В-клеток, что направляет иммуный ответ в неэффективное русло [5].
Библиография
1. Белянин С.А., Васильев А.П., Колбасов Д.В. и др. Патогенность вируса африканской чумы свиней, циркулирующего на территории РФ / Роль ветеринарной науки в реализации продовольственной доктрины РФ: Материалы международной научнопрактической конференции. — Покров ГНУ ВНИИВВиМ, 2011.
2. Коваленко Я.Р. Африканская чума свиней. — М.: Колос, 1965.
3. Коваленко Я.Р., Иванов Б.Г. и др. Экспериментальное заражение свиней вирусом африканской чумы // Труды Всесоюзн. ин-та экспериментальной ветеринарии, 1961; XXIV: 53-61.
Выводы
В висцеральных лимфатических узлах (портальные, желудочные, почечные) отмечено ослабление пролиферативной активности лимфоидных клеток на 5-е сутки после заражения вирусом АЧС, и полное ее отсутствие на 11...1З-е сутки развития инфекционного процесса . Изменения в соматических лимфатических узлах выявляются позднее, но к 11.1З-м суткам они аналогичны таковым в висцеральных лимфатических узлах.
В селезенке животных на 5.7-е сутки после заражения отмечена гиперплазия фолликулов, на 8.9-е сутки — редукция фолликулов, а также кариопикноз и кариорексис лимфоцитов; на 11.1З-е сутки селезенка переполнена кровью, лимфоидная ткань слабо различима, отмечается кариопикноз и кариорексис лимфоцитов, общирные кровоизлияния с отложением ге-мосидерина. ИП лимфоцитов в селезенке по мере развития заболевания снижается, на 11.1З-е сутки отмечено полное ингибирование их пролиферации.
Таким образом, результаты гистологических и им-муногистохимических исследований свидетельствуют о том, что по мере развития инфекционного процесса при АЧС в лимфатических узлах и селезенке происходит как ослабление пролиферативной активности B-лимфоцитов, вплоть до полного ее прекращения, так и гибель уже имеющихся клеток.
Благодарность
Авторы выражают огромную благодарность за рецензирование статьи заведующему кафедрой анатомии, патологической анатомии, акушерства и хирургии ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», доктору ветеринарных наук, профессору Е.Н. Сковородину и заведующему кафедрой анатомии и физиологии животных Аграрного института ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», доктору ветеринарных наук, профессору В.А. Здоровинину.
4. Макаров В.В. Африканская чума свиней. — М.: Российский университет дружбы народов, 2011.
5. Whitall J.T, Parkhouse R.M. Changes in swine macrophage phenotype after infection with african swine fever virus: cytokine production and responsiveness to interferon-gamma and lipopolysaccharide // Immunology, 1997; 91 (3): 444-449.
6. Zsak L., Neilan J.G. Regulation of apoptosis in African swine fever virus — infected macrophages // Scientific World Journal, 2002; 2(5): 1186-1195.
Summary
E.V. Ryzhova, V.V. Pronin, G.V. Korneva, D.V. Kolbasov, S.A. Belyanin. Immunohistochemical Characteristics of the Splenic and the Lymph Nodes B-lymphocytes Proliferative Activity in Domestic Pigs Following Experimental Infection with African Swine Fever Virus. The article presents data on the immunohistochemical characteristics of the proliferative activity of B-lymphocytes isolated from the spleen and the lymph nodes of domestic pigs with the acute form of African Swine Fever (ASF). The pigs were experimentally infected with highly virulent field isolate of the ASF virus belonging to second genotype, which circulates on the territory of the Russian Federation.
