CC BY
0OECD+WoS: 1.06+QU (Microbiology), 4.01+AH (Agriculture, Multidisciplinary)
https://doi.org/10.31993/2308-6459-2024-107-3-16657 Полнотекстовая статья
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СТЕБЛЕВОГО МЕЛАНОЗА ПШЕНИЦЫ PSEUDOMONAS CICHORII МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
Е.В. Воронов1, О.Ю. Словарева1*, А.А. Десятерик1,2, М.О. Кондратьев1, А.Н. Игнатов3
'Всероссийский центр карантина растений, Быково 2Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва 3Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы, Москва
* ответственный за переписку, e-mail: [email protected]
Фитопатогенная бактерия Pseudomonas cichorii поражает широкий перечень сельскохозяйственных культур, в том числе вызывает стеблевой меланоз пшеницы - культуры стратегического значения для России. Возбудитель стеблевого меланоза регулируется импортерами российской зерновой продукции. В связи с этим, важная задача - актуализация метода идентификации P cichorii на основе полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ). В качестве мишени для ПЦР-РВ использован участок длиной 90 п.о. одного из известных генов патогенности hrcRST P. cichorii. Положительный результат ПЦР-анализа был получен для референтных штаммов P cichorii и подтвержден секвенированием ДНК последовательности ампликона. Полученные нуклеотидные последовательности были сопоставлены с гомологичными фрагментами генома типового штамма DSM 50259. В результате сравнительного анализа ДНК были изменены последовательности прямого праймера и зонда. Для зонда была показана возможность применения доступной на территории РФ модификации в которой используется сочетание красителя FAM и гасителя флуоресценции BHQ.Оценку специфичности новой праймерной системы ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 проводили с использованием 107 штаммов бактерий рода Pseudomonas, включая P cichorii, P. fuscovaginae, P. syringae, P. trivialis, P. viridiflava, P. chlororaphis, P. lutea, P. orientalis. С ДНК 4-х штаммов (P poae, P. graminis и 2 штамма P. fluorescens) показана неспецифичная реакция на 35-37 пороговом цикле, накопление не имело экспоненциальный вид. Аналитическая чувствительность теста позволяет обнаружить P. cichorii в концентрации 101 КОЕ/мл. Тест ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 может быть использован в качестве отборочного при обнаружении P àchorii в растительной продукции и для характеристики чистых бактериальных культур.
Ключевые слова: ПЦР-РВ, бактериозы зерновых культур, фитосанитарные требования, карантин растений, диагностика фитопатогенов, молекулярно-генетические методы идентификации
Поступила в редакцию: '6.08.2024 Принята к печати: 0'.''.2024
Введение
Грамотрицательная гамма-протеобактерия Pseudomonas cichorii (далее - Pc) - опасный патоген, вызывающий заболевания многих сельскохозяйственных культур. Бактерия патогенна главным образом для культур семейств Сложноцветные, Мальвовые, Бобовые. Основными поражаемыми растениями являются Apium graveolens (сельдерей пахучий) (Surico, Iacobellis, 1978), Chrysanthemum (хризантема) (Janse, 1987; Osdashi, 2020), включая Chrysanthemum morifolium (хризантема садовая) (Rodrigues et al., 1976); Cichorium endivia (эндивий) (Patel at el., 2021) и его подвиды и вариететы, Cichorium intybus (цикорий обыкновенный) (Van Outryve et al., 1989), Gerbera (гербера), в т.ч. Gerbera jamesonii (гербера Джем-сона) (Miller, Knauss, 1973), Hibiscus rosa-sinensis (гибискус китайский) (Chase, 1986), Vigna angularis (адзуки) (Wood, Easdown, 1990) и Lactuca sativa (латук посевной) (Hikichi et al., 1996). К прочим растениям, которым может вредить патоген, относятся также представители семейств Тыквенные, Пасленовые, Яснотковые, Мятликовые и некоторых других: Ocimum basilicum (базилик душистый) (Miller et al., 1986), Borago officinalis (огуречная трава)
(Cambra et al., 2004), Citrullus lanatus (арбуз) (Amadi et al., 2009), Coreopsis lanceolata (кореопсис ланцетовидный) (Garibaldi at el., 2009), Cucumismelo (дыня), Cucurbitapepo (кабачок) (Bastas, 2013), Duranta erecta (дуранта ползучая) (Gumtow et al., 2013), Glycine max (соя) (Yu, Lee, 2012), Luffa aegyptiaca (люффа египетская) (Sharma, Arora, 2016), Nicotiana tabacum (табак), Phlox paniculata (флокс метельчатый) (Corryn et al., 2009), Plumeria pudica (плюмерия стыдливая) (Sugiyama et al., 2018), Solanum lycopersicum (томат) (Trantas et al., 2013), Stevia rebaudiana (стевия медовая) (Marque et al., 2016), Solanum melongena (баклажан) (Hikichi et al., 2013), Perilla frutescens (перилла) (Jang et al., 2023), Triticum (пшеница) (Piening, MacPherson, 1985) и ряд других видов.
В связи с широким перечнем поражаемых культур и многообразием вызываемых симптомов, бактериозы, вызываемые Pc, имеют множество названий - бактериальный ожог сельдерея (bacterial blight of celery) (Elsisi, 2019), мокрая гниль грибных пластинок (drippy gill of mushrooms) (Gill, 1994), листовая гниль перца (leaf rot of
© Воронов Е.В., Словарева О.Ю., Десятерик А.А., Кондратьев М.О., Игнатов А.Н. Статья открытого доступа, публикуемая Всероссийским институтом защиты растений (Санкт-Петербург) и распространяемая на условиях Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
capsicum) (Rivera et all., 1981), лаковая пятнистость латука (varnish spot of lettuce) (Grogan et al., 1977) и другие.
Как патоген зерновых культур, Pc впервые упомянут в 1965 г., когда бактерия была изолирована из яровой пшеницы, выращиваемой на почве с дефицитом меди в Канаде (Piening, MacPherson, 1985). В дальнейшем, сообщалось об обнаружениях возбудителя на пшенице в 1974-1996 гг. в США, Новой Зеландии и Аргентине (Wilkie, Dye, 1974; Malhi et al., 1989; Perneznt et al., 1994; Alippi, 1996). Бактериоз, вызываемый Pc на пшенице, был назван стеблевым меланозом; симптомы заболевания появляются в фазе молочной спелости в виде мелких светло-коричневых поражений на стебле под нижними узлами (Piening,
MacPherson, 1985).
Актуальность изучения Рс как патогена пшеницы вызвана тем, что бактерия регулируется фитосанитарными требованиями Египта, Иордании и Мексики - крупных импортеров российской зерновой продукции (Словаре-ва, 2023). Для проведения анализа экспортируемой из РФ пшеницы на наличие Рс требуются надежные экспресс-тесты, которые на момент начала исследования отсутствовали, или компоненты для них не были доступны на территории РФ.
Цель исследования - разработка оригинальной прай-мерной системы для ПЦР анализа в режиме «реального времени» для идентификации Рс.
Материалы и методы исследования
Материалами исследования являлись штаммы целевого вида Pc VNIIKR-B-0201, VNIIKR-B-0202, VNIIKR-B-0203 (Тешич и др., 2021) и 104 штамма родственных бактерий рода Pseudomonas (табл. 1).
В таблице 2 представлены характеристики используемых олигонуклеотидов.
Приведенный в публикации B. Cottyn с коллегами (2010) модифицированный олигонуклеотид (зонд) PscHrcMGB687 (54-FAM-TTC AAG CAG GCC ATG T-MGB-NFQ3-34), входящий в состав теста ПЦР-РВ PscHrc662F/ PscHrc751R/ PscHrcMGB687 на участок длиной 90 п.о. одного из генов патогенности hrcRST (Cottyn et al., 2010), в работе не использовали, поскольку длина зонда составляла 16 нуклеотидов, а температура отжига всего 48 °C. Указанные характеристики являются не оптимальными для зонда в случае использования его без модификации MGB (minor groove binder, торговая марка Applied Biosystems TaqMan, США), увеличивающей температуру отжига даже при низком GC-составе и небольшой длине.
Предварительный этап оценки наличия генетической мишени для праймеров PscHrc662F/PscHrc751R (Cottyn et al., 2010) у Pc проводили с ДНК штаммов VNIIKR-B-0201, VNIIKR-B-0202, VNIIKR-B-0203. Использовали следующий состав реакционной смеси: 16.0 мкл воды, свободной от нуклеаз, 5.0 мкл 5* qPCRmix-HS (ЗАО «Евроген», Россия), по 1 мкл каждого праймера в концентрации 10 пмоль и 2.0 мкл ДНК. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь вместо ДНК вносили деио-низированную воду. Параметры ПЦР: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин., затем 35 циклов: 95 °C - 15 с, 60 °C - 40 с, 72 °C -15 с, финальная элонгация при 72 °C - 7 мин. ПЦР проводили на амплификаторе ДТпрайм 5М6 («ДНК-Технология», Россия). Каждый штамм тестировали в трех повторах. Продукты ПЦР двух повторов визуализировали с помощью электрофореза в 2.0 % агарозном геле (размер ПЦР-продукта 90 п.о.) с окраской красителем бромистый этидий и документировали при помощи системы ChemiDocTM XRS+ (Bio-Rad, США). Продукты ПЦР третьего повтора очищали с помощью «Cleanup Standard» (ЗАО «Евроген», Россия), измеряли концентрацию ДНК на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, США) и секвенировали методом Сэнгера с использованием набора «BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit» (Thermo Scientific, США). Обработку полученных в результате секвенирования нуклеотидных последовательностей проводили в программе Ugene 47 (Unipro UGENE
software, [сайт] URL: https://ugene.net/ru/download-all. html).
Последовательности целевых ампликонов штаммов VNIIKR-B-0201, VNIIKR-B-0202, VNIIKR-B-0203, полученные с праймерами PscHrc662F/PscHrc751R, выравнивали в программе Ugene 47 (Unipro UGENE software, [сайт] URL: https://ugene.net/ru/download-all.html) вместе с гомологичной последовательностью из генома типового штамма Pc DSM 50259 (RefSeQ NZ_CP007039.1) с помощью алгоритма UGENE. Выравненные нуклеотид-ные последовательности использовали при редактировании последовательностей праймеров и зонда для теста PscHrc662F/PscHrc751R/PscHrcMGB687 (Cottyn et al., 2010) и при разработке теста ПЦР-РВ. Испытание разработанного теста ПЦР-РВ проводили на амплификаторе детектирующем CFX96 (Bio-Rad, США). Реакционная смесь содержала: 14.9 мкл воды, свободной от нуклеаз, 5.0 мкл 5X qPCRmix-HS (ЗАО «Евроген», Россия), по 1.0 мкл каждого праймера в концентрации 10 пмоль, 0.1 мкл внутреннего положительного контроля (ЗАО «Синтол», Россия), и 2.0 мкл ДНК. Параметры ПЦР: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин., затем 45 циклов: 95 °C - 15 с и 60 °C - 45 с.
Оценку способности нового теста ПЦР-РВ отличать Pc от других бактерий рода Pseudomonas проводили путем тестирования целевых и родственных штаммов, перечисленных в таблице 1.
Оценку аналитической чувствительности (наименьшего числа копий генетической мишени, детектируемых в образце) нового теста ПЦР-РВ проводили с использованием ДНК, выделенной из бактериальных суспензий штамма Pc VNIIKR-B-0201 в концентрациях от 101 КОЕ/ мл (низкая) до 107 КОЕ/мл (высокая). В качестве матрицы для суспензий использовали стерильную воду (тестирование чистой культуры) и аналитические пробы, приготовленные из семян пшеницы по методике, оптимизированной для идентификации других бактериозов зерновых культур (Мувинги и др., 2022). Концентрацию бактерий в суспензиях определяли методом стандартных разведений и высевом на питательный агар.
Результаты проведения нового теста ПЦР-РВ оценивали как положительные при наличии специфичной реакции в виде экспоненциальной кривой флуоресценции по каналу FAM и при отсутствии специфичной реакции при тестировании отрицательных контролей, а также при наличии реакции по каналу HEX (внутренний положительный контроль) при тестировании всех образцов ДНК.
Таблица 1. Штаммы бактерий, используемые в исследовании Table 1. Bacteria strains, used in the study
Штамм VNIIKR-B [Strain VNIIKR-B]* Вид бактерии [Bacterial species] Растение -хозяин [Host plant]
0201, 0202, 0203 Pseudomonas cichorii Lactuca sativa
0335 (DSM 7231) P. fuscovaginae Oryza sativa
0440 (CFBP 2216) P. syringae pv. coronafaciens Avena sativa
0204 (20M5-11), 0205 (20M5-12), 0206 (20M52-170) P. syringae pv. atrofaciens Triticum aestivum
0207 (20M25-82) P. syringae pv. atrofaciens Triticum durum
0208 (20M32-116), 0209 (20M39-138) P. syringae pv. syringae Triticum aestivum
0210 (20M5-10) P. syringae pv. aptata Triticum aestivum
0211 (20M29-101), 0213 (22В16-65), 0214 (22В48-183) P. syringae Triticum aestivum
0212 (20M30-107) P. syringae Triticum turgidum
0215 (22C1-344), 0216 (22C1-360), 0217 (22C46-472) P. syringae Hordeum vulgare
0218 (20M2-5), 0219 (20M19-55), 0221 (20M50-163) P. trivialis Triticum aestivum
0220 (20M28-91) P. trivialis Secale cereale
0222 (20M3-6), 0223 (20M9-25), 0226 (20M22-66), 0227 (20M22-69), 0228 (20M26-83) P. graminis Triticum aestivum
0224 (20M15-43) P. graminis Triticum dicoccum
0225 (20M18-50) P. graminis Triticum sphaerococcum
0229 (20M28-98) P. graminis Secale cereale
0230 (20M3-7), 0231 (20M9-26), 0232 (20M26-84), 0233 (20M27-85), 0234 (20M27-86) P. poae Triticum aestivum
0235 (21K5-19), 0236 (22C1-339), 0237 (22C1-340), 0238 (22C1-341) P. poae Hordeum vulgare
0239 (20M5-9), 0241 (20M33-120), 0242 (20M34-124) P. viridiflava Triticum aestivum
0240 (20M25-81) P. viridiflava Triticum durum
0243 (20M33-121) P. chlororaphis Triticum aestivum
0244 (22B27-152), 0246 (22B60-179) P. lutea Triticum aestivum
0245 (22B62-155) P. lutea Secale cereale
0247 (22B11-316) P. orientalis Triticum aestivum
0260 (20M23-74) P. fluorescens Triticum aestivum
0263 (20M31-109) P. fluorescens ÁTriticosecale
0248 (20M1-1), 0262 (20M28-96), 0275 (20M55-177), 0286 (22B62-157) Pseudomonas sp. Secale cereale
0249 (20M6-13), 0250 (20M6-14), 0251 (20M7-21), 0252 (20M8-22), 0258 (20M19-56), 0259 (20M21-61), 0261 (20M24-80), 0264 (20M33-122), 0265 (20M38-136), 0266 (20M39-139), 0267 (20M40-142), 0268 (20M42-148), 0269 (20M43-149), 0270 (20M45-152), 0271 (20M49-162), 0272 (20M50-165), 0273 (20M51-166), 0274 (20M53-172)., 2023), 0276 (21K16-63), 0278 (21K24-78), 0281 (22B58-6), 0283 (22B42-25), 0282 (22B42-23), 0284 (22B29-86), (22B52-181), 0288 (22B36-217), 0289 (22B33-225), 0290 (22B33-229), 0293 (22B11-317), 0295 (22C2-375), 0296 (22C8-394), 0298 (22To1-2), 0299 (22To1-3), 0300 (22To1-4), 0301 (2To1-8), 0302 (22To1-15) Pseudomonas sp. Triticum aestivum
0253 (20M11-31), 0255 (20M13-40), 0256 (20M16-45) Pseudomonas sp. 'ATriticosecale
0254 (20M12-38) Pseudomonas sp. Triticum turgidum
0257 (20M17-49) Pseudomonas sp. Triticum sphaerococcum
0277 (21K18-69), 0291 (22B23-279), 0292 (22B23-281), 0294 (22C1-334), 0297 (22C37-509), Pseudomonas sp. Hordeum vulgare
0279 (21K45-92), 0280 (21K59-101), 0303 (22To2-16), 0304 (22To2-19), 0305 (22To2-21) Pseudomonas sp. Avena sativa
0285 (22C28-107) Pseudomonas sp. Triticum durum
*VNIIKR-B - Коллекция фитопатогенных бактерий ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИ-ИКР»). Происхождение штаммов, кроме VNIIKR-B-0335 (DSM 7231) и VNIIKR-B-0440 (CFBP 2216) - Российская Федерация; 20М означает «2020 год, регион сбора Москва», 21К означает «2021 год, регион сбора Крым», 22В означает «2022 год, регион сбора Волгоградская область», 22С означает «2022 год, регион сбора Ставропольский край», 22То означает «2022 год, регион сбора Томская область».
Для выделения ДНК применяли набор «Проба-ГС» (ЗАО «АгроДиагностика», Россия). Олигонуклеотиды синтезировали в ЗАО «Евроген» (Россия).
Таблица 2. Характеристики олигонуклеотидов, использованных в исследовании Table 2. Characteristics of the oligonucleotides, used in the study
Олигонуклеотид [Oligonucleotide] Последовательность 5-3' [Sequence] GC-состав, % [GC-content, %] Tm*, °C Источник [Source]
PscHrc662F AGG CTT TAT GGA AAC CCT GA CG 5Q 62 Cottyn et al., 2Q1Q
PscHrc751R ACA ATC ACC GCC ACG ATC AG 55 6Q
PscP1 6FAM-CAA GCA GGC CAT GTT GCT GGT GGT G-BHQ1 6Q 71 Это исследование
PscF AGG CTT TAT GGA AAC CCT GAC 48 6Q [This study]
*Tm - температура плавления праймера.
Результаты исследования и обсуждение
В результате проведения теста PscHrc662F/PscHrc751R (СоНуп et а1., 2010) с ДНК штаммов УМ1КЯ-В-0201, УШКК-В-0202, УМЖК-В-0203 и электрофореза ПЦР-продуктов в агарозном геле, визуализированы фрагменты длиной 90 п.о. (рис. 1).
Рисунок 1. Электрофореграмма результатов теста PscHrc662F/PscHrc751R с ДНК Pseudomonas cichorii. Примечание: М - маркер длин ДНК 50+ bp; 1, 2 - ДНК штамма VNIIKR-B-0201; 3, 4 - ДНК штамма VNIIKR-B-0202; 5, 6 - ДНК штамма VNIIKR-B-0203; 7, 8 - отрицательный контроль амплификации
Figure 1. Electropherogram of PscHrc662F/PscHrc751R test
results of amplification of Pseudomonas cichorii DNA. Note: M - DNA length marker 50+ bp; 1, 2 - DNA of strain VNIIKR-B-0201; 3, 4 - DNA of strain VNIIKR-B-0202; 5, 6 - DNA of strain VNIIKR-B-0203; 7, 8 - negative amplification control
Путем проведения ПЦР in silico с праймерами PscHrc662F и PscHrc751R на последовательности генома штамма DSM 50259 (RefSeQ NZ_CP007039.1) в программе Ugene 47 (Unipro UGENE software, [сайт] URL: https://
ugene.net/ru/download-all.html), получена нуклеотидная последовательность, представленная на рисунке 2.
Длина зонда была увеличена до 25 п.о., что привело к повышению температуры отжига с 48 °C до 71 °C. Указанное изменение позволило применить для модификации зонда стандартную и наиболее доступную по цене конструкцию 6FAM-/BHQ1 вместо MGB.
В результате проведения нового теста ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 со штаммами бактерий рода Pseudomonas, получена специфичная реакция в виде экспоненциальной кривой флуоресценции по каналу FAM только для ДНК штаммов Pc (рис. 3).
Уровень флуоресценции для ДНК штаммов Pc составил от 1200 до 1600 оптических единиц (рис. 3). Отмечена неспецифичная реакция по каналу FAM для четырех штаммов - P poae (VNIIKR-B-0231), P graminis (VNIIKR-B-0225) и двух штаммов P. fluorescens (VNIIKR-B-0260, VNIIKR-B-0263). Важно отметить, что значение порогового цикла находилось в диапазоне от 35 до 37 (рис. 3). Исходя из того, что при тестировании остальных штаммов Pseudomonas spp., включая P poae и P. graminis, реакция по каналу FAM не наблюдалась, можно сделать вывод о частичном сродстве используемых в тесте олигонуклеотидов с последовательностями генов некоторых бактерий рода Pseudomonas, выделенных из зерновых культур. Анализ доступных в базе данных NCBI геномов бактерий не позволяет окончательно подтвердить этот вывод. Отметим, что при идентификации штаммов в более ранней работе (Словарева и др., 2023) использовали праймеры PSF/PSR (Kazempour et al., 2009) длина ПЦР-продукта с которыми составляла около 600 п.о., и полученные с этими праймерами нуклеотидные последовательности сравнивали с другими последовательностями BLAST NCBI (BLAST..., https://blast.ncbi.nlm.nih. gov). Для штамма VNIIKR-B-0231 отмечено максимальное совпадение 99.49 % с P. poae, а другие виды с таким
Рисунок 2. Выравнивание нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов теста PscHrc662F/PscHrc751R с штаммами VNIIKR-B-0201, VNIIKR-B-0202, VNIIKR-B-0203 и геномной последовательности штамма Pseudomonas cichorii DSM 50259 (RefSeQ NZ_CP007039.1) Figure 2. Nucleotide sequences alignment of PscHrc662F/PscHrc751R PCR products with strains VNIIKR-B-0201, VNIIKR-B-0202, VNIIKR-B-0203 and the genomic sequence of the Pseudomonas cichorii strain
DSM 50259 (RefSeQ NZ_CP007039.1)
Рисунок 3. Зависимость уровня флуоресценции (ОЕФ) от номера порогового цикла (Ct) по каналу FAM при проведении теста PscF/PscHrc751R/PscP1 с ДНК бактерий рода Pseudomonas
Figure 3. Dependence of the fluorescence level (RFU) on the threshold cycle number (Ct) via the FAM channel when performing the PscF/PscHrc751R/PscP1 test with DNA of Pseudomonas bacteria
же высоким совпадением отсутствовали. Принадлежность штамма VNIIKR-B-0225 определена как P. graminis в связи с максимальным видовым сходством 98.17 %. Для штаммов VNIIKR-B-0260 и VNIIKR-B-0263 ближайшим видом являлся P. fluorescens (99.43 % для обоих штаммов). В то же время, результат выравнивания не показал совпадения с P. cichorii в числе первых 100 последовательностей с максимальным сходством. Следовательно, наличие перекрестных реакций при проведении ПЦР может являться результатом гомологии части олигонуклеотида с нуклео-тидными последовательностями генов некоторых штаммов Pseudomonas sp. Исходя из полученных данных, при тестировании бактериальных культур может быть получено до 4 % неспецифичных реакций с поздним (от 35 до 37) пороговым циклом.
В результате тестирования других бактерий рода Pseudomonas, включая P. fuscovaginae, P syringae (в том
числе патовары syringae, coronafaciens, atrofaciens, aptata), P. trivialis, P. viridiflava, P. chlororaphis, P. lutea, P. orientalis, а также отрицательных контролей, специфическая реакция отсутствовала.
Для каждого тестируемого образца отмечена реакция внутреннего положительного контроля, детектируемая по каналу HEX (рис. 3) и указывающая на отсутствие ингибирования ПЦР. Таким образом, Новый тест PscF/ PscHrc751R/PscP1 способен отличать штаммы Pc от других бактерий рода Pseudomonas.
В результате применения чашечного метода Коха, определены концентрации бактериальных суспензий Pc, используемых при оценке аналитической чувствительности нового теста ПЦР-РВ. Для подсчета использовали чашки Петри с высеянными суспензиями Pc 4-го, 5-го и 6-го разведений (рис. 4).
Рисунок 4. Чашки Петри с посевом на каждую по 50 мкл суспензий Pseudomonas cichorii Примечание: А - 4-е разведение, B - 5-е разведение, C - 6-е разведение; спустя 6 суток инкубирования
при температуре 27 °C, R2A Figure 4. Petri dishes each plated with 50 д1 of Pseudomonas cichorii suspensions Note: A - 4th dilution, B - 5th dilution, C - 6th dilution; after 6 days of incubation at 27 °C, R2A
Спустя 6 суток инкубирования при 27 °C суспензий Pc, высеянных на R2A (Reasoner, Geldreich, 1985), были отмечены глянцевые, беловатые, флуоресцирующие полупрозрачные колонии, круглой или неправильной формы, с плоским профилем и волнистым краем, диаметром от 1 до 9 мм (рис. 4). Подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) показал, что для 4-го, 5-го и 6-го разведений культуры Pc соответствуют значения 2.4*103, 2.8*102 и 2.0*10' КОЕ/мл соответственно (табл. 3).
Таблица 3. Число колониеобразующих единиц в 1 мл суспензии Pseudomonas cichorii
Table 3. Number of colony forming units in 1 ml
of Pseudomonas cichorii suspension
Разведение [Dilution] Среднее число КОЕ в 50 мкл [Average number of CFU in 50 ц1] КОЕ/мл [CFU/ml]
120 2.4*103
14 2.8*102
6 1 2.0*10'
Учитывая, что все суспензии являлись серией последовательных десятикратных разведений одной суспензии, то для 3-го, 2-го и 1-го разведений соответствуют значения 104, 105 и 106 КОЕ/мл соответственно, а начальной суспензии - 107 КОЕ/мл.
Оценка аналитической чувствительности теста PscF/ PscHrc751R/PscP1 с ДНК чистых культур показала, что тест способен обнаруживать Рс в анализируемом образце в концентрации более 2*10' КОЕ/мл (рис. 5).
Положительные реакции отмечены в результате ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 с ДНК суспензий Рс в концентрациях от 2*101 до 107 КОЕ/мл для каждого из повторов теста (рис. 5).
Рисунок 5. Результат теста PscF/PscHrc751R/PscP1 с ДНК, выделенной из бактериальных суспензий штамма Pseudomonas cichorii VNIIKR-B-0201 в концентрациях от 101 КОЕ/мл до 107 КОЕ/мл
Figure 5. The result of the PscF/PscHrc751R/PscP1 test with DNA isolated from bacterial suspensions of strain Pseudomonas cichorii VNIIKR-B-0201 in concentrations from 101 CFU/ml to 107 CFU/ml
Тестирование образцов ДНК, выделенных из проб семян, зараженных суспензиями Pc и прошедших пробопод-готовку, также показало аналитическую чувствительность теста 2*10' КОЕ/мл (табл. 4).
Таким образом, тест ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 может быть использован для идентификации Pc как среди бактериальных культур, так и в семенном материале пшеницы.
Таблица 4. Результат определения аналитической чувствительности теста PscF/PscHrc751R/PscP1
на ДНК Pseudomonas cichorii
Table 4. The result of determining the analytical sensitivity of the PscF/PscHrc751R/PscP1 test
using Pseudomonas cichorii DNA
Среднее значение Ct, FAM
КОЕ/мл [Average Ct, FAM]
[CFU/ml] Чистая бактериальная культура Бактериальная культура в аналитической пробе семян
[Pure bacterial culture] [Bacterial culture in analytical seed sample]
1*107 21.31 Не проводили
1*106 26.3 Не проводили
1*105 27.0 Не проводили
1*104 29.89 32.53
2.4*103 32.19 34.17
2.8*102 35.79 37.47
2.0*10! 36.67 39.12
В результате исследования разработана праймерная система для ПЦР в режиме «реального времени» PscF/ PscHrc751R/PscP1, направленная на идентификацию возбудителя стеблевого меланоза пшеницы Р. с^оги. Оценка аналитической чувствительности, проведенная с использованием референтных штаммов ДНК Р. сichoгii в воде и аналитической пробе семян пшеницы, показала способность теста к обнаружению патогена в анализируемом
образце при концентрации не менее 2*10* КОЕ/мл. Оценка аналитической специфичности теста, проведенная с использованием ДНК 104 близкородственных штаммов бактерий рода Pseudomonas, выделенных преимущественно из зерновых культур, показала наличие неспецифичных реакций (флуоресценция на 35-37 пороговом цикле, накопление не имеет экспоненциальный вид) с 4 штаммами: P. poae (VNIIKR-B-0231), P. graminis (VNIIKR-B-0225)
и P fluorescens (VNIIKR-B-0260, VNIIKR-B-0263). ПЦР-реакции с ДНК других бактерий рода Pseudomonas, включая P. fuscovaginae, P. syringae, P. trivialis, P. viridiflava, P. chlororaphis, P lutea и P. orientalis были отрицательными. ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1, в связи с высокой аналитической чувствительностью, может быть
использована в качестве отборочного теста в комплексе методов при идентификации Р. сichoгii в ходе установления фитосанитарного состояния растительной продукции и посевов, а также для идентификации патогена в чистых и смешанных бактериальных культурах.
Благодарности
Работа выполнена в рамках Государственного задания ФГБУ «ВНИИКР», регистрационный номер
ЕГИСУ НИОКТР 123022100104-4.
Библиографический
Мувинги М, Словарева ОЮ, Заргар М (2022) Идентификация Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae и Xanthomonas translucens в зерне пшеницы методом ПЦР. Вестник Российского университета дружбы народов, Серия: Агрономия и животноводство. 17(4): 473-483. https://doi.org/10.22363/2312-797X-2022-17-4-473-483 Словарева ОЮ (2023) Анализ производства и экспорта российского зерна и составление перечня регулируемых фитосанитарными требованиями стран-импортеров возбудителей бактериозов зерновых культур. Аграрный вестник Северного Кавказа. 3(51):47-54. doi:10.31279/2222-9345-2023-14-51-47-54 Словарева ОЮ, Мувинги М, Яремко АБ, Игонин ВН, Рубец ВС (2023) Выявление значимых для экспорта зерна возбудителей бактериозов и комплекса сопутствующих микроорганизмов в посевах зерновых культур (на примере Тимирязевской полевой опытной станции. Сельскохозяйственная биология. 58(1):184-199. https://doi. org/10.15389/agrobiology.2023.1.184rus Тешич С, Пакина ЕН, Игнатов АН (2021) Идентификация Pseudomonas cichorii (Swingle 1925) Stapp 1928 в гидропонном производстве салата. Овощи России. 3:110115. https://doi.org/10.18619/2072-9146-2021-3-110-115 Alippi AM (1996) First report of bacterial spot of celery caused by Pseudomonas cichorii in Argentina. Plant Dis 80(5):599. https://doi.org/10.1094/PD-80-0599C Amadi JE, Omoniyi AM, Eze CS (2009) Isolation and identification of a bacterial blotch organism from watermelon (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum and Nakai). Afr J Agric Res 4(11):37-39. Bastas KK (2013) Vegetable bacterial diseases in Turkey. Eur
J Plant Pathol Sci Biotechnol 1S:14-24 BLAST. Basic Local Alignment Search Tool [Electronic resource]. - Access mode: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov (date of access: 2020-2022). Cambra MA, Palacio-Bielsa A, López MM (2004) Borage (Borago officinalis) is a new host of Pseudomonas cichorii in the Ebro Valley of Spain. Plant Dis 88(7):769-769. https://doi.org/10.1094/PDIS.2004.88.7.769A Chase AR (1986) Comparison of three bacterial leaf spots of
Hibiscus rosa-sinensis. Plant Dis 70(4):334-336 Cottyn B, Baeyen S, Pauwelyn E, Verbaendert I, De Vos P, Bleyaert P, Höfte M, Maes M (2010) Development of a realtime PCR assay for Pseudomonas cichorii, the causal agent of midrib rot in greenhouse-grown lettuce, and its detection
список (References)
in irrigating water. Plant Pathol 3(60):453-461. https://doi. org/10.1111/j.1365-3059.2010.02388.x Cottyn B, Heylen K, Heyrman J, Vanhouteghem K, Pauwelyn E, Bleyaert P, Van Vaerenbergh J, Höfte M, De Vos P, Maes M (2009) Pseudomonas cichorii as the causal agent of midrib rot, an emerging disease of greenhouse-grown butterhead lettuce in Flanders. Syst Appl Microbiol 32(3):211-225. https://doi.org/10.1016/j.syapm.2008.11.006 Elsisi AA (2019) Bacterial blight disease caused by Pseudomonas cichorii on chrysanthemum in Egypt. J Phytopathol Pest Manag 6(1):11-23 Garibaldi A, Gilardi G, Moretti C, Gullino ML (2009) First Report of Leaf Spot Caused by Pseudomonas cichorii on Coreopsis lanceolata in Italy. Plant Dis 93(9):967. https:// doi.org/10.1094/PDIS-93-9-0967A Gill WM (1994) «Drippy gill»: An ooze disease of the cultivated mushroom Agaricus bisporus caused by Pseudomonas agarici. University of Canterbury. 234 Grogan RG, Misaghi IJ, Kimble KA, Greathead AS, Ririe D, Bardin R (1977) Varnish spot, destructive disease of lettuce in California caused by Pseudomonas cichorii. Phytopathology 67(8):957-960. Gumtow RL, Aftab K, Bocsanczy AM, Yuen JMF, Palmateer AJ, Norman DJ (2013) First report of a leaf spot disease of golden dewdrop (Duranta erecta) caused by Pseudomonas cichorii and a Xanthomonas species in Florida. Plant Dis 97(6):836-836. https://doi.org/10.1094/ pdis-12-12-1117-pdn Hikichi Y, Saito A, Suzuki K (1996) Relationship between population dynamics of Pseudomonas cichorii on lettuce and disease incidence of bacterial rot of lettuce. Jap J Phytopathol 62(2):141-146 Hikichi Y, Wali UM, Ohnishi K, Kiba A (2013) Mechanism of disease development caused by a multihost plant bacterium, Pseudomonas cichorii, and its virulence diversity. J Gen Plant Pathol 79(6):379-389. https://doi.org/10.1007/ s10327-013-0461-7 Jang YW, Yoon YN, Maharjan R, Yi HJ, Jung MH, Hong SY, Lee MH, Kim SW, Kim JI, Yang JW (2023) First Report of Pseudomonas cichorii causing bacterial vein necrosis on perilla plants in South Korea. Plant Dis 107(2):549. https:// doi.org/10.1094/PDIS-01-22-0143-PDN Janse JD (1987) Biology of Pseudomonas cichorii in chrysanthemum 1. EPPO Bull 17(3):321-333. https://doi. org/10.1111/j.1365-2338.1987.tb00045.x
Kazempour MN, Kheyrgoo M, Pedramfar H, Rahimian H (2009) Isolation and identification of bacterial glum blotch and leaf blight on wheat (Triticum aestivum L.) in Iran. Afr J Biotechnol 9(20):2860-2865 Malhi SS, Piening LJ, MacPherson DJ (1989) Effect of copper on stem melanosis and yield of wheat: Sources, rates and methods of application. Plant Soil 119:199-204. Marques E, Borges RCF, Uesugi CH (2016) Identification and pathogenicity of Pseudomonas cichorii associated with a bacterial blight of gerbera in the Federal District. Hortic Brasil 34(2):244-248. https://doi.org/10.1590/ S0102-053620160000200015 Miller JW, Knauss JF (1973) Bacterial blight of Gerbera jamesonii incited by Pseudomonas cichorii. Plant Dis Reporter 57(6):504-505 Miller WJ, Burgess SM, Lawson BO (1986) Leaf spot and blight of basil, Ocimum basilicum caused by pseudomonas cichorii. Florida State Hortic Soc Proc 99:249-251 Osdaghi E (2020) Pseudomonas cichorii (bacterial blight of
endive). 10.1079/ISC.44942.20210200740 Patel N, Patel R, Wyenandt CA, Kobayashi DY (2021) First Report of Pseudomonas cichorii Causing Bacterial Leaf Spot on Romaine Lettuce (Lactuca sativa var. longifolia) and Escarole (Cichorium endivia) in New Jersey. Plant Dis 105(12):4150. https://doi.org/10.1094/ PDIS-05-21-0929-PDN Pernezny K, Datnoff L, Sommerfeld ML (1994) Brown stem of celery caused by Pseudomonas cichorii. Plant Dis 78 (9):917-919
Piening LJ, MacPherson DJ (1985) Stem melanosis, a disease of spring wheat caused by Pseudomonas cichorii. Canadian J Plant Pathol 7(2):168-172. https://doi. org/10.1080/07060668509501496 Reasoner DJ, Geldreich EE (1985) A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol 49(1):1-7. https://doi.org/10.1128/ aem.49.1.1-7.1985 Rivera N, Amat Z, Hevesi M (1981) Capsicum leaf rot caused by Pseudomonas cichorii in Cuba. Agrotecn Cuba 13(2):67-72
Rodrigues Neto J, Pereira ALG, Zagatto AG (1976) Bacterial spot caused by Pseudomonas cichorii (Swingle) Stapp, 1928 on Chrysanthemum morifolium Ram leaves in Sao Paulo State. Biologico 42(5/6):118-122 Sharma DK, Arora P (2016) Seed-borne and post-harvest diseases of sponge gourd (Luffa Cylindrica (L.) Rox.) and their management. CIBTech J Microbiol 5(2):4-8 Sugiyama LS, Bushe BC, Heller WP, Keith LM (2018) First report of Pseudomonas cichorii causing bacterial leaf blight of Plumeria pudica in Hawaii. Plant Dis 102(5):1025-1025. https://doi.org/10.1094/PDIS-11-17-1771-PDN Surico G, Iacobellis NS (1978) Un marciume batterico del Sedano (Apium graveolens L.) causato da Pseudomonas marginalis (Brown) Stevens (A bacterial soft rot of Celery (Apium graveolens L.) caused by Pseudomonas marginalis (Brown) Stevens). Phytopathol Mediterr 17:69-71 Trantas EA, Sarris PF, Mpalantinaki E, Pentari MG, Ververidis FN, Goumas DE (2013) A new genomovar of Pseudomonas cichorii, a causal agent of tomato pith necrosis. E J Plant Pathol 137:477-493. https://doi.org/10.1007/ s10658-013-0258-8 Unipro UGENE software - [Electronic resource] access mode: https://ugene.net/ru/download-all.html (access date: 04/03/2023)
Van Outryve MF, Gossele F, Swings J (1989) The bacterial microflora of witloof chicory (Cichorium intybus L. var. foliosum Hegi) leaves. Microb Ecol 18:175-186. https://doi. org/10.1007/BF02030125 Wilkie JP, Dye DW (1974) Pseudomonas cichorii causing tomato and celery diseases in New Zealand. New Zealand J AgricRes 17(2):123-130. https://doi.org/10.1080/00288233 .1974.10420990 Wood BA, Easdown WJ (1990) A new bacterial disease of mung bean and cowpea for Australia. Australasian Plant Pathology. 19(1):16-21 Yu SM, Lee YH (2012) First report of Pseudomonas cichorii associated with leaf spot on soybean in South Korea. Plant Dis 96(1):142-142. https://doi.org/10.1094/PDIS-08-11-0653
Translation of Russian References
Muvingi M, Slovareva OY, Zargar M (2022) Identification of Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae and Xanthomonas translucens in wheat seeds using PCR. RUDN Journal of Agronomy and Animal Industries. 17(4):473-483. https://doi.org/10.22363/2312-797X-2022-17-4-473-483.
Slovareva OY, Muvingi M, Iaremko AB, Igonin VN, Rubets VS (2023) Detection of bacteriosis pathogens significant for grain export and a complex of associated microorganisms in grain crops (on the example of Timiryazevskaya field experimental station). Agricultural Biology. 58(1):184-199. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2023.L184rus.
Slovareva OY (2023) Production, export and import of cereals and compilation of a list of phytopathogenic bacteria associatedwiththem. Agrarian Bulletin oftheNorth Caucasus. 3(51):47-54. doi:10.31279/2222-9345-2023-14-51-47-54.
Tesic S, Pakina EN, Ignatov AN (2021) Identification of Pseudomonas cichorii (Swingle 1925) Stapp 1928 in hydroponic lettuce production. Vegetable crops of Russia. (3):110-115. https://doi. org/10.18619/2072-9146-2021-3-110-115.
Plant Protection News, 2024, 107(3), p. 121-129
OECD+WoS: 1.06+QU (Microbiology), 4.01+AH (Agriculture, Multidisciplinary)
https://doi.org/10.31993/2308-6459-2024-107-3-16657
Full-text article
IDENTIFICATION OF STEM MELANOSIS OF WHEAT (PSEUDOMONAS CICHORII)
BY REAL-TIME PCR E.V. Voronov1, O.Y. Slovareva1*, A.A. Desyaterik1,2, M.O. Kondratiev1, A.N. Ignatov3
1All-Russian Plant Quarantine Center" (FGBU "VNIIKR"), Bykovo, Russia 2Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy, Moscow, Russia 3Peoples'Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba, Moscow, Russia
*corresponding author, e-mail: [email protected]
The phytopathogenic bacterium, Pseudomonas cichorii, affects a wide range of crops in filed and greenhouse production and causes wheat stem melanosis, which has been regulated by importers of Russian grain products. It is crucial to update the identification method based on real-time polymerase chain reaction (PCR) (PCR-RT). This method helps confirming P cichorii in wheat samples. A 90 base pair long section of the hrcRST pathogenicity gene cluster was used as the target. Positive results were obtained for reference strains, confirmed by amplicon sequencing. Nucleotide sequences were then compared to the typical strain, DSM 50259. As a result of comparative DNA analysis, the sequences of the direct primer and probe were modified. The possibility of using a modification of 6FAM/BHQ1 dye/quencher available on the territory of the Russian Federation was demonstrated. The specificity of the new PCR-RT primer system PscF/PscHrc751R/PscP1 was assessed using 107 bacterial strains of the genus Pseudomonas, including P cichorii, P. fuscovaginae, P. syringae, P. trivialis, P. viridiflava, P. chlororaphis, P. lutea and P orientalis. The DNA of 4 strains (P poae, P graminis and 2 strains of P. fluorescens) showed a non-specific reaction at the 35-37 cycle threshold, with an accumulation that did not appear exponential. The analytical sensitivity of the test allows for the detection of P. cichorii at a concentration of 10A1 CFU/mL. The PCR-RV PscF/PscHrc751R/PscP1 test can be used as a screening tool for the detection of P. cichorii in plant products and for the characterization of pure bacterial cultures.
Keywords: RT-PCR, bacterioses of grain crops, phytosanitary requirements, plant quarantine, diagnosis of phytopathogens, molecular genetic identification methods
Submitted: 16.08.2024 Accepted: 01.11.2024
© Voronov E.V., Slovareva O.Y., Desyaterik A.A., Kondratiev M.O., Ignatov A.N., published by All-Russian Institute of Plant Protection (St. Petersburg). This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
