CC BY
25
УДК 543.4
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ МЕТОДОМ МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ЦИФРОВОЙ ЦВЕТОМЕТРИИ О.В. Моногарова1*, А.А. Чапленко1' 2, К.В. Осколок1
(1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра аналитической химии; Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России; *е-тай: [email protected])
Разработан эффективный, доступный и экспрессный способ анализа лекарственных препаратов на основе левомицетина методом мультисенсорной цифровой цветоме-трии. Предложено использование двумерного кода для идентификации и определения левомицетина при минимальном уровне информационного шума. Для повышения достоверности результатов определения лекарственного вещества применен метод главных компонент. Адекватность разработанного подхода подтверждена при анализе препаратов левомицетина в виде двух лекарственных форм - таблеток и глазных капель. Правильность полученных результатов подтверждена способом «введено-найдено». Показано, что полученные результаты не имеют статистически значимых отличий от величин, заявленных производителем.
Ключевые слова: левомицетин, молекулярный сенсор, цифровая цветометрия, лекарственный препарат.
Левомицетин (хлорамфеникол) - бактерио-статический антибиотик широкого спектра действия, который проникает сквозь клеточную стенку бактерий и обратимо связывается с субъединицей рибосомы 508, тем самым нарушая процесс синтеза белка в микробной клетке. Данный препарат известен с 1947 г., выпускается в различных лекарственных формах - капли глазные, таблетки, раствор для наружного применения, а также линимент.
Для предварительного экспрессного выявления фальсификатов (еще до использования дорогостоящего аналитического оборудования) целесообразно применять простые и доступные методы. К таким методам можно отнести муль-тисенсорную цифровую цветометрию [1-4], основанную на получении окрашенных продуктов взаимодействия аналита с молекулярными сенсорами, получении информации об их цветовых характеристиках и последующем преобразовании в уникальный дискретный код вещества, который можно использовать для химического анализа.
Цель настоящей работы - идентификация и определение левомицетина в лекарственных препаратах методом цифровой цветометрии с использованием молекулярных сенсоров.
Экспериментальная часть
Реактивы. Для реализации предложенного подхода использовали субстанции хлорамфе-
никола («Органика», Россия); 0,25% глазные капли (ПФК «Обновление»), таблетки 500 мг («БиоФармКомбинат») и стандартные образцы хлорамфеникола Европейской Фармакопеи (EP CRS C1200000).
В качестве молекулярных сенсоров использовали С1 (10%-й раствор NaOH), С2 (0,1 М раствор нитрата серебра) и С3 (пищевой краситель Е129 - 1 мМ спиртовой раствор кислотно-основного индикатора «красный очаровательный» AC (CAS# 25956-17-6)). Как правило, указанные реагенты используют в нормативной документации разных производителей для обнаружения левомицетина при проведении качественных реакций с образованием окрашенных продуктов. При выборе условий цветометрического определения принимали во внимание данные, приведенные в нормативной документации на субстанцию и препараты левомицетина (все реакции проводили в одинаковых условиях при температуре 85 °С в течение 20 мин).
Оборудование. Анализ проводили в прозрачных планшетах из полипропилена с плоским дном, объем лунки составлял 350 мкл («Thermo Fischer Scientific», США, кат. № 430341). В лунки планшета последовательно вносили по 100 мкл соответствующего сенсора (Cx-C3) и по 100 мкл спиртовых растворов субстанции левомицети-на. В отдельный ряд лунок для сравнения вносили растворы сенсоров без добавления растворов
субстанции (интактные лунки). После добавления растворов субстанции планшет заклеивали пленкой, встряхивали на планшетном термо-шейкере «PST-100HL» («BioSan», Латвия) в течение 20 мин.
Для получения растровых изображений применяли офисный планшетный сканер «Epson Perfection 1670» (CCD-матрица) со съемной крышкой. Сканирование планшета с образцами проводили c помощью программы Epson Scan в режиме Professional mode (разрешение 600 dpi, глубина цвета 24 bit). Параметры «Color restoration», «Unsharp mask filter» и «Descreening filter» были отключены. Для выполнения цифрового цветометрического анализа с использованием 96-луночного планшета («Thermo Fischer Scientific», США, кат. № 1256604) была изготовлена тефлоновая рамка-вкладыш размером 210x297x17 мм с центральным прямоугольным вырезом (128x86 мм), которую помещали под крышкой офисного планшетного сканера формата А4. Это позволило:
ускорить и формализовать процедуру установки планшета на рабочем стеклянном столе сканера;
зафиксировать координаты и условия освещения планшета электролюминесцентной лампой, встроенной в каретку;
минимизировать боковые паразитные засветки планшета с субстратами внешними источниками излучения;
повысить точность результатов измерения светлоты цветовых каналов растровых изображений планшета.
В качестве аналитического сигнала использовали разность светлот цветовых каналов между лункой с аналитом и интактной лункой. Полученные цифровые изображения ячеек обрабатывали в программе ImageJ с использованием цветовой модели rgb 24 bit (8 бит на канал), в каждой лунке выделяли центральную область и получали 3 усредненных значения светлоты - по одному для каждого цветового канала. Выбор цветовых каналов осуществляли эмпирически.
Результаты и их обсуждение
Идентификация субстанции левомицетина. На первом этапе проводили пробоподготовку и реакцию взаимодействия спиртового раствора левомицетина с растворами вышеуказанных трех веществ-сенсоров. Цифровое изображение ячеек планшета получали с помощью планшетного сканера. На втором этапе проводили маскирова-
ние изображения и цифровую обработку в целях определения светлоты цветовых каналов (Я, о, В). Для субстанции левомицетина получали набор из 9 значений светлоты каналов (Я, о и В) - по три на каждый из 3 сенсоров. Аналитическим признаком служило изменение цвета ячейки, обусловленное прохождением химической реакции между аналитом и сенсором. Изменение цвета ячейки численно характеризуется разностью светлоты отдельных цветовых каналов изображения ячеек в присутствии и в отсутствие левомицетина. При значимом отличии светлоты каналов для аналита от светлоты в интактных ячейках (не важно, в большую или меньшую сторону) соответствующему цветовому каналу ячейки присваивали значение «1», в случае совпадения - «0». На основани этого можно сформировать уникальный штрих-код, позволяющий идентифицировать препараты на основе левоми-цетина. Важно определить, начиная с какого значения разности светлоты изменение цвета можно считать признаком протекания реакции, а не артефактом, связанным с вариабельностью цифрового изображения. Пороговое значение разности светлоты канала влияет, с одной стороны, на уникальность кода, с другой - на его воспроизводимость. При экспериментально выбранном пороговом значении код каждой из субстанций был уникальным и воспроизводимым для 10 параллельных измерений.
Для имитации препаратов с давно истекшим сроком годности или нарушением условий хранения раствор левомицетина подвергали «стресс-тесту» - нагреванию до 100 °С в течение 5 мин. Как видно из рис. 1, штрих-код для препарата после стресс-теста отличается от штрих-кода для стандартного образца. Таким образом, существует принципиальная возможность предварительного суждения о качестве препаратов левомицетина.
Рис. 1. Одномерный код стандартного раствора субстанции левомицетина до стресс-теста (1) и после (2). Ячейка с белой заливкой соответствует отсутствию аналитического сигнала, с черной -указывает на его наличие
Полуколичественный анализ препаратов левомицетина с использованием цветометри-ческих кодов. С помощью предложенного подхода можно не только идентифицировать, но и определять левомицетин. Для определенной концентрации лекарственного вещества можно сформировать двумерный 9-битный штрих-код (3 сенсора х 3 цветовых канала). Сравнение кода анализируемого образца при неизвестной концентрации левомицетина со стандартной библиотекой кодов позволит определять содержание аналита. При выборе оптимального порога, выше которого значение разности светлот обозначается «1», а значение, равное ему или более низкое, обозначается «0», руководствовались следующими требованиями:
1) получаемый код должен быть селективным, каждой концентрации должна соответствовать только одна кодировка;
2) различие в кодировках между соседними значениями концентрации должно быть минимальным (1-2 значения), таким, чтобы получаемые при анализе коды интерпретировались однозначно.
Для выполнения указанных требований целесообразно установить индивидуальные пороговые значения для каждого из каналов (при едином значении задача невыполнима). С помощью надстройки MS Excel «Поиск решения» найдены оптимальные пороговые значения для каналов и получены цветометрические коды для определенного диапазона концентраций левомицетина (табл. 1). Предложенная система штрих-кодов использована для анализа таблеток и глазных капель левомицетина. Анализируемый раствор левомицетина готовили растворением точно известной навески таблеток (предварительно растертых в порошок) на ультразвуковой бане с последующим отделением нерастворимого осадка фильтрацией. Указанная методика предлагается производителем в нормативной документации на препарат. Дополнительную пробоподготовку глазных капель левомицетина не проводили.
Правильность полученных результатов подтверждена способом «введено-найдено» (табл. 2). Таким образом, разработанный способ полуколичественного анализа левомицетина отличается достаточно высокой правильностью и может применяться для экспрессного скринингового анализа препаратов левомицетина.
Количественный анализ лекарственных препаратов левомицетина. Для построения граду-
ировочных зависимостей приготовлены растворы фармакопейного стандарта левомицетина в интервале от 0,5 до 5 мг/мл. Диапазон концентраций подбирали таким образом, чтобы наиболее распространенное значение концентрации растворов парентеральных лекарственных форм левомице-тина (2,5 мг/мл) находилось в середине граду-ировочного графика. После проведения аналитических реакций левомицетина с выбранными молекулярными сенсорами сканировали планшет с образцами и обрабатывали цифровые изображения. Результаты эксперимента представлены в табл. 3. Можно отметить наличие корреляции между разностью светлот отдельных каналов и концентрацией аналита, однако рассчитанные коэффициенты детерминации и относительное стандартное отклонение величин сигналов (табл. 4) не соответствуют требованиям линейности и воспроизводимости, предъявляемым к методикам контроля качества лекарственных средств [5, 6], а именно:
r 2 > 0,99; sr < 5%.
Как альтернативный вариант в качестве аналитического сигнала можно использовать разность «эффективных» светлот (Y), учитывающих неодинаковую чувствительность человеческого глаза к разным цветам в системе rgb:
y = 0,299R + 0,587G + 0,114B.
Результаты анализа левомицетина представлены в табл. 5. Как следует из приведенных данных, только разность «эффективных» светлот, рассчитанная для второго сенсора (C2), может быть использована для анализа лекарственных препаратов на основе левомицетина. Таким образом, именно эта величина рассмотрена в качестве аналитического сигнала при разработке способа определения левомицетина в разных лекарственных формах.
Оценку правильности разрабатываемого способа определения проводили с использованием реальных объектов - лекарственных препаратов левомицетина. Для анализа нами были выбраны наиболее широко применяемые лекарственные формы - капли глазные 0,25% (ПФК «Обновление»), а также таблетки 500 мг («БиоФармКом-бинат»). Пробоподготовку осуществляли так же, как при выполнении полуколичественного анализа (см. выше). Правильность полученных результатов подтверждена способом «введено-найдено». Результаты представлены в табл. 6.
Т а б л и ц а 1
Двумерный цветометрический код для полуколичественного анализа лекарственных препаратов левомицетина (С;. - молекулярные сенсоры; круг со светлой заливкой соответствует отсутствию аналитического сигнала, с темной - указывает на его наличие)
Диапазон концентраций левомицетина, мг/мл C1 C2 C3
Пороговые значения разности светлот для разных цветовых каналов
ARj AGj aB1 ar2 ag2 ab2 AR3 AG3 AB3
157 94 18 39 33 12 47 6 4
<1,0 Q Q п Q Q П Q Q Q
1,0-1,5 И га га га га га га га о
1,5-2,0 га га га га га га га о о
2,0-2,5 га га га га га о га о о
2,5-3,0 га га о га га о га о о
3,0-3,5 га га о га о о га о о
3,5-4,0 га га о о о о га о о
4,0-4,5 га га о о о о о о о
4,5-5,0 га га о о о о о о о
> 5,0 о о о о о о о о о
Т а б л и ц а 2
Проверка правильности результатов полуколичественного определения левомицетина в таблетках
(1,0 мг/мл) и каплях (2,5 мг/мл) (P = 0,95; n = 10)
Таблетки Капли глазные
введено, мг/мл найдено, мг/мл введено, мг/мл найдено, мг/мл
0,7 1,5-2,0 1,2 3,5-4,0
1,2 2,0-2,5 1,7 4,0-4,5
1,7 2,5-3,0 2,2 4,5-5,0
2,2 3,0-3,5 2,7 > 5,0
Т а б л и ц а 3
Значения цветометрического сигнала для разных концентраций стандартных растворов левомицетина
Концентрация левомицетина, мг/мл С: С2 С3
AR1 AGj AB1 ar2 ag2 ab2 AR3 AG3 AB3
0,5 30 30 9 14 7 0 26 5 3
1,0 46 31 14 15 13 4 30 6 5
1,5 50 36 15 18 18 7 34 7 6
2,0 61 40 18 20 25 17 37 9 7
2,5 89 64 19 29 31 22 39 12 11
3,0 104 88 19 37 34 29 41 18 14
3,5 148 86 20 41 36 34 45 21 19
4,0 151 89 20 48 39 38 49 26 25
4,5 155 99 21 55 38 47 60 30 29
5,0 158 106 21 63 40 61 64 38 31
О б о з н а ч е н и я: С, - молекулярные сенсоры; ДЯ, ДО,, ДБ, - значения разности светлот для красного, зеленого и синего цветового каналов соответственно.
Т а б л и ц а 4
Метрологические характеристики способа оценки содержания левомицетина в водных растворах
с концентрацией 0,5-5,0 мг/мл
Разность светлот цветовых каналов C1 C2 C3
AR1 AG1 AB1 ar2 ag2 ab2 AR3 AG3 AB3
R2 0,95 0,93 0,80 0,96 0,91 0,97 0,94 0,94 0,95
sr, % (с = 2,5 мг/мл) 5,1 5,8 8,1 6,2 6,8 6,4 6,1 8,9 8,0
О б о з н а ч е н и я: С, - молекулярные сенсоры; ДЯр ДО,, ДБ. - значения разности светлот для красного, зеленого и синего цветового каналов соответственно; Я ^-коэффициент корреляции; яг - относительное стандартное отклонение.
Т а б л и ц а 5
Метрологические характеристики способа оценки содержания левомицетина в водных растворах при использовании в качестве аналитического сигнала разности «эффективных» светлот для 1-го сенсора (Д^)
Y AY1 ay2 AY3
R2 0,9570 0,9901 0,9587
Уравнение градуировочной зависимости AY1 = 21,3c + 12,3 AY2 = 9,2c + 4,2 AY3 = 7,4c + 4,1
sr, % (с = 2,5 мг/мл) 5,1 4,1 5,9
Использование способа главных компонент для количественного анализа препаратов левомицетина. Перспективным представляется подход, в котором набор значений светлот цветовых каналов рассматривают как некий «цветометриче-ский спектр», когда данные могут быть обработаны с помощью хемометрических алгоритмов, из
которых наиболее часто используется метод главных компонент (PCA, principal component analysis) [7, 8]. В этом случае имеется возможность, с одной стороны, выделить наиболее информативный сенсор и канал, с другой - снизить уровень шума и повысить точность результатов анализа. Кроме того, применение хемометрических алгоритмов
Т а б л и ц а 6
Оценка правильности разработанного способа определения левомицетина в различных лекарственных
формах (Р = 0,95; п = 10)
Таблетки (1,0 мг/мл) Капли глазные (2,5 мг/мл)
введено, мг/мл найдено, мг/мл введено, мг/мл найдено, мг/мл
0,5 1,5 ± 0,1 1,0 3,4 ± 0,1
1,0 2,1 ± 0,1 1,5 4,1 ± 0,1
1,5 2,6 ± 0,2 2,0 4,5 ± 0,2
2,0 2,9 ± 0,2 2,5 4,9 ± 0,2
Т а б л и ц а 7
Метрологические характеристики способа определения левомицетина в глазных каплях, основанного на хемометрической обработке результатов, полученных методом мультисенсорной цифровой цветометрии
(Р = 0,95; п = 10)
Диапазон определяемых концентраций, мг/мл Я2 А'г, % (2,50 мг/мл) Заявлено производителем, мг/мл Цветометрия, мг/мл
0,5-5,0 0,999 2,2 2,50 2,48 + 0,04
позволяет выявить образцы, качественный состав которых отличается от остальных, например препараты с истекшим сроком годности.
Для апробации хемометрических подходов использовали серию градуировочных растворов с концентрацией 0,5-5,0 мг/мл. Анализируемый раствор готовили из 0,25% глазных капель левомицетина с содержанием действующего вещества 0,25 мг/мл. В качестве образцов, моделирующих неправильное хранение/нарушение сроков годности, предложены капли левомицетина после
Рис. 2. Зависимость первой главной компоненты от концентрации левомицетина в градуировочных растворах
стресс-теста - нагревания до 100 °С в течение 5 мин. Полученные цветометрические данные были обработаны методом МРАЬ8 РСА. Результаты обработки - значения главных компонент РС1 и РС2 для всех образцов - представлены в виде точечной диаграммы на рис. 2. Значения РС1 и РС2 были рассчитаны по следующим формулам:
РС1 = 0,67-Щ + 0,54-ДС1 + 0,15-А51 +
+ 0,25- ДЯ2 + 0,24-Да2 + 0,24-Д52 +
+ 0,12ДЯ3 + 0,15^3 + 0,14Д53;
РС2 = 0,09-Щ - 0,24-Да1 + 0,13-Д51 -
- 0,1Здя2 + 0,04-дс2 - 0,06ДВ2+
+ 0,94- ДЯ3 - 0,06-ДС3 - 0,11-ДВ3.
Можно отметить наличие линейной корреляции (Я2 = 0,998) между значением первой главной компоненты (РС1) и содержанием левомицетина в градуировочных растворах (рис. 3). Точки, соответствующие анализируемым образцам препарата, формируют единую группу в области диаграммы, соответствующей граду-ировочному раствору с содержанием 2,5 мг/мл (номинальное содержание действующего вещества в препарате). Точки для образцов, подвергшихся стресс-тесту (моделирование нарушений условий хранения и транспортировки) также формируют единую выборку, среднее значение РС2 которой статистически достоверно (р < 0,01) отличается от такового для «нормальных» образцов. Таким образом, значение первой глав-
15--—-
30 70 110 150 190 230 270
РС1
Рис. 3. Результаты обработки цветометрических данных, полученных для градуи-ровочных (с концентрацией 0,5-5,0 мг/мл) и анализируемых растворов левомице-тина до (1) и после (2) стресс-теста
ной компоненты может быть использовано для определения содержания левомицетина в глазных каплях. Метрологические характеристики способа представлены в табл. 7. Полученные результаты согласуются с данными, заявленными производителем. Из табл. 7 видно, что использование метода главных компонент позволяет улучшить воспроизводимость результатов анализа по сравнению с применением градуи-ровочной зависимости по выбранному сенсору и выбранному цветовому каналу.
Вторая главная компонента (РС2) может быть использована для определения недоброкачествен-
ных образцов, содержащих, наряду с действующим веществом, продукты его деградации и/или технологические примеси. Данная возможность предлагаемого подхода - ключевое преимущество для использования настоящего способа в скринин-говом анализе качества лекарств.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 1423-00012).
Конфликта интересов нет. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием людей или животных в качестве объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Чапленко А.А., Моногарова О.В., Осколок К.В. // Химико-фармацевтический журнал. 2019. Т. 53. С. 44.
2. Kangas M.J., Wilson K.L., Burks L.M., Atwater J., Lukowicz R.M., Garver B., Mayer M., Havenridge S., Holmes A.E. // International Journal of Chemistry. 2018. Vol. 10. P. 36.
3. Kangas M.J., Ernest A., Lukowicz R.M., Mora A.V., Quossi A., Perez M., Kyes N., Holmes A.E. // Sensors. 2018. Vol. 18. P. 4291.
4. Goodey A. // Journal of the American Chemical Society. 2001. Vol. 123. N. 11. P. 2559.
5. Smith A. // Journal of Forensic Research. 2012. Vol. 3. N. 8. P. 161.
6. Общая фармакопейная статья 1.1.0012.15. Вали-дация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XlV изд. Т. I. 2018.
7. Kangas M.J., Burks R.M., Atwater J., Lukowicz R.M., Garver B., Holmes A.E. // Journal of Chemometrics. 2018. Vol. 32. P. 1.
8. Suslick B.A., Feng L., Suslick K.S. // Analytical Chemistry. 2010. Vol. 82. N 5. P. 2067.
Поступила в редакцию 10.06.2019 Получена после доработки 12.07.2019 Принята к публикации 14.09.2019
IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL IN DRUGS BY MULTISENSORY DIGITAL COLORIMETRY
O.V. Monogarova1*, A.A. Chaplenko12, K.V. Oskolok1
(1 Chemistry Department of Lomonosov Moscow State University, Division of Analytical Chemistry; Scientific center for expert evaluation of Medicinal products of the Ministry of Health of the Russian Federation; *e-mail: [email protected])
An effective, available and express method for the analysis of drugs based on chloramphenicol by the multisensory digital colorimetry method was developed. The use of a two-dimensional code for identification and determination of chloramphenicol with a minimum level of information noise was proposed. To improve the reliability of the results of the determination of the medicinal substance principal component analysis was applied. The adequacy of the developed approach was confirmed by the analysis of chloramphenicol drugs in the form of two dosage forms - tablets and eye drops. The accuracy of the results obtained is confirmed by the "spike recovery test". It is shown that the results obtained do not have statistically significant differences from the values stated by the manufacturer.
Key words: chloramphenicol, molecular sensor, digital colorimetry, drug.
Сведения об авторах: Моногарова Оксана Викторовна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук ([email protected]); Чапленко Александр Андреевич - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, эксперт ФГБУ Научного центра экспертизы средств медицинского применения Минздрава России ([email protected]); Осколок Кирилл Владимирович - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук ([email protected]).
