CC BY
81
TRANSFERASE, PHOSPHATASE AND a- AMILASE IN THE RECTUM TISSUES IN
PIGLETS
Terentyeva M.G., Ignatyev N.G. Summary
The research results of activity of aspartat-, alaninaminotransferase, a-amylase, alkaline and acid phosphatase in tissues of piglets rectum of was detected grown in swine rearing complex conditions were, stated in this article. The temper and age changing intensity of young boars and castrated boars at the age of 1, 7, 14, 21, 28, 60, 90, 120 and 180 days were determined.
УДК 636.2.034:636.2.082.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ GSD И FXID У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
*Тюлькин С.В. - к.с.-х.н., зам. зав. отдела; **Хатыпов И.И. - вед. специалист;
Ахметов Т.М. - д.б.н., доцент; ***Вафин Р.Р. - д.б.н., науч. консультант *Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», г. Казань, **ООО УК «Просто молоко», г. Казань Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана *** Казанский (Приволжский) федеральный университет e-mail: [email protected]
Ключевые слова: бык-производитель, мутация, GSD, FXID, ПЦР.
Keywords: stud bull, mutation, GSD, FXID, PCR.
На сегодняшний день достижения молекулярной биологии позволяют безошибочно определять генетические мутации у сельскохозяйственных животных. В связи с возможным распространением генетических мутаций и использованием ограниченного числа производителей оценка на носительство мутантных аллелей в определённых генах у сельскохозяйственных животных получает широкое распространение в племенных предприятиях, что способствует выявлению и исключению из воспроизводства мутантных аллелей [2].
К таким наследственным заболеваниям у крупного рогатого скота относят дефицит миофосфорилазы (GSD) и дефицит фактора XI (FXID).
Аутосомная рецессивная мутация GSD - гликогеновая болезнь V типа (glycogen storage disease V) характеризуется дефицитом в мышцах фосфорилазы [10, 4].
Данная наследственная болезнь вызывает непереносимость физических нагрузок, миалгии и периодические миоглобинурии [3].
Многолетний мониторинг различных популяций показал, что GSD-мутация приводит к увеличению эмбриональной смертности и снижению рождаемости у крупного рогатого скота [9, 4].
Аутосомная рецессивная мутация FXID (factor XI deficiency) у животных и человека связана с одним из главных белков, участвующих в свертывание крови. FXID был идентифицирован у нескольких видов млекопитающих, включая людей, собак и крупный рогатый скот [7, 8, 1].
FXID может привести к длительному кровотечению из пуповины, а в дальнейшем и к анемии. Также может наблюдаться длительное кровотечение после проведения обезроживания и кастрации животных. У отелившихся коров с FXID довольно часто молозиво с красноватым оттенком. Наличие крови в молоке привело к выявлению этого признака в британском молочном стаде [6]. Дополнительно FXID понижает воспроизводительные качества у животных; такие животные восприимчивы к болезням как пневмония, мастит и метрит. Поэтому в целом, присутствие этого генетического дефекта у крупного рогатого скота может привести к существенным экономическим потерям молочной промышленностью [5, 8].
Животные с дефицитом фактора XI в течение многих лет могут клинически не проявляться, притом, что среди таких животных достаточно высокий уровень заболеваемости и смертности [7].
В связи с этим, исследования, посвященные выявлению GSD- и FXID-мутаций, связанных с важными хозяйственно-полезными признаками у крупного рогатого скота являются актуальными.
Материал и методика исследований. Для проведения исследований было отобрано 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.
Для проведения ДНК-диагностики у крупного рогатого скота были отобраны пробы крови. Кровь, полученную у быков-производителей, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом.
Анализ GSD-мутации у крупного рогатого скота. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера GSD-V-F: 57-CCAGGAAGACCCTCATTCCA-37, 0,5 мкМ праймера GSD-V-R: 57-AGGGAAACACACACACAG-37, отобранных E.C. Soethout et al. (2002) для амплификации специфичного ПЦР-продукта длиной 252 bp, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:
х1: 94 0С - 4 мин; х40: 94 0С - 5 сек, 67 0С - 5 сек, 72 0С - 5 сек; х1: 72 0С - 5 мин; хранение: 4 0С.
Для идентификации GSD-мутации 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции ErhI в 1хбуфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.
Анализ FXID-мутации у крупного рогатого скота. АС-ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера FXID-F: 57-CCCACTGGCTAGGAATCGTT^, 0,5 мкМ праймера FXID-R: 57-CAAGGCAATGTCATATCCAC^, отобранных B.M. Marron et al. (2004) для амплификации ПЦР-продукта FXID-мутации длиной 320 bp больных животных, ПЦР-фрагмента размером 244 bp здоровых животных, а также животных-носителей мутации FXID - 320/244 bp, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:
х1: 94 0С - 4 мин; х30: 94 0С - 5 сек, 65 0С - 5 сек, 72 0С - 5 сек;
х1: 72 0С - 5 мин; хранение: 4 0С.
Детекция. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 3% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1хТВЕ буфере.
После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР и ПЦР-ПДРФ.
Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы ПЦР-ПДРФ-протокола по идентификации у крупного рогатого скота мутации GSD, были протестированы праймеры GSD-V-F: 5/-CCAGGAAGACCCTCA-TTCCA-3/ и GSD-V-R: 5/-
AGGGAAACACACACACAG-3/, отобранные E.C. Soethout et al. (2002), в оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ-анализа.
Праймеры GSD-V-F+GSD-V-R инициируют амплификацию специфичного ПЦР-продукта длиной 252 bp (рис. 1, трек 8). ErhI-ПДРФ-профиль здоровых животных = 252 bp (генотип GG) (рис. 1, треки 1-7), больных GSD-синдромом животных = 133/119 bp (генотип gg), а животных-носителей GSD-мутации = 252/133/119 bp (генотип Gg).
Среди чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей не выявлено ни одного животного с генотипами Gg и gg, связанных с GSD-мутацией.
Для оценки качества работы известного протокола генотипирования крупного рогатого скота по FXID-гену были протестированы праймеры FXID-F: 5/-CCCACTGGCTAGGAATCGTT-3 и FXID-R: 5/-CAAGGCAATGT-CATATCCAC-3/, отобранные B.M. Marron et al. (2004), в оптимизированной нами технике АС-ПЦР.
М 1 2 3 4 567 8
400 bp-*-
300
200 bp^-100
Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ-анализа GSD-мутации с праймерами GSD-V-F+GSD-V-R и эндонуклеазным расщеплением ErhI Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1-7) ErhI-ПДРФ-профиль генотипа GG (252 bp); 8) цельный ПЦР-продукт (252 bp).
М123 4567 8
500 bp 400 bp 300 bp
200 bp 100 bp
Рис. 2. Электрофореграмма результата АС-ПЦР-анализа FXID-мутации
с праймерами FXID-F+FXID-R
Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1-4) генотип +/- (320/244 bp);
5-8) генотип +/+ (244 bp).
Праймеры FXID-F+FXID-R инициируют амплификацию как единичного ПЦР-продукта длиной 320 bp (больные животные, генотип -/-) или 244 bp (здоровые животные, генотип +/+, рис. 2, треки 5-8), так и одновременно двух ПЦР-фрагментов размерами 320/244 bp (животные-носители мутации, генотип +/-, рис. 2, треки 1-4).
Анализ чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей по FXID-мутации показал, что из 70 быков-производителей 69 (98,6%) имели генотип +/+ (здоровые животные), 1 (1,4%) - генотип +/- (животных-носителей FXID-мутации), быков с генотипом -/- (больных животных) не обнаружено. При этом частота аллелей «+» и «-» соответственно составила 0,993 и 0,007.
Скрытое носительство FXID-мутации выявлено у быка-производителя, принадлежащего к линии Р.О.Р.Э. Элевейшн.
Выводы. 1. Для эффективного выявления GSD- и FXID-мутаций у крупного рогатого скота необходимо использовать методы ДНК-анализа; 2. При скрининге GSD-мутации среди чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей не выявлено наличия у них данного наследственного заболевания; 3. Установлено наличие дефектного аллеля «-» FXID-мутации среди чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей только у одного быка, при этом частота мутантного аллеля составила 0,007.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Крюков, В.И. ДНК-диагностика в селекции крупного рогатого скота / В.И. Крюков, О.А. Шалимова, Н.Г. Друшляк, А.В. Пикунова // Вестник Орел ГАУ. - 2012 - № 1. - С. 62-68. 2. Четвертакова, Е.В. Генетические дефекты и аномалии в молочно-мясном и молочных породах скота Красноярского края / Е.В. Четвертакова // Вестник Красноярского ГАУ. - 2013. - № 5. - С. 167-172. 3. Angelos, S. Myophosphorylase deficiency associated with rhabdomyolysis and exercise intolerance in 6 related Charolais cattle / S. Angelos, [et al.] // Muscle Nerve. -2010. - V. 18. - P. 736-740. 4. Citek, J. Monitoring of the genetic health of cattle in the Czech Republic / J. Citek, V. Rehout, J. Hajkova, J. Pavkova // Vet. Medicina. - 51. - 2006. - V. 6. - P. 333-339. 5. Ghanem, M.E. Factor XI mutation in a Holstein cow with repeat breeding in Japan / M.E. Ghanem, [et al.] // J. Vet. Med. Sci. - 2005. - V. 67. - P. 713-715. 6. Haton, B.M. Mutation that causes factor XI deficiency in Holstein cattle. [Электронный ресурс] / B.M. Haton, J.E. Beever, J.L. Robinson // Illini DairyNet. The Online Resource for the Dairy Industry. - 2000. - Режим доступа: http://www.livestocktrail.uiuc.edu/dairynet/paperDisplay.cfm?ContentID=332]. 7. Marron, B.M. Identification of a mutation associated with factor XI deficiency in Holstein cattle / B.M. Marron [et al.] // Anim. Genet. - 2004. - V. 35. - P. 454-456. 8. Meydan, H. Screening for bovine leukocyte adhesion deficiency, deficiency of uridine monophosphate synthase, complex vertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factor XI deficiency in Holstein cows reared in Turkey / H. Meydan, M.A. Yildiz, J.S. Agerholm // Acta Vet. Scanlinavica. - 2010. - V. 52:56. P. 1-8. 9. Molteni, L. Fertility of cryoconserved sperm in three bulls with different Robertsonian translocations / L. Molteni, [et al.] // Anim. Reproduction Sci., V. 86. - P. 1-36. 10. Soethout, E.C. A direct StyI polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Test for the myophosphorylase mutation in cattle / E.C. Soethout [et al.] // Journal of Veterinary Medicine Series A, Physiology Pathology Clinical Medicine. - 2002. - V. 49. - P. 289-290.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ GSD И FXID У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
Тюлькин С.В., Хатыпов И.И., Ахметов Т.М., Вафин Р.Р.
Резюме
В данной работе представлены результаты ДНК-анализа по идентификации генетических мутаций GSD и FXID у чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей. У исследованных быков-производителей выявлена только мутация в гене, ответственном за FXID; частота мутантного аллеля «-» FXID в гетерозиготном состоянии составила 0,007.
IDENTIFICATION OF GSD AND FXID GENETIC MUTATIONS IN STUD BULLS
Tjulkin S.V., Khatipov I.I., Ahmetov T.M., Vafin R.R.
Summary
This paper presents the results of DNA analysis to identify genetic mutations GSD and FXID at thoroughbred and hybrid Holstien stud bulls. In the stud bulls detected only a mutation in gene responsible for FXID; the frequency of the mutant allele «-» FXID in heterozygous was 0,007.
УДК 619:611.83+599.32
МОРФОЛОГИЯ БРЮШНО-АОРТАЛЬНОГО СПЛЕТЕНИЯ БЕЛОЙ
ЛАБОРАТОРНОЙ КРЫСЫ
Тяглова И.Ю. - к.б.н.; Ситдиков Р.И. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой Казанская государственная академия ветеринарной медицины тел.: (843) 238-25-79
Ключевые слова: почка белой крысы, нервные сплетения, ганглии, нервные волокна, нервы.
Keywords: kidney of a white rat, nerve plexuses, nerve, the nerve fibres, nervous.
Целью исследования было изучение морфологических особенностей брюшно-аортального сплетения у белой лабораторной крысы.
Материалы и методы. Исследование было проведено методом обычного и тонкого препарирования на четырех крысах-самцах, в возрасте 8 месяцев. Материал для исследования предварительно фиксировали в 5%-ном растворе формалина.
Результаты исследования. Установлено, что у изученных
