CC BY
39
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
appearance of human donor cells in circulation and boosts cell levels in bone marrow at later time points after transplantation. Blood 2000; 95: 3620 7.
7. Noort W.A., Kruisselbrink A.B., in't Anker P.S. et al. Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood derived CD34[ i) cells in NQD/SCID mice. Exp. Hematol. 2002; 30: 870 8.
8. Lazarus H.M., Koc O.N., Devine S.M. et al. Cotransplantation of HLA identical sibling culture expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients. Biol. Blood Marrow Transplant.
2005; 11(5): 389 98.
9. Koc O.N., Gerson S.L., Cooper B.W. et al. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous blood stem cells and culture expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high dose chemotherapy. J. Clin. Oncol. 2000; 18: 307 16.
10. Horwitz E.M., Prockop D.J., Fitzpatrick L.A. et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat. Med. 1999; 5: 309 13.
Подготовила А.С. Григорян
По материалам Blood. Prepublished online May 11,9006; DO! 10.1182/b!ood-2005-11-011650
Иммунное отторжение мезенхимальных стромальных стволовых клеток при трансплантации во взрослый головной мозг
Многочисленные экспериментальные исследования, де монстрирующие высокую пластичность мезенхимальных стромальных стволовых клеток (ММСК), позволили перейти к испытаниям методов клеточной терапии для лечения различ ных заболеваний, в том числе и в неврологии [1]. Известно, что ММСК в подходящих in vitro условиях могут давать пре зумптивные нейроны [2, 3], приобретая типичный нейрональ ный фенотип и экспрессируя характерные для нервной ткани маркёры. Поскольку ММСК считаются иммунопривилеги рованными клетками и обладают иммуносупрессивным эф фектом [4], исследователи изучают возможность трансплан тации аллогенных клеток с терапевтической целью. Группой Coyne была показана способность аллогенных ММСК к дифференцировке в нейроны in vivo при трансплантации в развивающийся головной мозг крыс [5]. Донорские клетки начинали экспрессировать нейрональные маркеры и за тем мигрировали в различные удалённые участки головно го мозга. Более того, ММСК заселяли обширные участки фетального и неонатального мозга, экспрессируя сайт специфические нейрональные гены и демонстрируя хоро шую выживаемость [5]. Этот эксперимент показывает, что аллогенные ММСК способны к дифференцировке, мигра ции и длительному выживанию без иммунной реакции в эм бриональном головном мозге.
Недавно в он лайн версии журнала Stem Cells эта же группа исследователей опубликовала новые данные по трансплантации аллогенных ММСК во взрослый, уже сфор мировавшийся головной мозг. Во взрослом мозге количество факторов, отвечающих за дифференцировку клеток, значи тельно снижено по сравнению с эмбриональным мозгом. Исследователи предположили, что ММСК, попав в мозг взрослых животных, не будут реализовывать свой потенциал так же успешно, как это происходило у эмбрионов. Однако известно, что и во взрослом мозге есть два региона, обла дающих известной пластичностью. Это гиппокампальная зубчатая извилина и вентрикулярная субэпендимальная зона, клетки которых продолжают секретировать морфогене тические белки, отвечающие за пролиферацию, дифферен цировку и выживание резидентных клеток предшественников [6, 7]. Именно в эти области (гиппокамп и стриатум) авторы и выполняли трансплантации. Кроме того, авторы провери ли иммуногенность аллогенных ММСК при их транспланта ции. Взрослый головной мозг, в отличие от эмбрионального, обладает хорошо развитыми гуморальным и клеточным ком понентами иммунной системы, которые могут повлиять на
судьбу донорских клеток.
Оказалось, что в интактном взрослом головном мозге крыс в ответ на инфузию аллогенных ММСК возникает вое палительная реакция, приводящая к быстрому отторжению донорских клеток. Иммунная реакция стала основной прегра дой на пути выживания и стабильной интеграции в нервную ткань трансплантированных клеток.
Отторжение аллогенной донорской ткани обычно опое редуется адаптивным, или приобретённым, иммунитетом. Адаптивный иммунный ответ возникает на 1014 сутки пос ле трансплантации, именно столько времени требуется на презентацию антигена, селекцию и клональную экспансию Т клеточных популяций. При гистологических исследованиях тканей, полученных от экспериментальных животных, было обнаружено, что в данном случае задействуется не приобре тённый иммунитет. В области трансплантата присутствовало минимальное количество С08^ цитотоксических клеток, к тому же отторжение завершалось уже к седьмым суткам от начала эксперимента. Это свидетельствует о том, что ММСК отторгались посредством воспалительной реакции, то есть реакции врождённого иммунитета. В ней главным образом уча ствовали клетки микроглии (специализированные макрофа ги). Обычно при травмах мозга микроглиальные клетки быст ро мигрируют в зону повреждения и формируют своеобразный барьер, отделяющий нормальные клетки от разрушенных. При трансплантации ММСК наблюдался сходный эффект.
Интрацеребральная трансплантация вызывает серь ёзную механическую травму мозга, поскольку продвиже ние канюли через мозговую паренхиму ранит локальные нервные и сосудистые структуры, что, по видимому, и про воцирует воспаление. Уже на третьи сутки вокруг донорских клеток начиналось быстрое развитие клеток микроглии - как в стриатуме, так и в гиппокампе. На седьмые сутки фиб ронектин реактивный матрикс и макрофаги формирова ли вокруг ММСК барьер. Сходным образом отторгались и трансплантированные в мозг эндотелиальные клетки. В то же время фетальные нейральные трансплантаты вызывали иммунный ответ, опосредованный в основном Т клетками, и отторгались в течение 3 недель. Это указывает на то, что характер иммунной реакции контролируется характеристи ками донорских клеток.
ММСК и эндотелиальные клетки продуцируют грануло цитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ КСФ) и другие цитокины, усиливающие пролиферацию и созревание гранулоцитов и макрофагов и, соответственно,
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
микроглиальных элементов. Более того, ММСК экспресси руют молекулу SDF1, которая служит фактором хемотаксиса для клеток миелоидного ряда. Возможно, именно экспрессия этих факторов in situ приводит к пост операционному вое палению и разрушению трансплантатов.
Хотя гистологические и иммуногистохимические данные (клетки выявлялись антителами к GFP) свидетельствовали о полном отторжении трансплантата, в нервной ткани были обнаружены BrdU и BBZ (другие 2 метки ММСК), что позволя ло предположить выживание части ММСК и их созревание. Оказалось, что при трансплантации ММСК в сформиро вавшийся мозг происходит перенос их маркеров в клетки хозяина. В качестве контроля были использованы нежиз неспособные ММСК, прошедшие несколько циклов быстрой заморозки разморозки, либо подвергнутые микроволновому облучению, а затем трансплантированные в гиппокамп и стриатум интактных крыс. И, действительно, в течение 12 недель после трансплантации меченные BrDU и BBZ клетки широко распространились по обоим регионам трансплан тации. Их фенотипические характеристики полностью соот ветствовали характеристикам клеток, обнаруженных после трансплантаций жизнеспособных ММСК - это были нейроны реципиента. Таким образом, происходил перенос маркеров из трансплантированных ММСК в клетки предшественники нейронов хозяина, которые в дальнейшем дифференциро вались. И хотя стриатум, в отличие от гиппокампа, не явля
ется нейрогенной областью, в последнее время появились данные об отдельных прогениторных клетках, присутствующих в нём. Возможно, именно с этим связана схожесть картин в обоих районах трансплантации.
Таким образом, это исследование противоречит как дан ным о пластичности ММСК при их инфузиях в интактный либо повреждённый мозг, а также данным об их иммунопривиле гированности. Возможно, в ранних экспериментах исследо ватели ошибочно определяли выживание и пластичность ММСК, основываясь на обнаружении в тканях реципиента маркеров BrdU и BBZ. На самом деле, при трансплантации аллогенные ММСК отторгаются посредством воспалительной реакции, в которой участвуют клетки микроглии реципиента, а маркеры остаются в тканях в результате переноса. Явление переноса маркеров отрицает феномен трансдифференци ровки ММСК in vivo в условиях подходящего микроокруже ния. Результаты этого исследования ставят под сомнение перспективу использования аллогенных ММСК в качестве источника нейронов при трансплантациях нервной ткани, а также авторы статьи призывают к осторожности при даль нейшем использовании BrdU и BBZ в качестве маркеров трансплантированных мезенхимных стволовых клеток. Вмес те с тем, использование этих маркёров может быть причиной артефактов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bang O.Y., Lee J.S., Lee Р.Н., Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann. Neurol. 2005; 57(6): 874 82.
2. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J., Black I.B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000 ;61 (4): 364 70.
3. Sanchez Ramos J., Song S, Cardozo Pelaez F. et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp. Neurol. 2000; 164(2): 247 56.
4. Сергеев B.C. Иммунологические свойства мультипотентных
мезенхимных стромальных клеток. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2005; 2: 39 42.
5. Munoz Elias G., Marcus A.J., Coyne T.M. et al. Adult bone marrow stromal cells in the embryonic brain: engraftment, migration, differentiation, and long term survival. J. Neurosci. 2004; 24(19): 4585 95.
6. Doetsch F., Caille .I, Lim D.A. et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 1999; 97(6): 703 16.
7. Gage F.H., Kempermann G., Palmer T.D. et al. Multipotent progenitor cells in the adult dentate gyrus. J. Neurobiol. 1998; 36(2): 249 66.
Подготовила AC. Григорян По материалам Stem Cells Published online July 27, 2006
Первое потомство, полученное с использованием «искусственных» сперматозоидов, выделенных из эмбриональных стволовых клеток
Эксперименты по выделению и характеристике поло вых клеток из эмбриональных стволовых (ЭСК) позволят исследовать биологические процессы в гаметах и гамето генез, а также стать одним из способов лечения бесплодия в будущем [1]. До недавнего времени было показано фор мирование из ЭСК овоцитов (2] и сперматозоидов (3, 4]. Однако ни одна группа до сих пор не показала функциональ ность выделенных гамет, то есть их способность давать нор мальное потомство. Полученные путем оплодотворения «искусственными» гаметами бластоцисты не имплантиро вали животным.
Недавно группа Karim Nayernia из Georg August University (ОцШпдеп, Germany) впервые показала способность сперма тозоидов, выделенных из ЭСК мыши, к оплодотворению и развитию взрослых животных из полученных зародышей. Работа опубликована в журнале Developmental Cell.
Для определения функциональной активности полученных клеток ученые использовали две генетические конструкции с промоторами генов, характерных для премейотических гап лоидных мужских половых клеток. Под их контролем запус калась экспрессия флуоресцентных белков - зеленого и красного соответственно. Благодаря таким генетическим меткам, исследователи могли выделить сперматогониальные клетки в культуре ЭСК. Эти гены вносили в ЭСК в культуре и культивировали до 2 месяцев. В процессе культивирования использовался коктейль растворимых факторов, которые способствовали выживанию и самообновлению мышиных половых клеток. После культивирования в такой среде до 60% клеток, экспрессирующих трансген (а значит, комми тированных по пути развития мужских половых клеток), сор тировались и переносились в базовую среду без факторов дифференцировки. Через два месяца клетки подвергали
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006
