CC BY
72
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. - 2011. - Вип. 2, т. 1. - С. 114-119. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Medicine. - 2011. - Vol. 2, N 1. - P. 114-119.
УДK 619+616.98:579.842.11+631.147
Ю. С. Сухарев
Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина
ИДEHTИФИKAЦИЯ TEPМОСTAБИЛЬHОГО ЭHTEPОTОKСИHA ESCHERICHIA COLIПРИ KQIlllvAkTTPlKHK TEЛЯT
Разработана ИФА тест-система, с помощью которой идентифицирован термостабильный ST-энтеротоксин Escherichia coli в фекалиях телят на разных стадиях заболевания колибактериозом. Диапазон его титра на сверхострой стадии составил > 25О нг/мл, на острой стадии - > 5ОО нг/мл, а на подострой - > 1 ООО нг/мл. Регистрируемые титры энтеротоксина можно считать диагностическими.
Ю. С. Сухарєв
Харківський національний університет ім. В. Н. Каразіна
TДEHTИФTKAЦTЯ TEPМОСTAБIЛЬHОГО EHTEPОTОKСИHУ ESCHERICHIA COLI ПРИ K0IffiAKTEPT03T TEЛЯT
Розроблено М>А тест-систему, за допомогою якої ідентифіковано термостабільний ST-енте-ротоксин Escherichia coli у фекаліях телят на різних стадіях захворювання колібактеріозом. Д іапазон його титру на надгострій стадії склав > 25О нг/мл, на гострій стадії - > 5ОО нг/мл, а на підгострій -> 1 ООО нг/мл. Реєстровані титри ентеротоксину можна вважати діагностичними.
Y. S. Sukharev
V. N. Karazin Kharkiv National University
IDENTIFICATION OF THE THERMOSTABLE ENTEROTOXIN OF ESCHERICHIA COLI IN CALVES WITH COLIBACTERIOSIS
IFA test-sistem is developed for identification of the heat stable (ST) enterotoxin of Escherichia coli in the calves faeces at different stages of colibacteriosis. The range of its titre makes > 25О ng/ml at the hyperacute stage, at the acute stage - > 5ОО ng/ml, and at the subacute one - > 1 ООО ng/ml. The registered enterotoxin titres can be considered as the diagnostic indices.
Введение
Несмотря на широкое использование самых современных антибиотиков и биопрепаратов, колибактериоз, который вызывают токсигенные Escherichia coli, занимает лидирующее положение по количеству случаев заболеваемости и смертности среди других инфекционных патологий у сельскохозяйственных животных [5; 7; 11].
Основная группа факторов, определяющих развитие диарейного синдрома при колибактериозе, включает энтеротоксины: термостабильный (ST) и термолабильный (LT), которые путем активизации аденилат- и гуанилатциклазы нарушают транспорт электролитов и воды через мембраны клеток кишечного эпителия. В результате этого данные вещества переходят в просвет тонкого кишечника, что приводит к развитию водянистой диареи и дегидратации организма [13; 14]. Колибактериоз проявляется
© Ю. С. Сухарев, 2011 114
главным образом в первые три дня жизни телят. Иногда они заболевают сразу после рождения, еще до приема молозива, и в течение 12-48 часов болезнь оканчивается летальным исходом [12].
Имеющаяся современная классификация колибактериоза основана на учете времени течения болезни. В связи с этим по клиническим проявлениям различают сверх-острую, острую и подострую формы [2; 6].
Сверхострое течение болезни встречается в основном у телят первых 3-5 дней жизни и характеризуется диареей высокой интенсивности. Истощенные животные погибают в глубоком коматозном состоянии.
Остро болезнь протекает у телят в возрасте 3-7 дней. Болезнь длится несколько суток и заканчивается летальным исходом.
Если животное перенесло острый приступ болезни, наступает постепенное выздоровление. Заболевание переходит в подострое. Подострая форма бывает также при заболевании телят в возрасте 6-10 дней и является следствием затяжного острого течения болезни.
Применяющиеся в настоящее время фенотипические методы определения ток-сигенности E. coli с технической точки зрения сложны и часто недостаточно чувствительны. Более того, они занимают не менее 18-24 часов после выделения колоний кишечной палочки до получения окончательного результата. Это обстоятельство не удовлетворяет ни клиницистов, ни эпидемиологов [3].
Известные методы определения энтеротоксигенных E. coli с помощью ИФА дают возможность идентифицировать только LT-энтеротоксин E. coli в исследуемых образцах [4]. Отсутствие иммуногенных свойств у ST-энтеротоксина не позволяет получить специфические антитела и сконструировать ИФА тест-систему для его обнаружения. На основе собственных исследований и данных литературы установлено, что эн-теротоксигенные E. coli - возбудители колибактериоза новорожденных телят синтезируют чаще термостабильный ST-энтеротоксин [1; 8].
В связи с этим поставлена цель: определить с помощью ИФА [9] наличие ST-энтеротоксина E. coli и его титр в фекалиях телят при сверхостром, остром и подост-ром течении болезни. Новизна разработанного метода ИФА заключалась в том, что определение энтеротоксинов в фекалиях телят на разных стадиях заболевания коли-бактериозом осуществляли с помощью антител к конъюгату энтеротоксинов [10], обладающих аффинностью как к LT, так и к ST-энтеротоксинам E. coli.
Материал и методы исследований
В состав разработанной ИФА тест-системы входили следующие компоненты: полистироловый 96-луночный планшет; кроличьи поликлональные биспецифические антитела к конъюгату энтеротоксинов E. coli; калибровочный материал - лиофилизи-рованный ST-энтеротоксин; конъюгат мышиных антикроличьих антител с пероксида-зой хрена, полученный перийодатным методом Nakane и Kawaoi; фосфатно-солевой буфер с рН 7,2-7,4; карбонатный буфер с рН 9,6; цитратный буфер; твин-20 (детергент); индикаторная субстратная смесь: кислота лимонная, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, ортофенилендиамин, перекись водовода; серная кислота.
У телят с клиническим проявлением сверхострой, острой и подострой формой колибактериоза брали пробы фекалий в количестве 10 г в стерильную посуду стерильным инструментом. При этом срок доставки материала в лабораторию с момента его забора не превышал 2 часов. При невозможности доставки материала в указанный срок его хранили в холодильнике при 4 °С не более 6 часов. Фекалии центрифугировали
при 2 000-3 000 об./мин. в течение получаса, осадок отбрасывали, а супернатант собирали в отдельные пробирки и использовали для ИФА.
Чувствительность тест-системы вычисляли по формуле Р. А. Тигранян:
где оп - среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного
контроля; пп - значение оптической плотности каждого измерения для отрицатель-
ии 0
ного контроля; п - число измерений.
В основу разработанного метода определения энтеротоксинов E. colt положен метод двойных антител (“сэндвич-ИФА”). Этот тест представляет собой метод неконкурентного твердофазного ИФА для индикации энтеротоксинов E. colt, в котором твердая фаза покрыта высокоавидными биспецифическими антитоксинами. Амплификация достигалась с использованием технологии полимерной конъюгации, в результате чего происходила фиксация, при которой на каждый связанный участок антигена приходился полимерный комплекс с высокомолекулярным фрагментом (рис. 1).
Рис. 1. Схема “сэндвич-ИФА” (метод двойных антител):
1 - АТ, связанные с твердой фазой; 2 - инкубация с пробой, содержащей энтеротоксины;
3 - инкубация с субстратом и измерение количества продукта реакции
Сенсибилизацию 96-луночного полистиролового планшета проводили внесением в каждую лунку G,1 мл кроличьих специфических антитоксических антител к ST-энтеротоксину E. colt. Планшет накрывали крышкой и помещали на три часа в термостат при +37 °С. Извлекали содержимое лунок вытряхиванием, промывали дважды раствором фосфатного буфера с твином^, pH 7,3 и четыре раза - раствором фосфатно-солевого буфера, но без твина.
Готовили S двойных разведений ST в фосфатно-солевом буфере так, чтобы получить интервал концентраций от 1 GGG до G,GS нг/мл. Лунки A1-H1 полистиролового планшета использовали в качестве контроля, внося в них все компоненты, кроме стандартов ST-энтеротоксина. Анализируемые образцы фекалий вносили по G,1 мл в две
Результаты и их обсуждение
з
лунки планшета и инкубировали 30 минут при +37 °С, затем промывали карбонатным буферным раствором с рН 9,6.
Во все лунки планшета добавляли по 0,1 мл раствора, содержащего конъюгат мышиных антикроличьих антител с периксидазой хрена. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при +37 °С и промывали дважды раствором фосфатно-солевого буфера с рН 7,3, который содержал твин-20, и четыре раза - раствором того же буфера, но без твина.
В лунки вносили по 0,1 мл раствора, содержащего индикаторную субстратную смесь, и инкубировали в течение 15-20 минут при +20 °С. Визуально позитивные пробы окрашивались в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству 8Т-энтеротоксина в исследуемых образцах. Для остановки реакции использовали 0,1 мл раствора серной кислоты (2 моль/л), который добавляли во все лунки планшета.
Учет результатов проводили инструментально на регистрирующем спектрофотометре «Мультискан» при 492 нм. При этом определяли содержание энтеротоксинов в пробах, которое соответствовало конечному разведению стандарта токсина в лунках, где оптическая плотность пробы и стандарта в два раза превышала поглощение в контроле, но при значениях оптической плотности не менее чем 0,1. Концентрацию энтеротоксина в исследуемых образцах определяли по значению оптической плотности лунки, в которую вносился образец.
Калибровочную кривую зависимости оптической плотности от средней концентрации энтеротоксина (в двух лунках) строили в системе координат, где в выбранном масштабе по оси ординат откладывали полученные значения единиц оптической плотности (ЕОП), а по оси абсцисс - соответствующие значения концентрации энтеротоксина (рис. 2).
Концентрация энтеротоксинов Е.соЧ (нг)
Рис. 2. Калибровочная кривая для определения концентрации энтеротоксинов E. coli
На разных стадиях заболевания колибактериозом в фекалиях телят обнаруживаются энтеротоксины E. coli (табл. 1). Специфичность ИФА тест-системы (способность определять только то вещество, для определения которого эта система разработана) подтверждена путем постановки ИФА с бесклеточным супернатантом P. vulgaris и стерильной средой культивирования токсигенных штаммов E. coli (табл. 2).
Таблица 1
Титр ST-энтеротоксина (нг/мл) в фекалиях новорожденных телят при сверхостром, остром и подостром течении колибактериоза, определяемый ИФА тест-системой
Исследуемый материал Стадия заболевания Титр ST, нг/мл
Фекалии подострая > 1000
острая > 500
сверхострая > 250
Таблица 2
Оптическая плотность (ЕОП) бесклеточного супернатанта P.vulgaris и стерильной среды культивирования токсигенных штаммов E.coli при 492 нм
Исследуемый материал Результат реакции ЕОП (492 нм), Х ± s, n = 4
Культуральный фильтрат P. vulgaris - 0,055 ± 0,001
Стерильная среда культивирования E. coli - 0,070 ± 0,001
Положительный контроль (ST - 125 нг) + 1,43 ± 0,01
Примечания: «-» - отрицательная реакция, «+» - положительная реакция.
Для штаммов E. coli, синтезирующих энтеротоксины, чувствительность разработанной тест-системы составила ~ 6 нг/мл.
Выводы
Разработана ИФА тест-система, с помощью которой идентифицирован термостабильный ST-энтеротоксин Escherichia coli в фекалиях телят, находящихся на разных стадиях заболевания колибактериозом. При определении стадии заболевания регистрируемые в ИФА титры энтеротоксинов E. coli можно считать диагностическими.
Индикация энтеротоксинов E. coli с помощью твердофазного ИФА является экономным и в то же время достаточно специфичным и чувствительным методом в рутинной диагностике колибактериоза. В связи с этим ИФА может применяться для получения окончательного результата определения токсигенности штаммов E. coli в течение рабочего дня. Преимуществом разработанного теста является отсутствие ложноположительных результатов, обусловленных межвидовой перекрестной реакцией ST и LT-энтеротоксинов, отсутствие инфицированного антигенного материала, химически точная структура антигена, а также пригодность для использования на автоматических системах для ИФА.
Библиографические ссылки
1. Вертиев Ю. В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение // Журн. микробиол. - 1996. - № 3. - С. 43-46.
2. Захаров П. Г. Профилактика и лечение болезней новорожденных телят // Зооиндустрия. -2001. - № 3. - С. 21-25.
3. Иванов А. С. Современные подходы к микробиологической диагностике и терапии инфекционных диарей // Болезни органов пищеварения. - 2004. - № 2. - С. 15-17.
4. Иммуноферментная тест-система для определения термолабильного энтеротоксина эшери-хий / А. П. Алексанкин, К. Ш. Матевосян, О. С. Белоновская, С. Н. Серебряков // Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии. - М. : ФГОУ ВПО МГ АВМиБ им К. И. Скрябина, 2004-2005. - С. 53-56.
5. Кашин А. С. Колибактериоз телят в современных экологических условиях Сибири (Особенности эпизоотологии, клин. проявления, патогенез, диагностика, меры профилактики и борьбы). Метод. рекомендации / А. С. Кашин, М. И. Заздравных, Н. А. Шкиль. - Барнаул: Азбука, 2003. - 79 с.
6. Малов В. А. Острые инфекционные диарейные заболевания / В. А. Малов, А. Н. Горобченко // Лечащий врач. - 2GG5. - № 2. - С. 6-S.
7. Олійник Л. В. Розповсюдження ешерихій та оцінка їх патогенного потенціалу // Ветеринарна медицина. - Х., 2GG4. - № S3. - С. 167-17G.
S. Сухарев Ю. С. Визначення термостабільного (ST) ентеротоксину E. colt методом твердофазного імуноферментного аналізу // Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології. Наук.-практ. конф. з міжнар. участю (22-25 травня 2GG7 р., АР Крим, м. Феодосія) // Ветеринарна медицина. - Х., 2GG7. - Т. SS. - С. 251-255.
9. Сухарєв Ю. С. Спосіб виготовлення гіперімунної антитоксичної сироватки крові до кон’югату термостабільного і термолабільного ентеротоксинів E. colt. Пат. 3G12S Україна, А61К 39/1GS. Заявл. G6.11.2GG7; опубл.11.G2.2GGS. Бюл. № 3. - С. 3.
1G. Сухарев Ю. С. Энтеротоксины Eschertchta colt (методы получения, очистки, изготовление иммунизирующих препаратов, антитоксических сывороток и диагностических тест-систем на их основе). - Х. : Коллегиум, 2GG9. - 92 с.
11. Шахов А. Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят // Ветеринарный консультант. - 2GG3. - № 1. - С. 4-5.
12. Шпонько Ю. Б. Этиологические факторы, профилактика и терапия диарей телят и поросят в Краснодарском крае: Автореф. дисс. ... канд. вет. наук: 16.GG.G1, 16.GG.G3. - Воронеж, 2GG7. -С. 12-13.
13. Prevalence of toxin types and colonization factors in enterotoxigenic Eschertchta colt isolated during a 2-year period from diarrheal patients in Bangladesh / F. Qadri, S. Kumar Das, A. S. G. Faruque et al. // J. Clin. Microbiol. - 2GGG. - Vol. 3S, N 1. - P. 27-31.
14. Thielman N. M. Acute infectious diarrhea / N. M. Thielman, R. L. Guerrant // N. Engl. J. Med. -2GG4. - Vol. 35G (1). - P. 3S-47.
Надійшла до редколегії 17.01.2011
