CC BY
0
Базаров М. А., доктор ветеринарных наук
доцент Умирзаков И. C. ассистент
Андижанский институт сельского хозяйство и агротехнологий
Кличева И. Б., кандидат медицинских наук заведующий кафедрой, доцент.
Маликов Т. М. ассистент
Андижанский государственный медицинский институт
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ БИОТИН-СТРЕПТО АВИДИНОМ ПРИ ЯЩУРЕ
Аннотация. В данном статье представлены результаты сравнительной оценки чувствительности иммуноферментного анализа биотин-стрепто авидином при ящуре.
Ключевые слова: антитела, вирусу ящура, иммуноферментный метод, вирус везикулярной экзантемы свиней (ВЭС), вирус везикулярной болезни свиней (ВБС), реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД), вирусспецифические.
Bazarov M.A., Doctor of Veterinary Sciences
Associate Professor.
Umirzakov I.S.
Assistant.
Andijan Institute of Agriculture and Agrotechnology.
Klicheva I. B.,Candidate of Medical Sciences Head of Department, А ssociate professor.
Malikov T.M.
Assistant.
Andijan State Medical Institute
BIOTIN-STREPTO-AVIDIN ENZYME IMMUNOASSAY IN FOOT-
AND-MOOTH DISEASE
Annotation. This article presents the results of a comparative evaluation of the sensitivity of the biotin-strepto-avidin enzyme immunoassay for foot-and-mouth disease.
Key words: antibodies, foot-and-mouth disease virus, enzyme immunoassay, porcine vesicular exanthema virus (PVES), swine vesicular disease virus (SVD), radial immunodiffusion reactions (RID), virus-specific.
Введение: Известен ряд методов повышения чувствительности иммуноферментного анализа (ИФА). Одним из таких является использование биотин-авидина (стрептоавидина). По данным ряда исследователей введение этой системы в иммуноферментный анализ позволяет повысить чувствительность анализа. В то же время имеются сообщения о непригодности прямого варианта авидин- биотинового теста для повышения чувствительности ИФА из-за высокого уровня фона.
В настоящем сообщении приведены результаты определения диагностической ценности иммуноферментного метода с применением биотин-стрептоавидиновой системы при определении антигенов вируса ящура.
Методы и результаты исследование:
В работе использовали коммерческие антигены вируса ящура разных типов, вируса везикулярной экзантемы свиней (ВЭС) и вируса везикулярной болезни свиней (ВБС), изготовленные на экспериментальном заводе "Юрьевецветбиопрепарат", а также суспензии, приготовленные из инфицированных крольчат, мышат, афт морских свинок, свиней, овец и крупного рогатого скота (КРС), культуральные вирусы, полученные в культурах клеток ВНК-21, ББ-К8-2, С11.
Для проведения исследования использовали препараты антител и вирусу ящура с титрами в реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) не менее, чем 1:1600, выделенные по ранее разработанной авторами методике из гипериммунных сывороток свиней, кроликов, морских свинок, овец и крупного рогатого скота.
Биотинилирование антител, проводили добавлением к I мл раствора иммуноглобулинов (10 мг/мл в 0,1 М№ - бикарбонатном буфере, рН 8,8) 120 мил 0,1 раствора м - оксисукцимидного эфира биотина в диметилформамиде. После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре раствор диализовали против 0,05 М фосфатно-солевого буфера, рН 7,5.
Конъюгаты вирусспецифических антител с пероксидазой и в -лактамазой и в-Д-галактозидазой получали согласно ранее апробированным методам.
Конъюгаты стрептоавидина с пероксидазой, в-Д-галактозидазой и в-лактамазой получены из Института биоорганической химии им. Шемякина (г.Москва):
Постановку ИФМ с хромогенным субстратами осуществляли на полистироловых панелях, изготовленных ВНИИМТ (г.Москва). При постановке с флюорогенными субстратами использовали специальные чёрные и белые панели "Микрофлюор" фирмы " Dynateck 90 ФРГ, которые сенсибилизировали растворами иммуноглобулинов в концентрации 10 мкг/мл белка в 0,02М карбонатном буфере (рН 9,6) в течение I часа при 37°С или 18 часов при 4°С. Не связавшиеся антитела удаляли трёхкратной отмывкой панелей раствором, изготовленным из сухой композиции ВНИЯИ 9-1 и в сенсибилизированные лунки вносили по 0,1 мл разведённого двойным шагом
антигена вируса ящура (контрольного и исследуемого), начиная с разведения 1:2. После инкубации в течение I часа при 37°С лунки трижды промывали раствором ВНИЯИ 9-1 ив каждую лунку вносили по 0,1 мл рабочего разведения биотинилированных антител, которые подбирали экспериментальным путём. Панели инкубировали 60 мин. при 37°С, промывали как описано выше и добавляли по 0,1 мл рабочего разведения одного из конъюгатов (стрептоавидин-пероксидазы), стрептоавидин или стрептоавидин - Р-Д-галактозидазы, - в -лактамазы. После инкубации в течение I часа при 37°С лунки промывали, как описано выше и вносили субстрат, приготовленный по ранее подобранной прописи.
Учёт результатов ИФМ и ИФМ с биотинстрептоавидиновой системой с хромогенными субстратами проводили визуально или спектрофотометром МР-700, а с флюорогенными "Микрофлюор" фирмы " Dynateck ". на микрофлориметре.
Параллельно антигены исследовали в реакции связывания комплемента (РСК), широко используемой для диагностики ящура.
В первой серии опытов по "Шахматке" определяли рабочие разведения конъюгатов. В таблице I приведены значения разведений конъюгатов, при которых выявляются наименьшие количества исследуемых антигенов.
Как видно из данной таблицы, активность конъюгатов ферментов со стрептоавидином и антителами существенно не отличалась.
В дальнейших опытах конъюгаты использовали в разведениях, приведённых в таблице I.
Во второй серии опытов изучали чувствительность разных модификаций твёрдофазного иммуноферментного метода.
Данные, приведённые в таблице 2 свидетельствуют о том, что ИФМ с биотин-стрептоавидиновой системой и хромогенным субстратом позволяет выявлять антигены в разведениях в 2-8 раз превосходящих аналогичные показатели обычной ИФМ и в 200 раз РСК. Использование флюрогенного субстрата дополнительно повышает чувствительность биотин-стрептоавидиновой системы в три раза.
ТаблицаI
Характеристика используемых конъюгатов антител (п =3-5)
п/п, Конъюгаты Активность конъюгатов
I. Биотинилированные антитела 1:8000-1:2000
2. Стрептоавидин-пероксидаза 1:6000-1:1500
3. Стрептоавидин-в-лактамаза 1:600-1:200
4. Стрептоавидин-в-Д-галактозидаза 1:6000-1-750
5. Антитела+пероксидаза 1:6000-1:1500
6. Антитела + ß-лактамаза 1:400-1:200
7. Антитела+ß-Д-галактизидаза 1:6000-1:1000
Биотин-стрептоавидиновая система специфична и позволяет определять типовую принадлежность возбудителя ящура.
Вывод: таким образом показано, что использование ИФМ с биотини-лированными антителами и конъюгатами стрептоавидина с пероксидазой, ß-лактамазой, ß-Д-галактозидазой позволяет проводить определение вируса ящура и повысить в несколько раз чувствительность метода. В то же время нам не удалось добиться значительного повышения чувствительности ИФМ за счёт использования этой системы, несмотря на теоретическую возможность повышения её в несколько десятков раз.
Использованные источники:
1. Мищенко В.А., Шажко Е.А., Базаров М.А. и др. Сравнительная оценка разных вариантов твёрдофазного иммуноферментного анализа // Актуальные вопросы вет, вирусол. Владимир, 1987, Ч.2. C.50-51.
2. Мищенко В.А., Базаров М.А., Конюшкина Т.Б. Иммуноферментный метод определения вируса ящура о использование конъюгатов ß -лактамазы с вируспецифическими антителами // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - № 34 и 10.- С.739-741.
3. Мищенко В.А., Шажко К.А., Базаров М.А. и др. Сравнительная оценка методов конъюгация антител к вирусу ящура с пероксидазой хрена // Актуальные проблемы вет. вирусол. Владимир, 1987. Ч.2.- С.49-50.
4. Мищенко В.А., Базаров М.А., Смирнов А.Б. и др. Изучение диагностической ценности иммуноферментного метода с флюорогенными субстратами щелочной фосфатазы и ß -Л-галактозидазы // Актуальные проблемы вет. вирусол. 1988. Ч.1. С.61-62.
5. Мищенко В.А., Базаров М.А., Конюшкина Т.Б. и др. Влияние субстрата пероксидазы на чувствительность иммуноферментного метода // Сельхозонология. 1990. 6. C.190-192.
6. Шажко Е.А., Мищенко В.А., Улупов Н.А. и др. Способ получения гамма -глобулина / A.c. 1119697, 1982.
7. Осипов А.П., Егоров А.М. Молекулярные усилители в иммунохимическом анализе // Всесоюзное химическое общество им. Д. И. Менделеева. 1989. № 34.1.0.18-23.
8. Базаров М.А., Собиров И.А., Акбаров А.С., Вазиров Ш.С. «Эпизоотическая ситуация бешенства в республике Таджикистан» https://doi.org/10.5281/zenodo.7895327
9. Базаров М.А., Собиров И.А., Тожибаева М.Х., Вазиров Ш.С. «Молекулярно - генетической характеристики изолятов вируса бешенства в республике Таджикистан» https://doi.org/10.5281/zenodo.10002328
10. Базаров М.А., Собиров И.А., Солиев Б.Ч., Тожибаева М.Х., Вазиров Ш.С. Молекулярно- генетической характеристики изолятов вируса бешенства в республике Таджикистан https://doi.org/10.5281/zenodo.10002328
11. Базаров М.А., Собиров И.А., Солиев Б.Ч., Сотволдиев К.Х., Вазиров Ш.С. «Эпизоотологические аспекты бешенства в районах Республиканского подчинения (РРП) Таджикистана» https://doi.org/10.5281/zenodo.10002336
12. Базаров М.А. «Эпизоотология ва инфекцион касалликлар» фанидан ДАРСЛИК №55013 «Classic» 2024.
