CC BY
65
УДК[616.441-002-008.853.2]
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕНОТИПА
ИНТРАТИРЕОИДНЫХ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ АУТОИММУННОМ ТИРЕОИДИТЕ
1-Бутолина К. М. ([email protected]), 1-Ляликов С. А.([email protected]), ]'Басинский В. А. ([email protected]), ]'Штабинская Т. Т. ([email protected]),
2-Маршалэк А. ([email protected]) 1-УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь 2-Университет им. Н. Коперника, Торунь, Польша
Цель исследования - изучение местный: иммунных процессов в ткани щитовидной железы при аутоиммунном тиреоидите путем иммуногистохимического анализа фенотипа интратиреоидных лимфоцитов. Выявлена высокая достоверная прямая зависимость количества клеток с фенотипами CD1a+, CD3+, CD4+, CD8+, CD23+, CD25+, инфильтрирующих узловые образования в щитовидной железе при аутоиммунном тиреоидите, от числа этих же клеток, инфильтрирующих ткань, окружающую узлы. Отмечено, что в лимфоидных инфильтратах по сравнению с узловыми образованиями значимо больше В-лимфоцитов и CD8+Т-клеток, а соотношения CD1a/CD3 и CD25/CD3 в строме узлов существенно выше, чем в лимфоидном инфильтрате.
Ключевые слова: аутоиммунный тиреоидит, иммуногистохимия, субпопуляции лимфоцитов.
Аутоиммунный тиреоидит (АИТ), или тиреоидит Хашимото, является органоспецифическим аутоиммунным заболеванием, характеризующимся лимфо-плазмоцитарной инфильтрацией ткани щитовидной железы (ЩЖ) с образованием лимфоидных фолликулов с центрами размножения. Иммунная реакция сопровождается разрушением фолликулов щитовидной железы, пролиферацией фибробластов, диффузным или очаговым склерозом стромы, а также гиперплазией оксифильных В-клеток Ашкенази-Гюртля.
Изучение роли различных популяций лимфоцитов в патогенезе АИТ привлекает внимание многих исследователей. Однако данные о клеточном составе лимфоидных инфильтратов, экспрессии маркеров клеточного и гуморального иммунитета в ткани щитовидной железы, а также субпопуляций интратиреоидных лимфоцитов противоречивы [2, 7, 8]. По современным представлениям, в основе патогенеза АИТ лежит генетически обусловленный иммунный дефект, ведущий к срыву естественной толерантности к аутоантигенам. Происходит нарушение регулирующей функции Т-клеточной системы иммунитета, нарушение соотношения субпопуляций Т-лимфоци-тов, появление «запрещенного» клона В-лимфоци-тов и продукция аутоантител [3]. Ключевую роль в развитии аутоиммунной агрессии и поражении ЩЖ при АИТ играют реакции клеточного иммунитета. Многие авторы при гистологических исследованиях обнаруживают большое количество Т-клеток как в лимфоидных инфильтратах, так и в паренхиме ЩЖ [2]. Внедрение иммуногистохимического (ИГХ) метода исследования раскрывает широкие возможности для определения фенотипа лимфоцитов и изучения морфогенеза аутоиммунного процесса.
Индуцируют направленный иммунный ответ антигенпрезентирующие дендритные CD1a+клет-ки, активируя Т-лимфоциты, натуральные киллеры и В-лимфоциты. Общим антигеном всех Т-лим-фоцитов являются поверхностная молекула CD3. Зрелые Т-лимфоциты включают Т-клетки, экспрес-сирующие рецепторы CD4 или CD8. CD4+ клетки - Т-хелперы (ТК) играют, как считается, главную роль в патогенезе АИТ [2, 4]. После антигенной стимуляции они активируются, дифференцируются в различные эффекторные подтипы (ТЫ, ТК2, ТЫ7. Т^) и участвуют в регуляции интенсивности как клеточного, так и гуморального иммунного ответа
[9]. Небольшая субпопуляция CD4+ Т-клеток - ре-гуляторные CD25high+ Т-клетки (Treg) - обладает супрессорными свойствами и участвуют в поддержании иммунной толерантности [4, 5, 10]. CD8+ клетки обеспечивают реакции клеточной цитоток-сичности (Т-киллеры). Эффекторами гуморального иммунитета являются В-лимфоциты. Активированные В-лимфоциты экспрессируют маркер CD23.
Изменение количественного состава лимфоцитов, а также нарушение соотношения их субпопуляций при аутоиммунных процессах приводит к дисбалансу продуцируемых лимфоцитами цитоки-нов, в том числе TGFP, являющегося мощным индуктором супрессии иммунного ответа. TGFP регулирует процессы дифференцировки Т-клеток, препятствует развитию цитотоксических Т-лим-фоцитов, Т-хелперов и активизирует регуляторные Т-клетки, а также регулирует функции В-лимфо-цитов, натуральных киллеров, дендритных клеток, макрофагов, тучных клеток и гранулоцитов [6].
Целью исследования явилось изучение местных иммунных процессов в ткани ЩЖ железы при АИТ путем ИГХ анализа фенотипа интратиреоидных лимфоцитов.
Материалы и методы
Исследован операционный материал щитовидной железы 26 женщин с АИТ в возрасте от 26 до 68 лет. Медиана возраста пациенток составила 50 (46; 63) лет. На парафиновых срезах выполнено ИГХ исследование с использованием мышиных моно-клональных антител к антигенам CD3, CD4, CD1a, CD23, CD25, CD8 и TGF-P (фирма «Dako», Дания). Из парафиновых блоков готовились срезы толщиной 3 мкм и переносились на предметные стекла ultra frost+. Срезы высушивались 18 ч при комнатной температуре в вертикальном положении и помещались на 30 мин. в термостат при температуре 60°С. После этого проводилась депарафинация в ксилоле (в батарее из 3 емкостей по 3 мин. в каждой) и обработка в спирте (в батарее из 3-х емкостей спиртов в нисходящей крепости по 3 мин.). Далее предметные стекла со срезами помещались в цитратный буфер рН 6.0 и ставились на 30 мин. в водяную баню при температуре 98°С. Для блокирования эндогенной перокси-дазы срезы обрабатывались 3% перекисью водорода в течение 5 минут. Затем наносились первичные антитела в разведении 1:50, и срезы инкубировались в
течение 30 мин. при комнатной температуре. В качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный набор EnVision (фирма «Dako», Дания). Для визуализации реакции применяли раствор диаминобензидина (DAB) (фирма «Dako», Дания), которым срезы обрабатывались в течение 10 минут. Ядра клеток докрашивали гематоксилином и заключали в полистирол под покровное стекло. Контрольный срез оставляли без первой инкубации.
Для количественной оценки результатов ИГХ реакции микропрепараты фотографировались цифровой камерой Leica на объективе 20* в 7 полях зрения. Для интерпретации результатов в среде компьютерной программы «MashaCV» (свидетельство о регистрации № 452, 12.11.2012, РБ) определялся показатель «позитивность» - отношение коричневых пикселей к общему их числу, а также учитывалась ее локализация - в узловых образованиях и в лимфоид-ных инфильтратах вне узлов. Статистический анализ данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 (SNAXAR207F394425FA-Q). Использовались методы описательной статистики, корреляционный анализ Спирмена (rs), непараметрический тест Манна-Уитни (различия считались статистически значимыми при р<0,05). Так как распределение ряда показателей отличалось от нормального, представление признака приводилось в формате Me (LQ;UQ), где Me - медиана, а LQ и UQ - нижний и верхний квартили, соответственно.
Результаты и обсуждение
При гистологическом исследовании ткани щитовидной железы при АИТ во всех наблюдениях отмечалась выраженная очаговая и диффузная лим-фоидная инфильтрация с наличием лимфоидных фолликулов. В 17 наблюдениях имелись участки узловой гиперплазии с формированием узлов коллоидного строения, которые в 13 случаях были множественными. Размеры одиночных узлов колебались от 1 до 2,5 см (Ме=1,5 (1,0; 2,25)). Множественные узлы имели размеры 0,8-3,5 см (Ме=1,5 (1,0; 2,0)). Лимфо-идная инфильтрация в узлах была умеренной, также сопровождалась формированием лимфоидных фолликулов и локализовалась в краевых отделах узлов.
При ИГХ исследовании экспрессия анализируемых CD3, CD4, CD1a, CD23, CD25, CD8 маркеров характеризовалась светло-коричневым и коричневым мембранным окрашиванием лимфоцитов (рис. 1).
Экспрессия TGFß антигена выявлялась в цитоплазме тиреоидных клеток и лимфоцитов (рис. 1А), и ее интенсивность в ткани ЩЖ и улов была практически одинаковой (табл. 1).
Основная масса лимфоцитов в лимфоидных инфильтратах (ЛИ) как в строме узловых образований, так и вне их имела рецепторы к CD3 антителам. CD3+Т-лимфоциты равномерно распределялись в ЛИ, а также были рассеяны в строме узлов и ткани щитовидной железы, особенно в зонах ок-сифильноклеточной трансформации эпителия (медиана позитивности экспрессии CD3 в ЛИ ткани ЩЖ (Мели) равнялась 28,38 (23,95; 36,00), в узлах (Меуз) - 16,86 (13,12; 22,73)). В лимфоидных фолликулах CD3+клетки располагались преимущественно по краю лимфоидного фолликула, а также в зародышевых центрах, или диффузно в мелких первичных лимфоидных фолликулах (рис. 1Б, В).
Субпопуляции CD8+ и CD4+Т-лимфоцитов в ЛИ в большинстве наблюдений присутствовали в большом количестве. Соотношение CD4+/CD8+
клеток составило 1/2,4 в ткани ЩЖ и 1/1,9 - в узлах (р>0,05). Отмечалось равномерное распределение CD8+лимфоцитов как в ЛИ ткани ЩЖ, так и узлов, с преобладанием их в ЛИ ткани ЩЖ (Мели=17,46 (13,83; 20,28), Меуз=10,91 (9,55; 13,7)). В лимфоидных фолликулах определялось лишь небольшое количество CD8+клеток (рис. 1Г). Лимфоциты, экс-прессирующие CD4 маркер, локализовались преимущественно в ЛИ и лимфоидных фолликулах, а в строме железы располагалось небольшое количество клеток (рис. 1 Д). Мели для CD4 составила 7,38 (5,59; 15,05), а Меуз была 5,85 (3,05; 11,54).
CD25+лимфоциты были самой малочисленной субпопуляцией (Мели=3,27 (1,93; 4,87), Меуз=2,05 (1,46; 2,95)) и были представлены мелкими группами позитивных клеток, относительно равномерно распределенных в ЛИ (рис. 1З). Соотношения клеток с фенотипами CD25+/CD4+ в ЛИ ЩЖ и ткани узлов практически не различались (р>0,05), однако доля клеток, экспрессирующих маркер CD25 среди CD3+лимфоцитов, в узловых образованиях была значимо выше, чем в ЩЖ.
Маркер CD1a в 6 случаях на клетках не определялся, а в остальных наблюдениях его экспрессия была очень низкой (Мели=0,15 (0,00; 0,29), Меуз=0,13 (0,08; 0,25), р>0,05). В ЛИ ЩЖ и в ткани узлов определялись одиночные позитивно окрашенные клетки или группы клеток (рис. 1И), но в узловых образованиях соотношение антигенпре-зентирующих клеток и Т-лимфоцитов было статистически значимо более высокое, чем в ЩЖ.
В узлах и ткани ЩЖ CD1a+, CD3+, CD8+, CD4+! CD25+-клетки проникали в фолликулы щитовидной железы, располагаясь между тиреоцитами. Единичные клетки определялись в просвете фолликулов.
СD23+лимфоциты присутствовали в основном в лимфоидных фолликулах, полностью занимая центр размножения, и лишь небольшое количество клеток располагалось в мантийной зоне фолликулов и в ЛИ (рис. 1Е, Ж). Позитивность СD23 в узловых образованиях была достоверно ниже, чем в окружающей их ткани щитовидной железы.
Таблица 1. - Сравнительная характеристика экспрессии позитивности изучаемых антигенов и их соотношения в узловых образованиях и ткани щитовидной железы при АИТ
Me (LQ; HQ) р
ЛИ Узлы
CD4 7,38 (5,59; 15,05) 5,85 (3,05; 11,54) 0,18
CD8 17,46 (13,83; 20,28) 10,91 (9,55; 13,7) 0,001
CD3 28,38 (23,95; 36) 16,86 (13,12; 22,73) 0,001
CD23 9,50 (7; 14,14) 3,47 (2,46; 5,01) 0,001
CD25 3,27 (1,93; 4,87) 2,05 (1,46; 2,95) 0,08
CD1a 0,15 (0; 0,29) 0,13 (0,08; 0,25) 0,58
TGFß 9,66 (0,95; 22,99) 10,41 (0,33; 21,43) 0,42
CD25/CD4 0,30 (0,19; 0,92) 0,32 (0,18; 0,64) 0,62
CD25/CD3 (%) 7,97(5,66; 20,80) 17,49 (8,85; 24,53) 0,004
CD1a/CD3 0,005 (0,0; 0,007) 0,011 (0,004; 0,017) 0,006
С помощью корреляционного анализа Спирмена установлено, что между экспрессией маркеров CD1a. CD4, CD8, CD23, CD25, TGFp в ЛИ, окружающих узлы, и аналогичными маркерами в строме узлов имеются высоко достоверные положительные связи (табл. 2).
Выявлено также наличие статистически значимых положительных корреляционных связей между содержанием CD4+ и CD8+лимфоцитов и в ЛИ
А - экспрессия TGFß при аутоиммунном тиреоидите; Б, В - экспрессия CD3; Г - экспрессия CD8; Д - экспрессия CD4; Е, Ж - экспрессия CD23; З - экспрессия CD25; И - экспрессия CD1a. Иммунопероксидазная реакция. Ув.*160
Рисунок 1. - Экспрессия иммуногистохимических маркеров при аутоиммунном тиреоидите
и в узлах (табл. 3). В ЛИ установлены достоверные связи между позитивностью CD4 и CD23, а также между CD1a, CD4 и CD23. В узлах корреляционные связи между этими показателями были несущественными.
Не обнаружено достоверных корреляционных связей между количеством CD25+клеток. численностью других субпопуляций Т-лим-фоцитов и экспрессией CD23 (во всех случаях р>0,05). Наличие статистически значимой отрицательной корреляционной связи между экспрессией CD25 и CD3 в ЛИ, а также достоверной прямой связи между позитивностью маркеров CD25 и TGFp является косвенным подтверждением того, что CD25+ лимфоциты выполняют функции регуляторных клеток. Таблица 2. - Результаты корреляционного анализа экспрессии маркеров лимфоцитов в узлах и ткани щитовидной железы при АИТ
Корреляционные связи экспрессии г Р
маркеров лимфоцитов (Ме)
CD4 (ЛИ) &CD4 (уз) 0,919 <0,001
ОТ3(ЛИ)& CD3^3) 0,468 0,058
Ж25(ЛИ) & CD25 (уз) 0,959 <0,001
TGFß (ЛИ) &TGFß (уз) 0,99 <0,001
CD8 (ЛИ) & CD8^) 0,752 <0,001
CD23 (ЛИ) & CD23 (уз) 0,574 0,016
CD1a (ЛИ) & CD1a (уз) 0,979 <0,001
Таблица 3. - Результаты анализа корреляционных связей субпопуляций лимфоцитов при АИТ
Корреляционные связи экспрессии маркеров (Ме) в ЛИ rs Р Корреляционные связи экспрессии маркеров (Ме) в узлах rs Р
CD4(ra)&CD8 (ли) 0,701 <0,001 Ш4(уз)&Ш8(уз) 0,613 0,009
CD4(ra)&CD3(ra) 0,174 0,395 Ш4(уз)&Ш3(уз) 0,769 <0,001
CD4^)&CD23 (ли) 0,489 0,011 Ш4(уз)&Ш23(уз) 0,475 0,054
CD4(ra)&CD25(ra) -0,203 0,319 Ш4(уз)&Ш25(уз) -0,267 0,3
CD40m)&CD1a0ra) 0,455 0,019 Ш4(уз)&т1сс(уз) 0,218 0,4
CD4(ra)&TGFß(ra) 0,142 0,507 CD4(уз)&TGFß(уз) 0,147 0,602
CD8(ra)&CD3(ra) 0,337 0,092 Ш8(уз)&Ш3(уз) 0,787 <0,001
CD8(ra)&CD23(ra) 0,317 0,115 Ш8(уз)&Ш23(уз) 0,360 0,155
CD8(ra)&CD25(ra) -0,133 0,518 Ш8(уз)&Ш25(уз) -0,191 0,462
CD80m)&CD1a0ra) 0,370 0,063 т8(уз)&т1о(уз) 0,116 0,658
CD8(ra)&TGFß(ra) 0,106 0,622 CD8(уз)&TGFß(уз) 0,281 0,311
CD3(ra)&CD23(ra) 0,158 0,44 CD3(уз)&CD23(уз) 0,586 0,013
CD3(ra)&CD25(ra) -0,427 0,029 Ш3(уз)& CD25(уз) -0,204 0,433
CD30m)&CD1a0ra) 0,019 0,926 CD3(уз)&CD1a(уз) 0,229 0,377
CD3(ли)&TGFß(ли) -0,285 0,177 CD3(уз)&TGFß(уз) 0,213 0,446
CD23^)&CD1a(ra) 0,389 0,049 CD23(уз)&CD1a(уз) 0,181 0,486
CD23(ли)&CD25(ли) -0,360 0,071 Ш23(уз)&Ш25(уз) -0,287 0,264
CD23(ли)&TGFß(ли) -0,080 0,709 CD23(уз)&TGFß(уз) -0,091 0,747
CD25(ли)&CD1a(ли) 0,090 0,66 CD25(уз)&CD1a(уз) 0,118 0,651
CD25(ли)&TGFß(ли) 0,456 0,025 CD25(уз)&TGFß(уз) 0,574 0,025
CD1a(ra)&TGFß0ra) 0,254 0,231 CD1a(уз)&TGFß(уз) 0,152 0,59
При сравнении групп АИТ с узлами и без узловых образований, а также в группах АИТ с одним узлом и многоузловым тиреоидитом различий в распределении лимфоцитов и в экспрессии анализируемых маркеров не выявлено.
Выводы
1. При аутоиммунном тиреоидите количество клеток с фенотипами CD1a+, CD3+, CD4+, CD8+. CD23+, CD25+, инфильтрирующих узловые образо-
вания в щитовидной железе, находится в высоко достоверной прямой зависимости от числа этих же клеток, инфильтрирующих ткань, окружающую узлы.
2. В лимфоидных инфильтратах по сравнению с узловыми образованиями значимо больше В-лим-фоцитов и Т-клеток с фенотипом CD8+, однако соотношение антигенпрезентирующих клеток и Т-лимфоцитов, а также доля клеток, обладающих регуляторной активностью среди CD3+лимфоци-тов, в строме узлов существенно выше, чем в ЛИ.
Литература
1. Козлов, В. А. Естественные регуляторные Т-клетки и связанные с ними цитокины при хроническом аутоиммунном тиреоидите / В. А. Козлов [и др.] // Иммунология. -2008. - № 6. - С.357-361.
2. Ben-Skowronek, I. Subpopulacje limfocytôw w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy u dzieci / I.Ben-Skowronek [et al.] // Endokrynologia Pediatryczna. - 2007. -№6. - S. 9-20.
3. Bossowski, A. Evaluation of CD4+CD161+CD196+ and CD4+IL-17+ Th17 cells in the peripheral blood of young patients with Hashimoto's thyroiditis and Graves' disease / А. Bossowski [et al.] // Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism. - 2012. - №18. - Р.89-95.
4. Khan, F. A. Thyroid dysfunction: an autoimmune aspect / F. A. Khan [et al.] // International Journal of Clinical and Experimental Medicine. - 2015. - №8. - Р. 6677-6681.
5.Korn, T. IL-17 and Th17 Cells / Т. Korn [et al.] // Annual Review of Immunology. - 2009. - №27. - Р.485-517.
6. Li, M. O. Contextual regulation of inflammation: a duet by transforming growth factor-beta and interleukin-10 / M. O. Li, R. A. Flavell // Immunity. - 2008. - №28. - Р. 468-476.
7. Pearce, E. N. Thyroiditis / E. N. Pearce,A. P. Farwell, L. E. Braverman // The New England Journal of Medicine. -2003.- №348(26). - Р. 2646-2655.
8. Pyzik, A. Immune disorders in Hashimoto's thyroiditis: what do we know so far? / А. Pyzik [et al.] // Journal of Immunology Research. - 2015. - Р. 979-986.
9. Shevach, E. M. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cellmediated suppression / E. M. Shevach // Immunity. - 2009. -№30(5). - Р.636-645.
10. Zha, B. Distribution of lymphocyte subpopulations in thyroid glands of human autoimmune thyroid disease / В. Zha [et al.] // Journal of Clinical Laboratory Analysis. - 2014. - № 28(3). - Р. 249-254.
Literatura
1. Kozlov, V. A. Estestvenny'e regulyatorny'e T-kletki i svyazanny'e s nimi citokiny' pri xronicheskom autoimmunnom tireoidite / V. A. Kozlov [i dr.] // Immunologiya. - 2008. - № 6. - S.357-361.
2. Ben-Skowronek, I. Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy u dzieci / I.Ben-Skowronek [et al.] // Endokrynologia Pediatryczna. - 2007. -№6. - S. 9-20.
3. Bossowski, A. Evaluation of CD4+CD161+CD196+ and CD4+IL-17+ Th17 cells in the peripheral blood of young patients with Hashimoto's thyroiditis and Graves' disease / A. Bossowski [et al.] // Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism. - 2012. - №18. - R.89-95.
4. Khan, F. A. Thyroid dysfunction: an autoimmune aspect / F. A. Khan [et al.] // International Journal of Clinical and Experimental Medicine. - 2015. - №8. - R. 6677-6681.
5.Korn, T. IL-17 and Th17 Cells / T. Korn [et al.] // Annual Review of Immunology. - 2009. - №27. - R.485-517.
6. Li, M. O. Contextual regulation of inflammation: a duet by transforming growth factor-beta and interleukin-10 / M. O. Li, R. A. Flavell // Immunity. - 2008. - №28. - R. 468-476.
7. Pearce, E. N. Thyroiditis / E. N. Pearce,A. P. Farwell, L. E. Braverman // The New England Journal of Medicine. -2003.- №348(26). - R. 2646-2655.
8. Pyzik, A. Immune disorders in Hashimoto's thyroiditis: what do we know so far? / A. Pyzik [et al.] // Journal of Immunology Research. - 2015. - R. 979-986.
9. Shevach, E. M. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cellmediated suppression / E. M. Shevach // Immunity. - 2009. -№30(5). - R.636-645.
10. Zha, B. Distribution of lymphocyte subpopulations in thyroid glands of human autoimmune thyroid disease / V. Zha [et al.] // Journal of Clinical Laboratory Analysis. - 2014. - № 28(3). - R. 249-254.
IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF INTRATHYROIDAL LYMPHOCYTES PHENOTYPE IN AUTOIMMUNE THYROIDITIS
'-Butolina К. M, ''Lyalikov S. А, '-Basinsky V. А, 1 Shtabinskaya Т Т., 2-Marshalek А.
'"Educational Establishment "Grodno State Medical University", Grodno, Belarus 2"Nicolaus Copernicus University, Torun, Poland
The purpose of the research was to study the local immune processes in thyroid tissue in patients with autoimmune thyroiditis by immunohistochemistry of intrathyroidal lymphocytes phenotype. A highly reliable direct correlation between the number of cell phenotypes CDla +, CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD23 +, CD25 +, which infiltrate the nodules in the thyroid gland in patients with autoimmune thyroiditis, and the number of the same cells which infiltrate the tissue surrounding the nodules was identified. It has been noted, that the number of B-lymphocytes and CD8 + T cells is significantly higher in the lymphoid infiltrates as compared to nodules, and the correlation CD1a / CD3 and CD25 / CD3 in stroma of nodules is significantly higher than in the lymphoid infiltrate.
Keywords: autoimmune thyroiditis, immunohistochemistry, a subpopulation of lymphocytes.
Поступила: 19.02.2016 Отрецензирована: 29.02.2016
