CC BY
3450
Тематический номер «Ветеринария»
www.agroyug.ru
DOI: 10.24411/9999-007A-2019-10025 УДК 579.62: 579.253.4
Терлецкии В.П. ВНИВИП,ГАОУ ВО ЛО ЛГУ им. А.С. Пушкина,доктор биологических наук,профессор.
4« п.. ■ -1
-м . f■''' ■
цыщ ьмс ОдрУДНЦКЭианДиДж'Г ^
Новикова О.Б. ВНИВИП, заведующая отделом, кандидат биологических наук, [email protected]
Гаплаев М.Ш.ФГБНУ ЧНИИСХ, директор, доктор сельскохозяйственных наук, [email protected]
идентификация патогенных бактериальных штаммов золотистого стафилококка в современной профилактической ветеринарии
Аннотация. Золотистый стафилококк является опасным патогеном, способным вызвать самые различные заболевания у животных и человека. В настоящее время появилось множество антибиотикорезистент-ных штаммов этого возбудителя. Быстрая идентификация на штаммовом уровне позволяет эффективнее проводить лечебные и профилактические мероприятия.
Ключевые слова: бактерия, золотистый стафилококк, генотипирование, молекулярная эпизоотология.
Введение. Вспышки инфекционных заболеваний до сих пор представляют серьёзную угрозу здоровью животных [1]. Несмотря на появление на рынке новых высокоэффективных вакцин, в ряде случаев полностью искоренить инфекционные заболевания не удается. Более того, бесконтрольное использование в сельском хозяйстве и медицине антибиотиков привело к широкому распространению антибиоти-корезистентных штаммов, в частности, золотистого стафилококка (S.aureus). Последний является причиной тяжелых патологических состояний, вызывая поражения кожи и внутренних органов у многих видов млекопитающих и птиц. Например, S. аureus является одним из основных возбудителей мастита у коров, микроорганизм выделяется более чем у 75% больных коров [2]. Таким образом, данный возбудитель приобрел печальную известность как этиологический агент многих трудноизлечимых заболеваний. В последние годы отдельные штаммы стафилококка стали резистентными одновременно к целому ряду используемых в лечении антибиотиков [3].
Annotation. Staphylococcus aureus is a dangerous pathogen that can cause diverse diseases in animals and humans. Currently, there are many antibiotic-resistant strains of this pathogen. Rapid identification at the strain level makes it possible to effectively carry out therapeutic and preventive measures.
Keywords: bacteria, Staphylococcus aureus, genotyping, molecular epizootology.
В этой связи быстрые методы идентификации бактериальных штаммов приобрели особую актуальность. Сравнение генетических профилей бактерий позволяет отличить эпидемические штаммы (все изо-ляты будут идентичными) от спорадических вспышек инфекции (изоляты отличаются). Этим же путем можно выявить пути передачи возбудителя, идентифицировать источник инфекции, что при планировании ветеринарно-санитарных мероприятий позволяет прервать эпизоотическую цепь и, таким образом, не допустить распространения заболевания. Важно также найти резистентные штаммы, чтобы подобрать эффективные антимикробные препараты.
Ранее нами была разработана методика геноти-пирования бактерий, основанная на двойном расщеплении и избирательном мечении фрагментов ДНК (ДРИМ). Методика была апробирована на большом количестве изолятов псевдомонад [4] в сравнении с методом пульс-гель электрофореза.
В настоящее время метод (ПГЭ) является «золотым стандартом» генотипирования в медицине для многих видов патогенов. Метод ПГЭ сравнивали
ЭФФЕКТИВНОЕ № 2 март
животноводство 2019
с ДРИМ, и оказалось, что последний не уступает ПГЭ по индексу дискриминации в отношении патогенных псевдомонад, но значительно быстрее и не требует дорогостоящего оборудования [1]. В рамках нашего исследования была поставлена задача сравнить ДРИМ и ПГЭ на двух группах изо-лятов золотистого стафилококка.
Методика
Золотистый стафилококк выращивали на дифференциально-диагностических средах, рассевали до получения отдельных колоний на чашках Петри с агаризованной средой (Рис. 1). В отдельных случаях проводили микроскопирова-ние бактерий (Рис. 2). Отдельные колонии использовали для выращивания бактерий в жидкой среде (мясо-пептонный бульон) для последующего выделения геномной ДНК (Рис. 3).
В этом исследовании использовались два набора изолятов S. aureus. Первый набор включал 15 изолятов метициллинрезистент-ного золотистого стафилококка (MRSA), собранных в диагностической лаборатории Института микробиологии и инфекционных болезней Школы ветеринарной медицины (Ганновер, Германия) от домашних животных, поступивших в ветеринарную больницу для стационарного лечения [5]. Другой набор включал 62 изолята, полученные из образцов молока молочных коров, содержащихся в различных стадах южной Бразилии и страдающих от субклинического мастита.
Стафилококковую хромосомную ДНК экстрагировали из 1 мл ночных культур в жидкой куль-туральной среде. Бактериальный лизис осуществляли с помощью лизостафина и додецилсульфата натрия (SDS). Выделение ДнК основывалось на одном цикле обычной экстракции фенол-хлороформом с последующим осаждением изопропанолом.
Основная концепция ДРИМ заключается в том, что крупные ма-крорестрикционные фрагменты, которые продуцируются рестрик-тазой Cfr9I (изошизомер Smal, который используется для типирова-ния стафилококков в ПГЭ), могут быть уменьшены в размере путем одновременного расщепления вторым рестриктазой — Haell, чтобы получить большое количество более мелких фрагментов, которые можно быстро отделить на обычном агарозном геле. Продукт этой реакции расщепления/ мечения представляет собой характерный набор меченых фрагментов, пригодных для быстрого
электрофоретического разделения и выявления. В результате образуется своеобразный «штрих-код», который идентифицирует каждый бактериальный штамм и является ключом к быстрому эпидемиологическому анализу.
Одновременное расщепление и мечение бактериальной геномной ДНК (0,5-1 мкг) проводили с 5 единицами Cfr9I, 5 единицами Haell, 0,2 единицы Taq-полимера-зы и 0,2 мкМ биотинилированного dCTP (Bio-dCTP) в одной пробирке и буфере TangoTM. Реакционный объем доводят до 20 мкл дистиллированной водой. Время реакции составляло 60 мин, а температура инкубации составляла 37 °C.
Электрофоретические условия были следующими: 1xTAE, 20 см 0,8% агарозный гель, напряжение 5 В / см. Обычный «подводный» электрофорез в агарозном геле требовал приблизительно 3 часа для удовлетворительного разделения фрагментов ДНК по размеру.
После завершения электрофореза отделенные фрагменты непосредственно переносили на нейтральную нейлоновую мембрану. Перенос осуществляли в деони-зированной воде с использованием вакуумного блоттера в течение 30 минут для последующей визуализации в цветной химической реакции.
Результаты и обсуждение
Типичный результат генотипиро-вания группы изолятов золотистого стафилококка приведен на рисунке ДРИМ-анализ проведенный на 62 изолятах S. aureus с помощью ферментов Cfr9l/Haell, выявил 38 различных бактериальных генотипов, с количеством фрагментов ДНК в диапазоне от 40 до 50 и имеющих размер приблизительно от 500 до 15 000 пар нуклеотидов.
Для сравнения, ПГЭ-типиро-вание этих же изолятов привело к выявлению 33 генотипов, состоящим из 9-14 фрагментов в диапазоне размеров от 50 до 550 до тысяч пар нуклеотидов. 38 ДРИМ генотипов состояли из 28 уникальных генотипов, и десяти кластеров (два или более изолятов с идентичным набором фрагментов ДНК). Типи-рование ПГЭ, выполненное на 66 изолятах (те же 62 изолята плюс четыре дополнительных изолята), привело к детекции 21 уникального генотипа и 12 кластерам. Большой ПГЭ кластер, представляющий собой десять изолятов, делились при ДРИМ генотипировании еще на 6 групп: пять уникальных изолятов и одна группа из пяти идентичных штаммов. Значительное число изолятов были уникальными как при ПГЭ генотипировании, так и при ДРИМ генотипировании. Ин-
Рис. 1.
Стафилококки золотистый, белый и лимонно-жёлтый в воздухе птичника — Staphyloccous aureus, Staphylococus citreus, Staphylococcus epidermidis.
Рис. 2.
Золотистый стафилококк под микроскопом.
Рис. 3.
Рост золотистого стафилококка на мясопептонном бульоне МПБ с косичкой.
52
Тематический номер «Ветеринария»
www.agroyug.ru
г j ^ ) t ( я i к и ii u и it и
Рис. 4.
Генотипирование16 изолятов золотистого стафилококка методом ДРИМ (изоляты выделенные от кур: дорожки 1-8, изоляты, выделенные от индеек: дорожки 9-16). М — маркер молекулярных размеров фрагментов ДНК.
Таблица 1.
Сравнение ПГЭ и ДРИМ при генотипировании изолятов золотистого стафилококка
Номер штамма ПГЭ генотипы ДРИМ генотипы
04-3095 A1 A1
04-3097 A2 A2
04-3098 A1 A1
04-3099 A1 A3
04-3100 B2 B
04-3101 A2 A4
04-3103 A1 A3
04-3104 B1 A1
04-3105 A1 A1
04-3106 A1 A1
04-3108 A1 A1
04-3109 B1 A1
04-3110 A1 A1
04-3111 B1 A1
04-3112 A1 A1
декс дискриминации,основанный на индексе разнообразия Симпсона (http://insilico.ehu.es/DDSL), рассчитанном по всем изолятам в исследовании обоими методами,составил 0,96.
Дальнейшая оценка типирова-ния ДРИМ в сравнении с ПГЭ была проведена с использованием набора из 15 изолятов S. aureus, полученных от домашних животных (Таблица 1). В предыдущей работе [5] эти изоляты характеризова-
лись методом ПГЭ, при этом были определены два основных кластера (А и В) и четыре генотипа (А1 — А2 и В1 — В2).
Применение ДРИМ-типирования также выявило две группы (А и В) и пять генотипов (А1-С4 и уникальный изолят В). Четыре изо-лята, принадлежащие паттернам А1 и А2 PFGE (04-3098, 04-3099 и 04-3097, 04-3101 соответственно), были дополнительно разделены с помощью ДРИМ на генотипы А1, А3 и А2, А4, соответственно. Интересно, что ДРИМ-генотипи-рование, несмотря на более высокую дискриминационную способность, не различало ПГЭ генотипы разных кластеров А1 и В1 (изоляты 04-3104 и 04-3105).
Одним из объяснений различий между этими двумя методами иден-тификациии бактериальных штаммов является то, что они не затрагивают одинаковые участки генома, соответственно, генетические изменения выявляются не одинаково. В этом смысле их можно рассматривать как дополнительные, а не конкурирующие методы.
ЛИТЕРАТУРА
Скрининг большего количества полос и, следовательно, большего количества нуклеотидных последовательностей может приводить к повышению разрешающей способности метода. В настоящем исследовании ДРИМ-типирование основывалось на 40-50 фрагментах, в отличие от 9-14 фрагментов, полученных методом ПГЭ.
Заключение. Методика гено-типирования ДРИМ, ранее разработанная для псевдомонад, может успешно использоваться и в отношении патогенных штаммов золотистого стафилококка, имеющих ветеринарное значение. Сравнение генетических профилей штаммов позволяет выявить пути передачи возбудителя и найти источник инфекции.
Исследование выполнено при поддержке Государственного задания номер 160 «Усовершенствовать и разработать современные методы диагностики и создать новые препараты для контроля и профилактики болезней птиц бактериальной этиологии».
1. Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б., Борисенкова А.Н., Белаш Д.Э., Яковлев А.Ф. Эффективный молекулярно-генетический метод идентификации штаммов сальмонелл и протея // Доклады РАСХН. - 2013. - № 5. - С. 60-63.
2. Комаров В.Ю., Белкин Б.Л. Заболеваемость коров маститом и применение нового эффективного препарата для лечения его субклинической формы // Известия Оренбургского государственного аграрного университета . - 2015. - Т 3 (53). - С. 100-102.
3. Zhang L., Gao J., Barkema H.W., Ali T., Liu G., Deng Y., Naushad S., Kastelic J.P., Han B. Virulence gene profiles: alpha-hemolysin and clonal diversity in Staphylococcus aureus isolates from bovine clinical mastitis in China // BMC Vet. Res. - 2018. - Vol. 14. - No 1. - P. 63 doi: 10.1186/s12917-018-1374-7.
4. Terletskiy, V., G. Kuhn, P. Francioli, and D.S. Blanc. Application and evaluation of double digest selective label (DDSL) typing technique for Pseudomonas aeruginosa hospital isolates // J. Microbiol. Methods. - 2008. - Vol. 72. - P. 283-287.
5. Strommenger B., Kehrenberg C., Kettlitz C., Cuny C. Molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from pet animals and their relationship to human isolates // J. Antimicrob. Chemother. - 2006. - V. 57. - P. 461-465.
КАРБОСИЛ-Д
УНИВЕРСАЛЕН. КАК САМА ПРИРОДА
000 научно-производственная Левый
«ГЕОС»
i 11 СП in лиги и I
...... ........... П
ЛИ IIIJ ib.HHIMLll>
□■09 tBI, Б*ЛГ0фЗДС1*1 O&AtCIV, шч
г. Губкин, ул. Мирэ. Д. 20, оО. 301 (Дт
[«7341) +7 1ЭМ> W-B4S?
Е-mail: [email protected] ПрйДОСЦНЛ С*рГйфпирир£А*НД
