CC BY
17ISSN 0868-5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2010, том 20, № 4, c. 77-83
= МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ ^
УДК 621.384.668.8: 577.122: 615.099.07
© Я. А. Дубровский, Е. П. Подольская, Н. Г. Войтенко, И. А. Краснов, В. Д. Гладилович, В. Н. Бабаков, Н. В. Гончаров, Н. В. Краснов
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АЛКИЛИРОВАННЫХ АДДУКТОВ ГЛОБИНА КРЫСЫ МЕТОДАМИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
В данной работе была исследована возможность образования аддуктов глобина крысы с сернистым ипритом (HD) in vitro. В результате был обнаружен ряд триптических пептидов: EFTPCHDAQAAFQK (1444.62 Да), GTFAHLSELHChdDK (1561.66 Да), IGGHGGEYGEhdEALQR (1676.78 Да), — модифицированных остатком HD по С126, С93 и E27 соответственно и относящихся к глобину крысы.
Кл. сл.: гемоглобин, сернистый иприт, аддукты, масс-спектрометрия, МАЛДИ
ВВЕДЕНИЕ
В последние десятилетия масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации является одним из наиболее интенсивно развивающихся методов анализа. Этот метод отличается высокой чувствительностью, что позволяет его использование во многих областях, касающихся биохимии и проте-омики человека, в том числе и токсикологии [1]. Ряд токсикологических задач, в которых масс-спектрометрия может являться основным, или даже единственным, средством решения, весьма широк, и особое внимание уделяется такой значимой области, как поиск биомаркеров интоксикации [2].
Соответственно существует необходимость разработки нового чувствительного метода выявления биомаркеров интоксикации ОВ, не требующего трудоемкой пробоподготовки и позволяющего быстро и надежно фиксировать факт воздействия ОВ. К таким биомаркерам в первую очередь относятся белки и пептиды, входящие в состав крови, которые способны образовывать аддукты с ОВ.
В последнее время появляются работы, в которых проводится поиск аддуктов различными ОВ с белками, например фосфорорганическими соединениями с сывороточным альбумином человека и крысы, методами масс-спектрометрии. В частности, такие работы проводились в группе Оксаны Локридж (Eppley Institute and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nebraska Medical Center), в которых коммерческие препараты сывороточного альбумина человека обрабатывали ФОС [3, 4]. Было показано, что основными мишенями для присоединения остатка ФОС в сывороточном альбумине человека являются пять тирозинов в положениях Y138, Y148, Y401,
Y411, Y452, а также два серина S232 и S287. Аддукты ФОС с сывороточным альбумином человека являются стабильными в условиях in vitro в течение нескольких месяцев [5].
Выявление интоксикации такими соединениями, как сернистый иприт (по международной номенклатуре HD), в настоящее время ведется методами, предполагающими сложную многоэтапную пробоподготовку [6]. Известно, что методами MALDI-TOF и ESI-TOF могут быть обнаружены алкилированные триптические пептиды сывороточного альбумина, которые содержат ковалент-ную модификацию с остатком сернистого иприта [7, 8]. Исследование аддуктов сывороточного альбумина с HD представляется эффективным ввиду того, что альбумин является основным компонентом белкового пула плазмы и сыворотки крови человека. Концентрация сывороточного альбумина в плазме или сыворотке крови составляет от 40 до 50 мг/мл (600-770 мкМ). Остальные белки представлены в более низких концентрациях. Это позволяет обнаружить соединения HD—альбумин без отделения от остальных белков плазмы. Период полужизни этого белка составляет ~25 дней, что позволяет проводить ретроспективную диагностику в течение нескольких недель после воздействия ОВ [9]. Альбумин имеет сложную третичную структуру, т. к. помимо водородных связей в молекуле также присутствуют так называемые дисульфидные мосты. Поэтому при проведении ферментативного гидролиза стандартной является методика с восстановлением дисульфидных связей дититреитолом ДТТ и модифицирование цистеинов йодацетамидом. Такая методика не подходит для обнаружения аддуктов с HD, т. к. происходит замещение остатка последнего. В результате отказа от использования йодацетамида
проведение трипсинолиза значительно затрудняется. Поэтому возникает необходимость в обнаружении других белков-маркеров, обладающих более простой структурой.
Соответственно большой интерес для обнаружения аддуктов с HD может вызывать гемоглобин. Химически гемоглобин относится к группе хро-мопротеидов. Молекула гемоглобина состоит из белковой части — глобина и простетической группы небелковой природы — гема, в состав которого входит железо. Гемоглобин — основной белок эритроцитов, который также способен образовывать ковалентные аддукты с сернистым ипритом, сохраняющиеся на протяжении всего времени жизни белка [10]. Концентрация гемоглобина в крови составляет от 140 до 160 мг/мл. Среднее время жизни эритроцитов в организме составляет 3-4 месяца, что может позволить проводить ретроспективную диагностику в течение нескольких месяцев [11, 12]. В отличие от альбумина в глобине нет дисульфидных связей, что значительно облегчает проведение ферментативного гидролиза в случае, когда невозможно использовать методику с модифицированием йодацетамидом.
Основной целью настоящей работы было исследование формирования аддуктов глобина крысы с сернистым ипритом в условиях in vitro и выявление остатков аминокислот глобина, по которым возможно присоединение сернистого иприта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение глобина крысы: см. соответствующий раздел в [13].
Инкубирование выделенного глобина с HD:
та же методика инкубирования относительно HD,
что и описанная в [13] относительно ацетилсалициловой кислоты.
Получение триптических гидролизатов глобина крысы: см. соответствующий раздел в [13].
Масс-спектрометрический анализ методом MALDI-TOF: см. соответствующий раздел в [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что сернистый иприт взаимодействует с сульфгидрильными группами аминокислот, входящих в состав белков. Наибольшей чувствительностью к HD обладает аминокислота цистеин. В результате взаимодействия HD с цистеином происходит алкилирование последнего, и после взаимодействия с белком остаток HD гидролизу-ется до остатка тиодигликоля (рис. 1). Можно было ожидать, что при добавлении HD к раствору глобина in vitro масса белка изменится соответственно количеству присоединенных остатков HD. Были получены спектры цельных белков в линейном режиме. На рис. 2 видно, что в пробе, инкубированной с ипритом, появляются сигналы, смещенные в область больших масс по сравнению с контролем примерно на 100 и 200 Да. Наблюдаемое смещение подтверждает возможность присоединения иприта к глобину.
Для поиска аминокислот, модифицированных остатком HD, был проведен триптический гидролиз без восстановления дисульфидных связей с последующим масс-спектрометрическим анализом. Идентификация, проведенная методом PMF (белковая база данных SwisProt, программный комплекс MASCOT, URL: matrixscience.com),
Рис. 1. Схема присоединения иприта к цистеину
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АЛКИЛИРОВАННЫХ АДДУКТОВ ГЛОБИНА КРЫСЫ.
79
%lnt. 100 90
80
70
60
50
40
30
20
10 0
15977.39
бета субъеднница
альфа субъеднница
15324.83
К:-' б 100
15323.29
90
80
70
60
50
40
30
20
10 0
альфа
суоъедннина
бета субьединица + HD
16109.69
Ги'тп
i л п i,. inmii.i
2HD
15000
15500
16000
16500
15000
15500
16000
16500
mfz
т/г
Рис. 2. Масс-спектры цельных альфа- и бета-субъединиц глобина крысы. а — контроль, б — белок, инкубированный с ипритом
Табл. 1. Результаты идентификации PMF
показала, что в образце содержится смесь альфа- и бета-субъединиц глобина (табл. 1), причем все мажорные сигналы в масс-спектре принадлежат именно триптическим пептидам указанных белков. Затем в масс-спектрах проводился поиск сигналов, которые по значению массы отличались бы от триптических пептидов на величину, соответствующую массе остатка HD (104.02 Да).
Так, был обнаружен ряд сигналов с МН+ 1444.62, 1561.66 и 1676.76 Да, которые могли принадлежать модифицированным пептидам, входящим в состав глобина, что продемонстрировано на рис. 3. Сигналы с МН+ 1444.62 и 1561.66 Да соответствуют пептидам EFTPCAQAAFQK (1340.63 Да) и GTFAHLSELHCDK (1457.68 Да) бета-субъединицы глобина крысы (рис. 3, а, б), а сигнал
с MH+ 1676 Да — пептиду IGGHGGEYGEEALQR (1572.74 Да), принадлежащему альфа-субъединице глобина крысы (рис. 3, в), модифицированным одним остатком HD. Стоит отметить, что для одного из трех сигналов в масс-спектре наблюдается предшественник (рис. 3, в). Это позволяет сделать предположение, что при высоких концентрациях HD пептиды, сигналы которых представлены на рис. 3, а и б, модифицируются полностью.
Для каждого обнаруженного сигнала был проведен (МС-МС)-анализ, который показал, что сигналы действительно принадлежат триптическим пептидам глобина, модифицированным остатками HD. С помощью программы Sequence Viewer 2.0 (ИАП РАН) были размечены спектры фрагмент-ных ионов, что позволило точно установить ами-
а
нокислотную последовательность проанализированных пептидов и доказать, что сигналы принадлежат пептидам, описанным выше. Кроме того,
были установлены аминокислоты, содержащие модификацию остатком HD. Результаты представлены в табл. 2 и на рис. 4.
%1п1
т/г
Рис. 3. Общий масс-спектр триптического гидролизата глобина крысы, инкубированного с ипритом. а — область 1340-1450 Да; б — область 1480-1570 Да; в — область 1570-1680 Да
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АЛКИЛИРОВАННЫХ АДДУКТОВ ГЛОБИНА КРЫСЫ. Табл. 2. Выявленные пептиды, модифицированные ипритом
Пептид Масса MH+, Да Масса (МН+ + +HD), Да (теор.) Масса (МН+ + +HD), Да (экспер.) Место присоединения HD Субъединица
EFTPCAQAAFQK 1340.63 1444.65 1444.62 С126 Бета
GTFAHLSELHCDK 1457.68 1561.70 1561.66 С93 Бета
IGGHGGEYGEEALQR 1572.74 1676.76 1676.78 Е27 Альфа
а
m / z
б
m / z
в
m / z
Рис. 4. МС-МС-спектры пептидов, модифицированных ипритом, представленные в программе Sequence Viewer 2.0.
а — пептида EFTPCAQAAFQK, входящего в состав субъединицы бета глобина крысы, модифицированного по С126; б — пептида GTFAHLSELHCDK, входящего в состав субъединицы бета глобина крысы, модифицированного по С93; в — пептида IGGHGGEYGEEALQR, входящего в состав субъединицы альфа глобина крысы, модифицированного по Е27
Как показано на рис. 4, а, разница масс между ионами Ь4 и Ь5 соответствует массе остатка цис-теина, модифицированного остатком HD, входящего в состав пептида EFTPСHDAQAAFQK. Разница масс между ионами Ь10 и Ь11 на рис. 4, б, также соответствует массе остатка цистеина, несущего модификацию HD в пептиде GTFAHLSELHCнDDK.
В пептиде IGGHGGEYGEHDEALQR остаток HD присоединяется к глутаминовой кислоте (Е), находящейся в положении 27, что видно из соответствующей разницы масс между сигналами фрагментных ионов у5 и уб.
Таким образом, в результате данной работы были получены новые данные о сайтах присоединения HD к глобину; было показано, что глобин крысы может нести модификации в субъединице альфа на глутаминовой кислоте в положении 27 и в субъединице бета на цистеинах в положениях 93 и 126.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Подольская Е.П., Бабаков В.Н. Масс-спектро-метрия с мягкими методами ионизации в токсикологическом анализе // Научное приборостроение. 2008. Т. 18, № 4. C. 5-12.
2. Smith W.J., Salem H. Biomarkers of chemical warfare agents // Toxicologic biomarkers / Ed. A.P. DeCaprio. NY: Taylor and Francis, 2006. 312 p.
3. Peeples E.S., Schopfer L.M., Duysen E.G., et al. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry // Toxico-logical sciences. 2005. V. 83. P. 303-312.
4. Li B., Schopfer L.M., Hinrichs S.H., Masson P., Lock-ridge O. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry assay for organo-phosphorus toxicants bound to human albumin at Tyr411 // Analytical Biochemistry. 2007. V. 361. P. 263-272.
5. Ding S.-J., Carr J., Carlson J.E., et al. Five tyrosines and two serines in human albumin are labeled by the organophosphorus agent FP-Biotin // Chem. Res. Toxicol. 2008. V. 21. P. 1787-1794.
6. Fidder A., Noort D., De Jong L.P.A., et al. N7-(2-Hydroxyethyl-thioethyl)-guanine: a novel urinary metabolite following exposure to sulfur mustard // Arch. Toxicol. 1996. V. 70. P. 854-855.
7. Thong-Hiang Y., Mer-Lin H., Weng-Keong L. Development of a liquid chromatography-multiple reaction monitoring procedure for concurrent verification of exposure to different forms of mustard agents // Journal
of Anal. Toxicol. 2008. V. 32, N 1. P. 51-56.
8. Noort D., Hulst A.G., De Jong L.P.A., Benschop H.P. Alkylation of human serum albumin by sulfur mustard in vitro and in vivo: mass spectrometric analysis of a cysteine adduct as a sensitive biomarker of exposure // Chem. Res. Toxicol. 1999. V. 12. P. 715-721.
9. Краснов И.А., Подольская Е.П., Гончаров Н.В. и др. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии // Научное приборостроние. 2008. Т 18, № 4. C. 46-53.
10. Hambrook J.L., Howells D.J., Schock C. Biological fate of sulfur mustard (l,l'-Thiobis(2-chloroethane)): uptake, distribution and retention of 35S in skin and in blood after cutaneous application of 35S-sulfur mustard in rat and comparison with human blood in vitro // Xenobiotica. 1993. V. 23. P. 537-561.
11. Tornqvist M., Fred C., Haglund J., et al. Protein ad-ducts: quantitative and qualitative aspects of their formation, analysis and applications // J. Chromatogr. B. 2002. V. 778. P. 279-308.
12. Boogaard P.J. Use of haemoglobin adducts in exposure monitoring and risk assessment // J. Chromatogr.
B. 2002. V. 778. P. 309-322.
13. Дубровский Я.А., Гладилович В.Д., Подольская Е.П. и др. Взаимодействие глобина крысы и человека с ацетилсалициловой кислотой in vitro: масс-спектро-метрическая идентификация ацетилированных ли-зинов // Научное приборостроние. 2010. Т. 20, № 4.
C. 71-76.
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург (Дубровский Я.А., Подольская Е.П., Краснов И.А., Гладилович В.Д., Краснов Н.В.)
ФГУП "Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека" ФМБА России, Санкт-Петербург (Войтенко Н.Г., Бабаков В.Н., Гончаров Н.В.)
Контакты: Дубровский Ярослав Александрович, j ar. chem@mail. ru
Материал поступил в редакцию 17.09.2010.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АЛКИЛИРОВАННЫХ АДДУКТОВ ГЛОБИНА КРЫСЫ.
83
IDENTIFICATION OF ALKYLATED ADDUCTS OF RAT GLOBIN BY MALDI-TOF MASS SPECTROMETRY
Ya. A. Dubrovsky1, E. P. Podolskaya1, N. G. Voitenko2, I. A. Krasnov1, V. D. Gladilovich1, V. N. Babakov2, N. V. Goncharov2, N. V. Krasnov1
1 Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg
2Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, Saint-Petersburg
The covalent adducts formation of sulfur mustard (HD) with rat globin have been investigated in vitro. A number tryptic peptides of rat globin, namely EFTPChdAQAAFQK (1444.62 Da), GTFAHLSELHChdDK (1561.66 Da), IGGHGGEYGEhdEALQR (1676.78 Da) alkylated with HD were identified by MALDI-TOF mass-spectrometry on globin amino acid residues C126, C93 and E27, respectively.
Keywords: hemoglobin, sulfur mustard, adducts, mass-spectrometry, MALDI-TOF
