Идентификация микроорганизмов на основе эффекта гигантского рамановского рассеяния Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

М.Т.Александров1,2, В.И.Кукушкин3, О.А.Амбарцумян1, Е.П.Пашков1, Е.В.Буданова1, В.М.Зуев1,2, А.С.Калиничук2, Т.А.Хомерики1, А.А.Лабазанов1

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ОСНОВЕ ЭФФЕКТА ГИГАНТСКОГО РАМАНОВСКОГО РАССЕЯНИЯ

1Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова; 2НКЦ реабилитации женского здоровья; 3Институт физики твердого тела, Москва

Цель. Разработка и оценка экспресс-диагностики микроорганизмов для уменьшения времени, затрачиваемого на проведение исследования. Материалы и методы. Для идентификации и индикации микроорганизмов использован эффект гигантского рамановского рассеяния и предложенные подложки с металлическими нано-шариками серебра. В качестве объектов исследованы Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Candida albicans, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa. Все микроорганизмы выращивали на плотных питательных средах и нефлюоресцирующих микробиологических мембранных фильтрах. Результаты. Метод гигантского рамановского рассеяния на использованных подложках повышает чувствительность индикации и специфичность идентификации микробов по сравнению с другими существующими экспресс-методами и дает возможность увидеть сигнал с одиночной бактерии при облучении ее лазерным светом. Предложенная методика также использована для определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам. Заключение. Предложенные аппаратура и метод могут быть использованы в качестве экспресс-диагностики процессов микробной природы.

Журн. микробиол, 2013, № 5, С. 97—100

Ключевые слова: гигантское романовское рассеяние, экспресс-диагностика

M.T.Aleksandrov1,2, V.I.Kukushkin3, O.A.Ambartsumyan1, E.P.Pashkov1, E.V.Budanova1, V.M.Zyev1,2, A.S.Kalinichyuk2, T.A.Khomeriki1, A.A.Labazanov1

IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS BASED ON THE EFFECT OF GIANT RAMAN SCATTERING

1Sechenov First Moscow State Medical University; 2Scientific-Clinical Centre of Rehabilitation of Women's Health; 3Institute of Solid State Physics, Moscow, Russia

Aim. Development and evaluation of express diagnostics of microorganisms for reduction of time spent on study execution. Materials and methods. Giant Raman scattering effect and proposed substrate with metallic nano-balls of silver were used for identification and indication of microorganisms. Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Candida albicans, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa were used as objects of study. All the microorganisms were cultivated in dense nutrient media and non-fluorescent microbiological membrane filters. Results. Giant Raman scattering method on the substrates used increases sensitivity of indication and specificity of identification of microbes compared with other existing express methods and allows to see the signal from a single bacterium when exposed to laser light. The methodic proposed was also used to determine sensitivity of bacteria to antimicrobial preparations. Conclusion. The proposed hardware and method may be used for express diagnostics of processes of microbial nature.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 97—100

Key words: giant Raman scattering, express diagnostics

7. ЖМЭИ 5 № 5186

97

ВВЕДЕНИЕ

Как известно, при попадании лазерного света на биологический объект (ткань, белок, микроорганизм и т.д.) исследуемый объект поглощает фотоны лазерного излучения и затем испускает новые фотоны на разных длинах волн. В дальнейшем превращение энергии лазерного света в другие виды излучения будем называть конверсией оптического излучения, а диагностику при этом будем называть лазерно-конверсионной диагностикой (ЛКД) [1].

Существует несколько различных типов конверсионного излучения. Одним из этих типов является: 1) Рамановское рассеяние [4] — частота рассеянного света изменяется на значения частот внутримолекулярных колебаний вещества. Поэтому спектр рамановско-го рассеяния отображает химического строение вещества и как бы является его «отпечатком пальцев». 2) Люминесценция — процесс перехода электронов на более высокий энергетический уровень за счет облучения лазерным светом и последующие переходы электронов с одной орбитали на другую (с верхнего энергетического уровня на нижний), которые сопровождаются испусканием фотонов. 3) Рэлеевское рассеяние (в отличие от рамановского формируется без изменения длины волны и частоты света).

Однако вероятность рамановского рассеяния очень маленькая (на несколько порядков ниже вероятности рэлеевского рассеяния), и поэтому этот тип излучения трудно обнаруживается. В связи этим, для того, чтобы стало возможно записывать спектры рамановско-го рассеяния микробов, требуется усиление сигнала на несколько порядков. Такое усиление было достигнуто за счет использованных подложек с металлическими нано-шариками серебра, которые имеют пик плазменного резонанса (область длины волн возбуждающего излучения, вызывающего наиболее сильное переизлучение) в промежутке длины волн 490 — 570 нм. Поэтому нами был выбран твердотельный зеленый лазер с длиной волны 532 нм. Такие подложки при накачке зеленым лазером имеют коэффициент усиления примерно 106, а эффект рамановского рассеяния в биологическом объекте на описанных подложках называется явлением гигантского рамановского рассеяния (SERS) (Fleischman M. et al., 1974).

В наше время не все компоненты конверсии оптического излучения на биологических объектах используются в диагностике микрообъектов, что в научном плане определило перспективы ее развития для получения полной многофакторной (флюоресценция, ра-мановское рассеяние и др. виды конверсионного излучения) картины спектральных характеристик микробов.

В связи с этим, целью нашего исследования было повышение эффективности лазерно-конверсионной диагностики микроорганизмов на основе эффекта гигантского раманов-ского рассеяния и люминесценции.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: разработать экспресс-методику индикации микроорганизмов на основе эффектов гигантского рамановского рассеяния и люминесценции; оценить чувствительность и специфичность разработанной методики; провести сравнительную характеристику рамановских спектров различных клинических микроорганизмов и их изменение при действии на них антимикробных препаратов; оценить возможности и перспективы разработанной экспресс-методики для индикации и идентификации микроорганизмов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования использовали суточные культуры Staphylococcus aureus, Staphylococ-cus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Candida albicans, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa.

Культуры выращивали на простых питательных средах (МПА, МПБ) на нефлюоресци-рующих микробиологических мембранных фильтрах, состоящих из смеси нитрата и ацетата целлюлозы. Были выбраны фильтры с размером пор 0,45 мкм и диаметром 47 мм.

С помощью петли для посевов культуру переносили в пробирку с дистиллированной водой. Полученную взвесь микробов отбирали микропипеткой и наносили на подложку с металлическими нано-шариками серебра. Допустимая концентрация 105 — 106 КОЕ/мл и менее. Измерения на подложке производили после того, как капля раствора высыхала и все исследуемые молекулы оказывались на ее поверхности, с которой снимали усиленный рамановский спектр. Перед записью спектров подложку с культурой помещали на

Рис. 1. Сравнение спектров P. aeruginosa и S. aureus.

По оси абсцисс — raman shift (см-1), обратные сантиметры приняты в спектроскопии и однозначно переводятся в значения длин волн рассеянного света; по оси ординат — интенсивность рассеянного света. 1 — Staphylococcus aureus, 2 — Pseudomonas aeruginosa.

предметное стекло. Далее с помощью прибора EnSpectr регистрировали спектр рамановского рассеяния и люминесценции исследуемых объектов. Результаты представлены в виде спектров исследуемых микробов после их обработки с помощью специального программного продукта.

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

На представленных ниже спектрах видны отличительные линии для каждой бактерии. На рис. 1 показаны спектры P. aeruginosa и S. aureus. Видно, что спектры совершенно разные и, если занести их в базу данных, то можно однозначно проводить диагностику на наличие и концентрацию этих бактерий. На рис. 2 представлены спектры трех разных видов стафилококка — они различны, но одинаковы по показателям рамановских пиков у разных штаммов одного и того же вида (на рис. 2 представлено по два спектра каждого вида). Показано, что для бактерии B.subtillis индивидуальны рамановские пики на 657, 726, 1248, 1377, 1466, 1617 см-1; для E.coli — 1140, 1551 см-1; для S. aureus — 959, 1006, 1160, 1284, 1530 см-1; для S. haemolyticus — 1327, 1369 см-1; для C. albicans — 1344 см-1; для P. aeruginosa — 675, 1353, 1404, 1605, 1630 см-1 . Из представленного материала следует, что видовые индивидуальные линии рамановского спектра культур различны и являются их своеобразным «паспортом». В других экспериментах в этой серии показано,что если спектры люминесценции бактерий существенно зависят от условий и сроков их культивирования, то рамановские спектры при этом остаются строго специфичными и не изменяются (как отпечаток пальца). При указанных выше концентрациях чувствительность и специфичность представленной технологии составляет порядка 100%.

В отдельном эксперименте изучали возможность использования экспресс-метода ЛКД для определения чувствительности к антимикробным препаратам. При обработке микро-

Рис.2. Сравнение спектров различных клинических штаммов стафилококка.

По оси абсцисс — raman shift (см-1), по оси ординат — интенсивность рассеянного света. Верхние 2 спектра — S. haemolyticus, средние 2 — S. aureus, нижние 2 — S. saprophyticus.

ба (P.aeruginosa) хлорамином его специфические амплитудно-спектральные характеристики исчезают, в отличие от контрольных объектов сравнения (хлорамин-водный раствор). Время исследования 2 — 3 мин.

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, установлено, что каждый вид исследованных бактерий характеризуется индивидуальными спектральными линиями рамановского рассеяния, которые позволяют идентифицировать их в короткое время (1 — 2 мин), что определяет возможность одновременной идентификации большого количества культур. Предлагаемый способ отличается высокой чувствительностью (105 — 106 КОЕ/мл), быстротой идентификации микроорганизмов. Портативность прибора (вес 2 — 2,5 кг в зависимости от комплектации, включая компактный кейс) позволяет использовать его в мобильных (передвижных) лабораториях. В настоящее время разработанная аппаратура и технология проходят сертификацию [1 — 3, 5].

Применение ЛКД (гигантского рамановского рассеяния и люминесценции) как новой технологии открывает возможности экспресс-индикации микроорганизмов, определения их видовой принадлежности, ускоренного определения чувствительности к антимикробным препаратам в различных областях клинической микробиологии на основе принципиального требования современной медицины — диагностика по месту лечения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Александров М.Т. Лазерная клиническая биофотометрия. М., Техносфера, 2008.

2. Александров М.Т., Таубинский И.М., Козьма С.Ю. Способ для обнаружения и оценки концентраций анаэробных бактерий в биологическом субстрате. Патент РФ №97100364 от 21.01.97.

3. Александров М.Т., Нестерова М.В., Пашков Е.П., Морозова О.А. Метод флюоресцентной диагностики — метод индикации микрофлоры человека в норме и при патологии. Журн. микробиол. 2001, 3: 63-66.

4. Акципетров О.А. Гигантские нелинейно-оптические явления на поверхности металлов. Соросовский образовательный журнал. 2001, 7: 109.

5. Пашков Е.П. Лазерно-флюоресцентный метод экспресс-индикации микроорганизмов при гнойно-воспалительных заболеваниях, дисбактериозах и другой патологии микробной этиологии. Автореф. дисс. д-ра мед. наук. М., 2002.

Поступила 12.02.13

Контактная информации: Александров Михаил Тимофеевич, д.м.н., проф., 111558, Москва, ул. Погодинская,10, р.т. (495)300-58-80

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

Л.А.Кафтырева1, М.А.Макарова1, Т.А.Коновалова2, З.Н.Матвеева1

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ESCHERICHIA COLI О145:Н28, ВЫДЕЛЕННОЙ ОТ ПАЦИЕНТА С ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург; Центральный НИИ эпидемиологии, Москва

Цель. Определение этиологической значимости клинических штаммов E.coli О145:Н28, изолированных из испражнений пациента с гемолитико-уремическим синдромом (ГУС). Материалы и методы. Исследованы 20 штаммов E.coli, выделенные из испражнений пациен-