CC BY
50
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2014. Т. 16, № 5(1)
УДК 597.851: 619:616.995.1:636:612.017.11/12
ИММУНОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОПУЛЯЦИЙ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ
© 2014 Е.Б. Романова, В.Ю. Николаев
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород
Поступила 10.09.2014
Проанализированы изменения ряда иммунофизиологических параметров зеленых лягушек двух видов [озерная лягушка Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771) и прудовая лягушка Р. lessonae (Camerano, 1882)] в водоемах Нижегородской области разного генетического типа и водного баланса. Выявлены статистически значимые различия на видовом и популяционном уровнях. Особенности иммунного статуса изучаемых видов определяются их функциональным состоянием и спецификой среды обитания.
Ключевые слова: лейкоцитарная формула, иммуногематологические параметры, бесхвостые амфибии.
Исследование функций основных гомеостатических систем организма особенно значимо в условиях антропогенной трансформации среды. Удобными объектами для изучения этих систем являются зеленые лягушки - широко распространенные представители батрахофауны Поволжья. Комплекс зеленых лягушек представлен в Нижегородской области тремя видами [3, 9, 18]: лягушки озерная Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771), прудовая Р. lessonae (Camerano, 1882) и съедобная Р. kl. esculentus (Linneus, 1758). Последний вид произошел вследствие гибридизации между озерной и прудовой лягушками. Между тремя видами существуют более или менее четкие различия во внешней морфологии и биотопической приуроченности [1, 2]. Бесхвостые амфибии характеризуются высокой экологической толерантностью и успешно используются как зооиндикаторы качества среды [5, 12-14]. Их уникальное положение на филогенетической лестнице, наличие всей совокупности предшественников лимфоидных и миелоидных органов млекопитающих [19] предопределяют интерес к изучению адаптивного потенциала и популяционного ответа видов в условиях разнообразия биотопов урбанизированной территории.
Целью работы являлась сравнительная оценка иммунофизиологического состояния популяций озерной и прудовой лягушек в Нижегородской области.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Места обитания амфибий в пределах крупного промышленного города (г. Нижний Новгород) согласно типизации городских ландшафтов [4] классифицируются как районы многоэтажной застройки с осваиваемыми территориями, пустырями, участками с открытыми почвами, малыми
Романова Елена Борисовна, доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры экологии, [email protected]; Николаев Вадим Юрьевич, аспирант, [email protected]
водоемами с высоким уровнем загрязненности (II зона).
1- ый водоем - оз. Вторчермет (г. Н. Новгород,
Канавинский район). Координаты: широта
56°18'44.48"N (56.312356), долгота 43°50'56.14"Е (43.848929). Создано искусственно на месте переувлажненного понижения, представляет собой небольшой бессточный пруд. Озеро расположено в окружении городской застройки с плотным зеленым насаждением непосредственно у берегов. Качество воды озера по комплексу контролируемых показателей соответствовало III классу умеренно-загрязненных вод в поверхностном и IV классу загрязненных вод в придонном горизонте [6].
2- ой водоем - оз. Сормовской ТЭЦ (г. Н. Новгород, Сормовский район). Координаты: широта 56°21'9.88"N (56.352745), долгота 43°53'49.93"Е (43.897204). Искусственного происхождения, расположено в пойме р. Волги. Площадь около 100 м2. Находится под воздействием Сормовской ТЭЦ - осуществляется сброс теплой воды.
3- ий водоем - оз. Земснаряд (г. Н. Новгород,
Автозаводский район). Координаты: широта
56°14'13.99"N (56.237219), долгота 43°50'53.46"Е (43.848182). Озеро естественного происхождения, но его конфигурация изменена в результате выемки песка. Водоохранная зона расположена на второй надпойменной террасе р. Оки. Заполнение озера водой происходит за счет осадков, водообмена с грунтовым бассейном, притоком через ручей, впадающим в озеро в его северо-восточной части. Качество воды озера по комплексу контролируемых показателей соответствовало III классу умеренно загрязненных вод - как в поверхностном, так и в придонном горизонте [6].
4- ый водоем - оз. Парковое (г. Н. Новгород,
Автозаводский район). Координаты: широта
56°20'30.48"N (56.3418), долгота 43°51'22.22"Е (43.856171). Озеро искусственного происхождения, используется для рекреации. Водоохранная зона расположена на второй надпойменной террасе р. Оки. Озеро является бессточным, притоки в него также отсутствуют. Качество воды озера по
616
Проблемы прикладной экологии
комплексу контролируемых показателей соответствовало III классу умеренно загрязненных вод [6].
Еще два водоема, в которых отлавливались лягушки, находятся за пределами Нижнего Новгорода, в лесной зоне.
5- ый водоем - пруд д. Кудряшино (Нижего-
родская обл., Уренский район). Координаты: широта 57°22'47.8"N (57.379944), долгота
46°7'48.82"Е (46.130229). Происхождение искусственное. В пруд впадают два ручья; из пруда вытекает речка Березовка, впадающая в р. Усту. Елубина водоема не больше 2 м, дно илистое. Питание пруда: снеговое, дождевое и от впадающих ручьев.
6- ой водоем - пруд с. Пергалей (Нижегород-
ская обл., Бутурлинский район). Координаты: широта 55°31'14.3"N (55.52064), долгота
44°45'43.9"Е (44.762194). Происхождение искусственное. Максимальная глубина возле плотины -около 3 м. В настоящее время используется для водопоя крупного рогатого скота. Заполнение озера водой происходит за счет двух родников и осадков.
По генетическому типу выделили водоемы природного происхождения (оз. Земснаряд) и искусственного (остальные пять водоемов). По водному балансу исследованные водоемы можно разделить на проточные (оз. Земснаряд и пруд д. Кудряшино) и бессточные (оз. Сормовской ТЭЦ,
оз. Вторчермет, оз. Парковое и пруд с. Пергалей). В 2012-2013 гг. 77 прудовых лягушек отловлено в оз. Вторчермет, оз. Земснаряд и в пруду д. Кудряшино, 80 озерных лягушек - в пруду с. Пергалей, оз. Сормовской ТЭЦ и оз. Парковом (таблица).
Таблица. Сведения о водоемах, в которых отловлены зеленые лягушки
№ Место отбора Годис- следова- ния/число особей Тип ландшафта Генетический тип водоема Характеристика-водного баланса
Прудовая лягушка
1 пруд д. Кудряшино (Нижегородская обл., Уренский р-н) 2013/20 лесная зона, 180 км от г. Н. Новгорода искусственный проточный
2 оз. Земснаряд (Н. Новгород, Автозаводский р-н) 2013/20 зона многоэтажной застройки природный проточный
3 оз. Вторчермет (Н. Новгород, Канавинский р-н) 2012/17 зона многоэтажной застройки искусственный бессточный
4 2013/20
Озерная лягушка
1 пруд с. Пергалей (Нижегородская обл., Бутурлинский р-н) 2012/20 лесная зона, условный контроль, 100 км от г. Н. Новгорода искусственный бессточный
2 оз. Парковое (Н. Новгород, Автозаводский р-н) 2013/20 зона многоэтажной застройки искусственный бессточный
3 оз. Сормовской ТЭЦ (Н. Новгород, Сормовский р-Н) 2012/20 зона многоэтажной искусственный бессточный
4 2013/20 застройки
Все работы с животными проводились в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [11]. Массу тела амфибий определяли на технических весах с точностью до 0,02 г (ошибка измерения ±0,01). У обездвиженных животных выделяли тимус, селезенку и печень, брали кровь для приготовления мазков и получения сыворотки. Лимфоидные органы взвешивали на торсионных весах Waga Тог-syjna-WT с точностью до 0,1 мг (ошибка измерения ±0,03) и помещали в пробирки с охлажденной средой Хенкса (1мл для тимуса, 2 мл для селезенки, 5 мл для печени). Индексы (отношение массы
органа к массе тела) тимуса, селезенки и печени вычисляли в промилле (%о) [8, 16]. На среде Хенкса готовили суспензию клеток лимфоидных органов, определяли количество ядросодержащих клеток в 1 мм и относительное содержание живых клеток в 20 мкл рабочего разведения суспензии [17].
Фагоцитарную активность лейкоцитов крови оценивали по способности поглощать клетки дрожжей [10]. Активность иммунной защиты на гуморальном уровне оценивали по содержанию иммунных комплексов в сыворотке крови лягушек, используя метод, основанный на селективной преципитании комплексов в растворе поли-
617
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2014. Т. 16, № 5(1)
этиленгликоля [7], позволяющий выявить «крупные» (3,5%) и «мелкие» (7,0%) иммунные комплексы (ед. опт. плотности /100 мл сыворотки).
Для проверки данных на соответствие нормальному распределению применяли критерии Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка. Предварительный анализ показал, что первичные данные не соответствуют нормальному распределению, поэтому дальнейший статистический анализ проводили непараметрическими критерия Кру скал а-Уоллиса (Н); Данна (Z); Спирмана (г) и дискриминантным анализом в пакете прикладных программ STATISTIKA 10.0. За величину статистической значимости принимали />=0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Генетический тип и качественная характеристика городских озер, расположенных в зоне многоэтажной застройки, отразились на показателях лейкоцитарного состава исследованных популяций. Анализ полученных иммуногематологических данных зеленых лягушек выявил статистически значимые различия на видовом и популяционном уровнях. Популяция прудовых лягушек природного оз. Земснаряд (надпойменное, проточное) по сравнению с популяцией искусственного оз. Вторчермет (надпойменное, бессточное) характеризовалась пониженным содержанием миелоцитов, юных, палочкоядерных нейтрофиль-ных гранулоцитов, моноцитов; более высоким уровнем фагоцитарной активности лейкоцитов и повышенным содержанием в крови иммунных комплексов. Кроме того, у популяции оз. Земснаряд по сравнению с популяцией оз. Вторчермет отмечено повышение жизнеспособности ядросодержащих клеток лимфоидных органов: тимуса, селезенки и печени.
Сравнение лейкоцитарного состава периферической крови прудовых лягушек, обитающих в озерах городской территории, по сравнению с популяцией, обитающей за пределами городской черты (пруд д. Кудряшино), выявило увеличение доли нейтрофильных гранулоцитов, обусловленное возрастанием числа миелоцитов и сегментоядерных нейтрофилов. Также установлено снижение числа моноцитов, выполняющих фагоцитарную функцию, с (4,35±0,47)% до (2,80±0,26)% (Zi_ 2= 2,86; р=0,01). Доля эозинофилов и базофилов крови у исследованных популяций прудовых лягушек не изменялась.
Морфофизиологический анализ лимфоидных органов выявил снижение количества ядросодержащих клеток в тимусе у популяций амфибий оз. Земснаряд (2,36±0,27 тыс./мм3) и оз. Вторчермет (2,81±0,18 тыс./мм3) по сравнению с популяцией пруда д. Кудряшино - (5,02±0,50) (рис. 1), что свидетельствовало об угнетении функций центрального органа иммунной системы. При этом
снижение клеточности тимуса сопровождалось снижением жизнеспособности тимоцитов. Изучение клеточности селезенки выявило повышенное количество кариоцитов у городских популяций прудовых лягушек. Так, количество кариоцитов в селезенке популяции оз. Вторчермет (10,67±0,75 тыс./мм3) превышало аналогичный показатель популяции пруда д. Кудряшино (7,04±0,55 тыс./мм3) в 1,5 раза. Отметим, что при этом выявлено снижение жизнеспособности кариоцитов до 67,63% у популяций бессточного оз. Вторчермет (47,77±3,56) по сравнению с популяцией проточного водоема, удаленного от городской среды (70,63±4,66).
Качество среды обитания популяций прудовых лягушек отражалось и в снижении численности ядросодержащих клеток печени и их жизнеспособности. При этом количество гепатоцитов было статистически значимо меньше в городских популяциях прудовых лягушек оз. Земснаряд (24,17±2,02 тыс. /мм3) и оз. Вторчермет (20,36±1,60 тыс./мм3) по сравнению с популяцией пруда лесной зоны (27,75±1,25 тыс./мм3). Жизнеспособность клеток печени популяции оз. Вторчермет (39,15±3,47%) снижалась в 1,76 раза, по сравнению с условно контрольным водоемом (69,17±4,04%). При оценке функционального состояния лейкоцитов крови зеленых лягушек были выявлены значимые отклонения уровня фагоцитарной активности между исследованными популяциями. Снижение фагоцитарной активности лейкоцитов отмечались у популяций озерных лягушек городских водоемов по сравнению с популяцией, находящейся за пределами городской черты (пруд с. Пергалей). По результатам двухлетних наблюдений функциональная активность фагоцитов озерных лягушек выборки из популяции оз. Сормовской ТЭЦ в 2013 г. (23,90±1,56%) существенно снизалась по отношению с аналогичным показателем 2012 г. (37,60±1,28%). Высокие показатели функциональной активности лейкоцитарных клеток (41,45±1,73%) (рис. 2) и уровня иммунных комплексов в сыворотке крови выявлены у популяции прудовых лягушек, обитающей за пределами городской черты, в проточном водоеме. Наименьшим показателем фагоцитарной активности нейтрофилов характеризовалась популяция прудовых лягушек оз. Вторчермет (27,20±1,50%) - искусственного, бессточного водоема, что свидетельствовало о напряженности иммунных реакций организма.
У озерных лягушек из искусственного водоема, находящегося под воздействием теплых вод, сбрасываемых Сормовской ТЭЦ (оз. Сормовской ТЭЦ) выявлено статистически значимое снижение доли нейтрофильных гранулоцитов (U=58,5; р=0,00013), за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм, и увеличение доли базофильных гранулоцитов (U=90,0; р=0,003), по сравнению с
618
Проблемы прикладной экологии
популяцией надпойменного, бессточного озера искусственного происхождения (оз. Парковое), что свидетельствовало об интоксикации организма. Среди агранулоцитов было выявлено увели-
чение числа лимфоцитов (U=59,5; р=0,00015) и снижение доли моноцитов (U=54,5; р=0,00008) по сравнению с популяцией лесной зоны (пруд с. Пергалей).
Рис. 1. Количество ядросодержащих клеток (тыс/мм3) в тимусе - центральном органе иммунитета прудовых лягушек: 1 - пруд д. Кудряшино, 2 - оз. Земснаряд 3 - оз. Вторчермет
Рис. 2. Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови прудовых лягушек: 1 - пруд д. Кудряшино, 2 - оз. Земснаряд 3 - оз. Вторчермет
Отметим более низкие значения миелоцитов (3,10±0,30%; Ui_2=3,31; р=0,0009), характерные для популяции озерных лягушек (оз. Парковое) по сравнению с прудовыми (оз. Вторчермет). В
отношении остальных субпопуляций лейкоцитарных клеток на межвидовом уровне различий не выявлено. Морфофизиологические видовые особенности озерных лягушек (оз. Парковое) прояв-
619
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2014. Т. 16, № 5(1)
лялись в снижении относительной массы лимфоидных органов: тимуса (в 1,7 раза) (рис. 3), печени (в 1,6 раза) и селезенки (в 1,5 раза).
Оценка иммуннофизиологического статуса зеленых лягушек позволила получить набор показателей, требующих определенного обобщения. Одним из способов такого обобщения является дискриминантный анализ, позволяющий по совокупности всех показателей объекта классифицировать его, т.е. отнести к одной из нескольких групп (классов) оптимальным способом [15]. Важным показателем анализа является дискриминантная функция - линейная комбинация переменных, полученная в результате анализа, позволяющая объединять объекты в одну или несколько групп. При вычислении коэффициентов дискриминантных (канонических) функций были
получены данные, свидетельствующие о том, что функция 1 (Root 1) ответственна за 88,96% объясненной дисперсии, т.е. 88,96% всей дискриминирующей мощности определяется этой функцией, в то время как функция 2 (Root 2) определяет только 11,04% дискриминирующей мощности. Факторная структура показывает, что наибольшие корреляции с дискриминантной функцией 1 имеются у переменных, характеризующих наличие в крови иммунных комплексов, фагоцитарную активность, жизнеспособность клеток тимуса и печени. Наибольшие корреляции с дискриминантной функцией 2 - у переменных, характеризующих наличие в крови иммунных комплексов, кле-точность тимуса и жизнеспособность клеток тимуса и печени.
Рис. 3. Относительная масса тимуса (в %о) озерных (1) и прудовых (2) лягушек
На рис. 4 представлена диаграмма рассеяния канонических значений для пар значений дискриминантных функций. Из рисунка видно: наблюдения (лягушки), принадлежащие к одной выборке, локализованы в определенных областях плоскости, при этом эллипсы рассеяния группы 1 (пруд д. Кудряшино) и группы 3 (оз. Вторчермет) не имеют площадей перекрывания между собой. Это свидетельствует о том, что группы 1 и 3 значительно различаются между собой по совокупности исследованных показателей. Эллипс рассеяния группы 2 (оз. Земснаряд) локализован в определенной области плоскости и при этом имеет незначительные области перекрывания с другими группами. Таким образом, на основе исследованных показателей с помощью дискриминантного анализа проведена классификация и подтверждено разбиение популяций прудовых лягу-
шек на отдельные категории, при этом более существенные различия иммунного статуса выявлены между популяциями искусственного проточного водоема и искусственного, но бессточного.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований установлены видовые и популяционные особенности иммунофизиологических показателей популяций озерных и прудовых лягушек, населяющих водоемы Нижегородской области разного генетического типа и качественной характеристики. Видовые различия проявлялись в изменении морфофизиологических параметров лимфоидных органов: тимуса, печени и селезенки, слабо затрагивая лейкоцитарный профиль. Для особей обоих видов, обитающих в удаленных от городской черты водоемах, отмечены высокие показатели функ-
620
Проблемы прикладной экологии
циональной активности лейкоцитов и уровня им- мунных комплексов в сыворотке крови.
Root 1 vs. Root 2
Root 1 о
Кудряшино
Земснаряд
Вторчермет
Рис. 4. Диаграмма рассеяния для канонических значений дискриминантных функций выборок из природных популяций прудовых лягушек (Root 1 - дискриминантная функция 1, Root 2 - дискриминантная функция 2)
Более разнообразен спектр популяционных отличий. Высокий уровень клеток миелоидного ряда у прудовых лягушек из оз. Вторчермет искусственного происхождения (надпойменное, бессточное) по сравнению с популяцией природного оз. Земснаряд (надпойменное, проточное) обуславливал высокий адаптивный потенциал особей вида и устойчивость к условиям урбанизации и загрязнения. Функциональные нарушения в работе иммунной системы у особей, обитающих в городских искусственных бессточных водоемах, проявлялись в снижении жизнеспособности ядросодержащих клеток тимуса, селезенки, печени и низком уровне фагоцитарной активности лейкоцитов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Банников А.Г., Даревский И.С., Ищенко В.Г., Рустамов А.К., Щербак Н.Н. Определитель земноводных и пресмыкающихся фауны СССР. М.: Просвещение, 1977. 414 с.
2. Борисовский А.Г., Боркин Л.Я., Литвинчук С.Н., Ро-
занов Ю.М. Распространение зеленых лягушек (комплекс Rana esculenta) в Удмуртии // Вести. Удм. ун-та. Серия: Биология. 2001. № 5. С. 51-63.
3. Боркин Л.Я. Отряд Бесхвостые // Ананьева Н.Б., Боркин Л.Я., Даревский И.С., Орлов Н.Л. Земно-
водные и пресмыкающиеся. Энциклопедия природы России. М.: ABF, 1998. С. 19-174.
4. Вершинин В.Л. Распределение и видовой состав ам-
фибий городской черты Свердловска // Информационные материалы Института экологии растений и животных. Свердловск, 1980. С. 5-6.
5. Вершинин В.Л. Гемопоэз бесхвостых амфибий-специфика адаптациогенеза видов в современных экосистемах // Зоол. журн. 2004. Т. 83, № 11. С. 1367-1374.
6. Гелашвили Д.Б., Охапкин А.Г., Доронина А.И u др.
Экологическое состояние водных объектов Нижнего Новгорода: монография./ Под ред. Д.Б. Гелашвили. И. Новгород: ИНГУ, 2005. 414 с.
7. Гриневич Ю.А., Алферов А.Н. Определение иммун-
ных комплексов в крови онкологических больных // Лабораторное дело. 1981. № 8. С. 493-495.
8. Ивантер Э.Л. Адаптивные особенности мелких млекопитающих. Л.: Наука, 1985. 320 с.
9. Кузьмин С.Л. Земноводные бывшего СССР. М.: Т-во
науч. изд. КМК, 1999. 298 с.
10. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. М.: Наука, 1990. 224 с.
11. Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». [Электронный ресурс]: Разработан и опубликован в 1985 г. Советом междунар. науч. организаций. (Режим доступа: http://www/bio/msu/ru/112/ad080012/htm).
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2014. Т. 16, № 5(1)
12. Пескова Т.Ю. Структура популяций земноводных как биоиндикатор антропогенного загрязнения среды. М.: Наука, 2002. 132 с.
13. Романова Е.Б. Мониторинг состояния иммунной системы зеленых лягушек рода Рапа в условия антропогенной трансформации городской среды // Вести. Нижегор. гос. ун-та им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 1. С.131-134.
14. Силс Е.А. Сравнительный анализ гематологических показателей остромордой (Рапа arvalis, Nilsson, 1842) и озерной (Рапа ridibuada, Pallas, 1771) лягушек городских популяций // Вести. Оренбург, гос. ун-та. 2008. № 10 (92). С. 230-235.
15. Халафян A.A. Statistica 6: статистический анализ данных. М.: Бином, 2007. С. 199-212.
16. Шварц С.С., Смирнов В.С., Добринский Л.Н. Метод
морфофизиологических индикаторов в экологии наземных позвоночных. Свердловск: УФАН
СССР, 1968. 388 с.
17. Экологический мониторинг. Методы биологического и физико-химического мониторинга. Часть VI / Под ред. Д.Б. Гелашвили. 2006 С. 307-327.
18. Borkin L.J., Litvinchuk S.N., Mannapova E.I., Pestov M.V., Rosanov J.M. The distribution of green frogs (Rana esculenta complex) in Nizhny Novgorod province, Central European Russia // Russian Journal of Herpetology. 2002. V. 9, No. 3. P. 195-208.
19. Cooper E.L. Immunity mechanisms // Physiology of the Amphibian. 1976. V. 3. P. 163-272.
IMMUNOPHYSIOL OGICAL CHARACTERISTICS OF THE POPULATIONS OF GREEN
FROGS IN URBAN TERRITORY
© 2014 E.B. Romanova, V.Yu. Nikolaev
Nizhny Novgorod’s N.I. Lobachevsky University, Nizhny Novgorod
The changes in immunophysiological parameters of two species of green frogs [marsh frog Pelophylax ridibun-dus (Pallas, 1771) and pool frog P. lessonae (Camerano, 1882)], found in basins of the Nizhny Novgorod region with different genetic type and water balance were analysed. We have revealed statistically significant differences in species and population levels. It’s shown that the features of the immune status of studied species are defined by their functional state and the specifics of the environment.
Key words: the leukocytic formula of blood, immunohematological parameters, tailless amphibians.
Romanova Elena Borisovna, e-mail: [email protected]; Nikolaev Vadim Yurievich, e-mail: [email protected]
622
