CC BY
17
ОРИГ1НАЛЬН1 ДОСЛ1ДЖЕННЯ
© Абрамова К. В.
УДК 616.72 - 002.72: 579.01.8:616-097. 575
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АНТИВНД0Т0КСИН0В0Г0 ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ НА Ф0НЕ НПВП-ГАСТР0ПАТИИ
Абрамова К.В.
ГУ "Крымский государственный медицинский университет имени С.И.Георгиевского", г. Симферополь
Метою ц1еХ роботи було вивчення генетичного полшорфгзму Asp299Gly Toll-like рецепторгв 4 типу та ргвня експресИ CD14 i LPS Fitc рецепторгв на клгтинах моноитарно-макрофагального ряду у хворих на ревматогд-ний артрит (РА) з супутньою НПЗП-гастропатгею (НПЗП-ГП) та виразковою хворобою. Було встановлено вгроггдне пгдвищення експресИ CD14 та LPS Fitc у хворих на РА з супутньою НПЗП-ГП та виразковою хворобою, що характеризуе високу готовтсть даних клтин до прозапальног цитоктовог вгдповгдг на ендотоксино-вий (ЕТ) стимул. Вгдсоток хворих з гомозиготним варгантом гена Asp299Gly Toll-like рецепторгв 4 типу у хворих на ревматогдний артрит з супутньою НПЗП-гастропатгею та виразковою хворобою вгроггдно вище тж у групг поргвняння, що е умовою для гтерреспондерног в(дповгдг на ЕТ.
Ключовi слова: ревмато'дний артрит, НПЗП-гастропа™, ендотоксин-зв'язук^ рецептори.
Длительное применение нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) при ревматоидном артрите (РА) способно приводить к развитию НПВП индуцированной гастропатии (ГП) [11]. Развитие НПВП-ГП вообще, и у больных РА в частности, может являться своеобразным клиническим маркером дефектности мукозального барьера желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), приводящего к избыточной транслокации в портальную кровь такого мощнейшего провоспалительного фактора, каковым и является эндотоксин (ЭТ) грамнегативной флоры кишечника [2]. Взаимодействие ЭТ с клетками макрофагального-моноцитарного ряда опосредуется через 0014 рецепторы и ТоН-Нке рецепторы 4 типа (ИР 4) [3, 8]. Иммуногенетические исследования последнего десятилетия дали возможность выявлять полиморфизим Т1_Р 4, что позволяет выделять лиц из общей популяции с генетически детерминированным повышенным ответом на ЭТ стимул [9]. Учитывая вышеизложенное, логично предположить, что НПВП гастро и энте-ропатиии, за счет повышенной транслокации ЭТ в портальный кровоток, могут приводить у больных РА к «ускользанию» эффекта базисной терапии, более тяжёлому течению, высокой степени активности РА, а также объяснить существование резистентных к терапии клинических субтипов РА. Поэтому изучение у больных РА с ГП иммуногенетических маркеров клеточного ответа на ЭТ, состояния клеточной рецепции к ЭТ представляется нам целесообразным и актуальным вопросом.
Целью настоящего исследования было изучение экспрессии эндотоксин-связывающих рецепторов (ЭТ-Р) CD14 и LPS Fitc на моноцитах, гранулоцитах и полиморфизма гена Aspy299Gly TLR 4 типа у больных РА с сопутствующей НПВП-ГП и язвенной болезнью (ЯБ).
Материалы и методы исследований
Обследовано 92 пациента с РА (12 чел (11%) мужчин, 80 чел (89%) женщин), возрастом от 19 до 68 лет. Средний возраст больных - 47+1,89 л. Длительность заболевания от 1 года и до 20 лет. Все пациенты находились на стационарном лечении в ревматологическом отделении КРУ «КБ им. Н.А. Семашко» г. Симферополя. Диагноз РА устанавливали по критериям ACR (Американская Коллегия Ревматологов) [1,4]. Основными клиническими проявлениями являлись боль (при пальпации и движении), припухлость поражённых суставов, утренняя скованность в суставах от 30 минут до 2-х часов, ограничение подвижности суставов. Для объективного обследования суставов использовался стандартный опросник HAQ. По данным рентгенологического исследования были выявлены типичные для РА изменения. Рентгенологическую стадию определяли по модифицированному методу Steinbrocker. Критерием отбора в клинические группы был регулярный прием НПВП (больные получали селективные ингибиторы ЦОГ2 (с-ЦОГ2)- мелок-сикам, нимесулид), симптомы желудочной диспепсии, вследствие чего, всем больным было проведено фи-броэзофагогастродуоденоскопическое (ФЭГДС) исследование с прицельной биопсией и уреазным тес-
том. Диагноз ГП, ЯБ устанавливали по данным ФЭГДС с биопсией слизистой оболочки, проведением быстрого уреазного теста (для определения H.pylori) и иммуногистохимического исследования биоптатов [12].
Все пациенты были распределены на 3 клинические группы в зависимости от наличия НПВП ГП по данным ФЭГДС при отрицательном тесте на H.pylori. В 1 группу (сравнения) вошли больные РА без ГП (n=18). Во 2 группу вошли больные РА с НПВП- ГП (n=57), 3 группу составили больные РА с ЯБ (H.pylori негативной) (n=17). Всем больным определялся индекс DAS 28. Все пациенты в качестве базисной терапии получали метотрексат в стандартной дозировке 10-20 мг/нед. Группа больных, которые получали мелоксикам составила 28 человек, нимесулид - 46 человек. Глюкокортикоидные препараты (ГКС) перо-рально (медрол 8 мг/сут) получали 28 больных. Контрольную группу составили 23 здоровых донора, соответствующих группам больных РА по возрастному диапазону, половому распределению и национальной принадлежности.
Материалом исследования служила периферическая кровь, которую получали при поступлении больного на стационарный этап лечения. Определение ЭТ-Р CD14 и LPS Fitc на моноцитах и гранулоцитах периферической крови проводили методом проточной лазерной цитофлуорометрии с помощью проточного лазерного цитофлуорометра PAS III (Partec GmbH, Munster, Germany), используя в качестве флуоресцентных зондов коньюгат липолисахарида (ЛПС, эндотоксина) Escherichia coli K235 с флуорес-цеинизотиоцианатом (ЛПС-ФИТЦ) и моноклональных антител к антигену CD14, коньюгированных с фико-эритрином (lOTest® анти-CDH-PE; Clone RMO52, Immunotech Coulter Co., France) с использованием протоколов, разработанных в лаборатории клинической иммунологии Крымского государственного медицинского университета [5]. Уровень экспрессии CD14 и LPS Fitc выражали в условных единицах флуоресценции (усл.ед.флуор.). Полиморфизм гена Asp299Gly гена TLR4 был изучен у 37 больных РА. С целью изучения аллелей полиморфного участка Asp299Gly гена TLR4 выделяли геномную ДНК из венозной крови обследуемых методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфный участок ДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный № MS0011) ДНПП ТОВ Альфа Донецк.
Результаты и их обсуждение
Данные о причинном факторе НПВП ГП у больных РА представлены в таблице 1.
Таблица 1
Частота развития НПВП-ГП и ЯБ у пациентов, получающих селективные ЦОГ2.
Как следует из полученных результатов в таблице 1, убедительных данных о превалировании того или иного НПВП препарата в индукции ГП и ЯБ при РА не выявлено.
В таблице 2 приведен статистический анализ частоты развития ГП и ЯБ в зависимости от приема ГКС.
Таблица 2
Частота развития НПВП-ГП и ЯБ у пациентов,
получающих ГКС.
Больные РА Количество больных РА с НПВП-ГП Количество больных РА с ЯБ
Получающие ГКС (медрол 8 мг/сут) 71,4% (20 чел) 28,6% (8 чел)
Неполучающие ГКС 73,9% (34 чел) 26,1% (12 чел)
При сравнительном анализе полученных данных, представленных в таблице 2, не выявлено достоверных различий в развитии НПВП-ГП и ЯБ у пациентов, получающих ГКС и не получающих ГКС.
В таблице 3 приведены данные изучения индекса DAS 28 в группах больных с РА.
Таблица 3
Индекс активности РА по DAS 28.
Группа M ± m
1 группа 3,68+0,09
n =18
2 группа 5,30+0,18
n=57
p*l-2 <0,001
3 группа 5,43+0,09
n=17
p1-3 <0,001
p2-3 >0,5
Примечание: р1-2-достоверность различий между соотве-ствующим показателем 1 и 2 групп больных РА.
р1-3-достоверность между соотвествующим показателем 1 и 3 групп больных РА. P2-3-достоверность между соотвествующим показателем 2 и 3 групп больных РА.
У больных без сопутствующей ГП индекс DAS 28 составил - 3,68+0,09, что соответствует умеренной степени активности, во 2 группе с сопутствующей НПВП-ГП- 5,30+0,18, в третьей группе с ЯБ соответственно 5,43+0,09. Как видно из таблицы 3, у больных 2 и 3 клинических групп индекс активности Ра по DAS 28 достоверно выше чем в 1 клинической группе (p<0,001). Достоверных различий между 2 и 3 клиническими группами не выявлено (p>0,5). Следовательно, можно предположить, что развитие НПВП-ГП и ЯБ у больных Ра ассоциируется с более тяжелым течением основного заболевания.
НПВП Количество больных РА с НПВП-ГП Количество больных РА с ЯБ
Мелоксикам 71,4% (20 чел) 28,6% (8 чел)
Нимесулид 73,9% (34 чел) 26,1% (12 чел)
Таблица 4
Уровень экспрессии CD14 и LPS Fitc на моноцитах и гранулоцитах периферической крови больных РА без ГП,
сопутствующей НПВП-ГП, ЯБ (усл.ед.флуор.)
Показатель Статистический показатель 1 группа n=18 2 группа n=57 3 группа n=17 Контрольная группа n=15
CD 14 на моноцитах Ме ± m 29,9+2,59 р>0,05 p1-2<0,01 p1-3<0,01 33,9+1,44 р<0,01 38,6+3,91 р<0,01 25,7+1,92
CD 14 на гранулоцитах М ± m 0,655+0,02 р=0,58 p1-2<0,01 0,993+0,05 р=0,10 0,842+0,04 р=0,96 0,79+0,03
LPS Fitc на моноцитах М ± m 2,278+0,10 p>0,05 p1-2<0,01 p1-3<0,01 3,348+0,15 р<0,01 4,037+0,18 р<0,01 1,959+0,14
LPS Fitc на гранулоцитах М ± m 0,992+0,03 р=0,64 p1-2<0,01; p1-3<0,01 1,277+0,04 р=0,39 1,361+0,08 р=0,18 1,127+0,04
Примечание: р- достоверность различий с контрольной группой
p1.2-достоверность различий между соотвествующим показателем 1 и 2 групп больных РА p1.3.достоверность между соотвествующим показателем 1 и 3 групп больных РА.
Анализируя данные, представленные в таблице 4 следует, что экспрессия СО 14 рецепторов на моноцитах у больных всех клинических групп достоверно повышена по сравнению с группой здоровых лиц (р<0,05 и р<0,01 по критериям Данна). При сравнительном анализе уровня СО 14 на моноцитах в крови больных РА установлено, что наличие ЯБ сопровождается достоверным повышением экспрессии СО 14 рецепторов в крови по сравнению с больными РА без ГП и составляет соответственно 38,6+3,91 усл.ед.флуор. (р<0,01). При анализе уровня СО 14 рецепторов на моноцитах у больных 1 и 2 клинических групп не выявлено статистически достоверных отличий между группами (р>0,05).
Как следует из представленных данных, у больных РА в 1, 2 и 3 клинических группах уровень СО 14 рецепторов на гранулоцитах достоверно не отличается от величины этого показателя в контрольной группе. При этом, у больных РА во 2 клинической группе экспрессия СО 14 рецепторов на гранулоцитах достоверно повышена по сравнению с 1 клинической группой и составляет 0,993+0,05 усл.ед.флуор. (р<0,01).
Вместе с тем, статистически значимых различий данного показателя между 2 и 3 клиническими группами больных РА не выявлено.
Уровень LPS Fitc на моноцитах в 1 клинической группе достоверно не отличается от уровня этого показателя в контрольной группе (р>0,05), а у больных 2 и 3 клинических групп изучаемый показатель достоверно повышен по сравнению с группой контроля (p<0,01). При анализе данных, представленных в таблице, выявлено повышенный уровень LPS Fitc на моноцитах у больных 2 и 3 клинических групп по сравнению с 1 клинической группой (pi-2<0,01; pi-3<0,0l). Изучение уровня LPS Fitc на гранулоцитах не выявило достоверных различий в клинических группах по сравнению с группой здоровых лиц. Однако, было выявлено достоверное снижение уровня LPS Fitc на гранулоцитах в 1 клинической группе по сравнению со 2 и 3 клиническими группами (p1-2<0,01; p1-3<0,01).
В таблице 5 представлены результаты изучения распространённости полиморфизма TLR 4 у больных РА с НПВП - ГП и ЯБ.
Таблица 5
Распространённость полиморфизма Asp299Gly TLR 4 у больных РА на фоне НПВП-ГП и ЯБ
1 группа 2 группа 3 группа Контрольная группа
Генотип n=11 n=20 n=6 n=23
(абс.,%) (абс.,%) (абс.,%) (абс.,%)
GG 1 (9,1)* 0 (0) 0 (0) 0 (0)
AG 4 (36,4)* 0 (0)* 0 (0)* 1 (4,35)
AA 6 (54,5)* 20 (100) 6 (100) 22 (95,6)
*р<0,05 в сравнении с контролем
Как следует из данных представленных в таблице 5, у больных РА во всех клинических группах, как и в группе здоровых доноров, выявлена высокая частота встречаемости гомозиготного варианта (АА) гена АБр29901у. Гетерозиготный вариант (А0,00) гена АБр29901у 4 типа выявлен только у больных 1 клинической группы и достоверно выше по сравнению
с группой контроля (р<0,05), что, как известно, является условием гипореспондерного ответа на ЭТ [9].
Несмотря на широкое применение для лечения РА болезньмодифицирующих препаратов, НПВП продолжают оставаться основными симптоммодифи-цирующими средствами [4]. Как известно, НПВП обладают рядом побочных эффектов, среди которых
наиболее распространёнными являются поражение мукозального барьера гастродуоденальной зоны [12]. НПВП способны изменять продукцию медиаторов воспалительной реакции путём снижения синтеза прос-тагландинов, повышения синтеза фактора некроза опухоли-альфа (ФНОа) и лейкотриенов, что сопровождается увеличением нейтрофильно-эндотелиальной адгезии (повышение уровня экспрессии р2-интегриновых рецепторов CD11/CD18 и молекулы клеточной адгезии ICAM-1), что в конечном итоге ведет к снижению кровоснабжения слизистой оболочки и, как исход, развитие НПВП-индуцированной ГП и ЯБ [12]. Повреждение мукозального барьера создаёт условия для транслокации различных ксенобиотиков в портальную кровь. Одним из таких факторов является ЭТ грамнегативной флоры кишечника. Так, Castaneda et al, в исследовании показали, что большое количество ЭТ может приводить к геморрагическому повреждению слизистой оболочки желудка [7].
Решающую роль в распознавании ЭТ играют CD 14 рецепторы на макрофагальных клетках, которые, не имея внутрицитоплазматического домена, передают сигнал TLR, преимущественно TLR4 типа [8]. TLR4 типа являются филогенетически рецепторами для распознавания патоген-ассоциированных молекул, липополисахарида (ЛПС) и играют чрезвычайно важную роль во врождённом и приобретенном иммунитете. Взаимодействие TLR и их лигандов инициирует активацию сигнальных путей, что приводит к активации генов ответственных за развитие провоспа-лительных реакций, таких как ген ФНОа, интерлейки-ны 1,6,12, NFkp и других [8]. Следовательно, нарушение реализации сигналов через TLR может приводить к нарушению функции и развитию отклонений в иммунной системе.
Hamprecht A. в своих работах исследовала ассоциацию РА с генетическим полиморфизмом рецептора TLR2 G2408A, полиморфизмом рецептора TLR9 Т1237С и Т1486С. Было сделано предположение, что полиморфизм рецептора TLR9 Т1486С может влиять на характер течения РА, поскольку у людей с С-аллелью отмечался значительно выше уровень RF-антител, по сравнению с пациентами, которые не являются носителями С-аллеля [6]. Можно предположить, что у пациентов с аутоиммунными заболеваниями имеются изменения и нарушения в Toll-сигнальних системах, что является одним из звеньев патогенеза данных заболеваний.
Как известно, мембранная форма CD 14 рецептора определяет провоспалительный ответ преимущественно клеток моноцитарно-макрофагального ряда на ЭТ, связанный с плазменным белком LBP (липополи-сахарид связывающий белок) [8]. Полученные нами данные свидетельствую о повышении экспрессии данных рецепторов на моноцитах при РА, что определяет их повышенный провоспалительный ответ на данный стимул. LPS- Fitc комплекс, позволяет охарактеризовать другие типы рецепторных структур на клетках, которые осуществляют рецепцию ЭТ. К таким рецепторам могут быть отнесены так называемые скавенджер рецепторы CD11 a,b,c/CD18, лектин-подобные рецепторы, HSC70, HSP90a, CXCR4, GDF5 и другие. В условиях нормы, данные рецепторы могут выполнять функции нейтрализации ЭТ. В условиях патологии, данные рецепторы могут вместе с CD14
рецептора приводить к активации NF-kB и потенции-ровать ЭТ индуцированную продукцию провоспали-тельных цитокинов, экспрессию молекул адгезии и др. [3]. Таким образом, повышение экспрессии данных рецепторов у больных с сопутствующей ГП, по сравнению с группой больных РА без сопутствующей ГП, а также более частая встречаемость гомозиготного варианта полиморфизма Aspy299Gly TLR4 типа свидетельствует о том, что развитие НПВП-ГП при этом заболевании ассоциируется с более выраженной готовностью провоспалительного ответа на ЭТ. Это подтверждает потенциальное участие ЭТ в патогенезе данного клинического варианта течения РА.
Выводы
1. У всех больных РА зарегистрировано достоверное повышение экспрессии CD14 (р<0,05 и выше). Вместе с тем, при сопутствующей гастропатии экспрессия LPS Fitc на клетках моноцитарно-макрофагального ряда и гранулоцитах периферической крови достоверно выше диапазона нормы (р<0,01).
2. Наличие ГП у больных РА ассоциируется с более высокими показателями экспрессии ЛПС рецепторов, чем у больных без гастропатии. Так, во 2 и 3 клинических группах достоверно выше такие показатели как уровень CD 14 рецепторы и LPS Fitc на моноцитах и гранулоцитах, достоверно выше соотвес-тующих показателей 1 группы больных РА без сопутствующей ГП.
3. Установлено, что большинство больных РА (от 54,5% до 100 %) являются носителями гомозиготного варианта (АА) Asp299Gly Toll-like рецепторов 4 типа, что, как известно, ассоциируется с гиперреспондер-ным ответом на ЭТ.
4. Носители гетерозиготного варианта (AG,GG) гена Asp299Gly Toll-like рецепторов 4 типа значительно чаще встречаются в группе больных РА без сопутствующей ГП.
5. Учитывая, иммуногенетические факторы у больных РА с НПВП ГП предраспологающие к гиперре-спондерному клеточному ответу на ЭТ, патогенетически оправданным у данной категории больных РА является разработка методов направленных на консолидацию мукозального антиэндотоксинового барьера для уменьшения воздействия ЭТ на иммунные структуры ассоциированные со слизистыми оболочками желудочно-кишечного тракта.
Литература
1. Коваленко В.Н. Ревматоидный артрит: этиопатогенез, клиника, диагностика, лечение // Лки УкраТни. - 2005. -№1. - С. 24-26.
2. Yakovlev M. Element of endotoxin theory of human physiology and pathology: systemic endotoxinemia, endotoxin aggretion and endotoxin insufficiency // J.Endotoxin Research. - 2000. - Vol. 16, N2. - P.120-122.
3. Heine H., Rietschel E.T.,et.al. The biology of endotoxin. // Mol. Biotechnol. - 2001. - Vol.19. N 3. - P.279-296.
4. Насонов Е.Л. Новые направления в лечении ревматоидного артрита // Ревматол., иммунол. - 2003. - №5 (68).
5. Гордиенко А.И. Улучшенный метод получения флуоресцентного зонда для определения липополисаха-рид-связывающих рецепторов методом проточной лазерной цитофлуориметрии // Таврический медико-биологический вестник. - 2007. - №4.- С. 156-160.
6. Hamprecht A, Hamann L,Gomma A et al. Rapid aninex-pensive real-time PCR for genotyping functional polymor-
phisms within the Toll-like receptor -2, -4, and -9 genes // 10. J Immunol Methods . - 2004. - Vol. 285. - P. 281-91.
7. A.Castaneda, D.Mercer, J.Denning et al. Effects of endotoxin on gastric injury from luminal irritants in rats: potential roles of nitric oxide // J Physiol Gastrointest Liver 11. Physiol. - 1998. - Vol. 275. - P. 449-459.
8. Taro Kawai. Toll-like receptor downstream signaling. // Arthritis Res Ther 7. - 2005. - (DOI 10.1186/ar1469). -P. 12-19
9. Mieke F. Roelofs, Mark H. Wenink, Erik J.M. Toonen et al. 12. The Functional Variant (Asp299Gly) of Toll-like Receptor 4 (TLR4) Influences TLR4-Mediated Cytokine Production in Rheumatoid Arthritis // The Journal of Rheumatology. -
2008. - Vol. 35, N 4. - P. 558-561.
Summary
IMMUNOGENETIC AND CELLULAR MECHANISMS OF ANTIENDOTOXIN IMMUNITY IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS AND NSAID-GASTROPATHY. Abramova K.V.
Key words: rheumatoid arthritis, NSAID-gastropathy, endotoxin-binding receptors.
The aim of this work was to study the genetic polymorphism of Asp299Gly Toll like receptors of type 4 and the expression of CD14 and LPS Fitc receptors on the cells of monocyte-macrophage system in patients with rheumatoid arthritis (RA) and NSAID gastropathy (GP) or ulcer disease. The significantly higher level of expression CD14 and LPS Fitc in patients with RA and NSAID-GP and ulcer disease was determined and it characterizes the readiness of this cells to pro-inflammantory cytokine response on ET stimulus. The percent of patients with homozygote variant of Asp299gly Toll like receptors types 4 is considerably higher in patients with RA and NSAID-GP, ulcer disease than in groups of comparison and is the condition of receptors hyperresponder reaction on endotoxin. State University "Crimea State Medical University named after S. I. Georgievsky", Simferopol
Mamepian Hadiumoe do pedaKuil 12.11.2012 p.
Дранник Г.Н., Курченко А.И., Дранник А.Г. Иммунная система слизистих, физиологическая микрофлора и пробиотики // Киев: - ООО "ПОЛИГРАФ ПЛЮС". - 2009. - 144 с.
James F. Fries, Kirsten N. Murtagh, Mihoko Bennett et al. The Rise and Decline of Nonsteroidal antiinflammatory drug-associated gastropathy in rheumatoid arthritis // Arthritis & Rheumatism. - 2004. - Vol. 50, N 8. - P. 24332440.
Hawkey CJ. Nonsteroidal anti-inflammatory drug gastropathy // Gastroenterology. - 2000. - Vol. 119. - P. 521535.
