CC BY
63Хронический эндометрит. Подходы к диагностике и терапии
Н.М.Калинина^
ФГБУ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова МЧС России. 194044, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2
Одной из причин нарушения репродуктивной функции является хронический активный эндометрит. Данные гистологического исследования био-птатов эндометрия позволяют поставить диагноз «хронический эндометрит» (ХЭ), оценить активность процесса. Иммуногистохимическое исследование биоптатов позволяет уточнить характер иммунологических нарушений при ХЭ и выделить группу пациенток с аутоиммунным воспалением и аутоиммунным ответом в эндометрии (аутоиммунном эндометритом). Исследование в периферической крови популяций натуральных киллеров, В1 -и В2-клеток, В-клеток памяти, изучение цитотоксической активности клеток с киллерным потенциалом позволяют мониторировать результаты проводимой иммунотропной терапии без применения на этом этапе повторных биопсий эндометрия.
Результаты, представленные в статье, подтверждают эффективность использования Полиоксидония в терапии ХЭ и восстановлении репродуктивной функции.
Ключевые слова: хронический эндометрит, биопсия, иммуногистохимия, нарушение репродуктивной функции, проточная цитометрия, имму-
нотропнаятерапия, Полиоксидоний.
Для цитирования: Калинина Н.М. Хронический эндометрит: подходы к диагностике и терапии. Consilium Medicum. 2015; 17 (6): 77-80.
Chronic endometritis. Approaches to diagnosis and treatment
N.M.Kalinina^
A.M.Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine. 194044, Russian Federation, Saint Petersburg, ul. Akademika Lebedeva, d. 4/2
Chronical endometritis (СЕ) is responsible for women infertility. Investigation of histological data of endometrial target biopsy permit to diagnose the CE and
elicit activity of inflammation immunohistochemical study of biopsy permit to define more exactly nature of СЕ, specify local immunological disturbances,
distinguish the patients with autoimmune inflammation and local autoimmune answer. Subsets definition of natural killer (NK) cells, B1 -, B2-cells, memory
B-cells in the peripheral blood, NK, TNK, T-cells cytotoxicity study permit realize monitoring of immune therapy without repeated biopsy realization.
Presented data confirm efficiency of Polyoxidonium (azoximer bromide) in therapy of СЕ and fertility reconstruction.
Key words: chronical endometritis, biopsy, immunohistochemistry, infertility, flow cytometry immunotherapy, Polyoxidonium.
For citation: Kalinina N.M. Chronic endometritis. Approaches to diagnosis and treatment. Consilium Medicum. 2015; 17 (6): 77-80.
Диагноз «хронический эндометрит» (ХЭ) является прежде всего гистологическим диагнозом, который ставится морфологами при взятии биопсии эндометрия и характеризуется инфильтрацией стромы эндометрия мо-нонуклеарными клетками.
Клинически ХЭ часто протекает бессимптомно и становится причиной нарушения репродуктивной функции. По данным разных авторов, ХЭ диагностируется у 12-46% пациенток с бесплодием, у 30% женщин с неудачами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и у 12% больных с привычным невынашиванием беременности [1-4].
Внедрение в лабораторную диагностику ХЭ метода им-муногистохимии с использованием разных по своей направленности моноклональных антител (С016, С056, С020, С0138) позволило оценить активность иммунного воспаления, характер нарушений местного иммунитета эндометрия и более эффективно применять иммунотроп-ную терапию. В связи с этим целью настоящего исследования стало сравнение нарушений параметров местного иммунитета эндометрия и системного иммунитета в динамике до и после применения в схеме иммунотропной терапии [5-7].
Материалы и методы
В ходе многолетнего наблюдения за пациентками с ХЭ удалось выделить несколько типов отклонений в параметрах локального и системного иммунного ответа, сопровождающихся нарушением репродуктивной функции. Для адекватной оценки обнаруживаемых нарушений была сформирована контрольная группа женщин детородного возраста, у которых при выяснении причин отсутствия беременностей ХЭ и другие гинекологические заболевания были исключены (п=24):
• 1-я группа - вошли 47 пациенток с хроническим активным эндометритом (ХАЭ), нарушением репродуктивной функции, из них 22 были с повторными не-
удачными ЭКО (отсутствие имплантации эмбрионов), 7 женщин - с привычным невынашиванием беременности (прерывание возникало при сроках 5-6 нед) и 18 - с первичным бесплодием и на момент обследования без эпизодов ЭКО в анамнезе;
• 2-я группа - вошли 36 женщин с аутоиммунным эндометритом, нарушением репродуктивной функции и наличием аутоиммунного воспаления и аутоиммунного характера ответа, который был диагностирован в ходе иммунологического обследования.
Для исследования параметров местного иммунитета методом иммуногистохимии применялись моноклональные антитела фирмы «Новокастра» (Великобритания), направленность которых позволяла выявлять 2 популяции натуральных киллеров (КК): СБ56Ьг'8Ь1 и СБ16Ьг'8Ь1, В-клетки (С020) и плазматические клетки - С0138. Выбор моно-клональных антител определялся в том числе появившимися публикациями, которые указывают на важную роль этих субпопуляций мононуклеаров в поддержании нарушений репродуктивной функции [1, 8]. Подсчет лимфоцитов осуществлялся в световом микроскопе при увеличении - х400 в трех полях зрения. Статистическую значимость различий определяли с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05.
Параметры системного иммунитета исследовались методом проточной цитометрии с применением «гейтирова-ния» по С045, двухпараметрических гистограмм и трехцветного анализа лимфоцитов соответствующими моно-клональными антителами [5].
Результаты и обсуждение
Результаты иммуногистохимического анализа параметров местного иммунитета эндометрия в контрольной группе на 22-й день цикла представлены в табл. 1.
Результаты исследования показывают, что в эндометрии на 22-й день цикла при отсутствии эндометрита и других
CONSILIUM MEDICUM 2015 | VOL. 17 | NO. 6
77
Таблица 1. Показатели местного иммунитета эндометрия на 22-й день цикла в контрольной группе
Показатели С056М9М С016Ьг|8М1 СЭ20 СЭ138
Контрольная группа (п=24) 3,4±0,7 4,2±0,8 1,3±0,3 0
Таблица 2. Распределение популяций МК в ПК женщин
контрольной группы (п=24)
0056+0016- (0056»™"') 2,52±0,6
0056-0016+ (0016»™"') 4,28±0,9
0056+0016+ 87,5±17,0
Таблица 3. Определение цитотоксической активности естественных МК в контрольной группе (п=24) по экспрессии СЭ 107а на МК-клетках [СЭ3-СЭ(16+56)+]
Спонтанная экспрессия 2,06±0,9
Стимулированная экспрессия 17,27±1,4
Индекс стимуляции 8,7±1,3
Таблица 4. Субпопуляции В-лимфоцитов в ПК в контрольной группе
Субпопуляции В-лимфоцитов Контрольная группа (п=24)
0019, % от общего количества В-клеток 10,8±1,6
0019, кл/мкл 368±42
0019+0027+, % от общего количества В-клеток памяти 5,0±1,5
0019+0027+, кл/мкл 165±35
0019+005+, % В1-аутореактивных В-лим-фоцитов 2,8±0,3
0019+ 005+, кл/мкл 79±11
005+0027+, % от В-лимфоцитов, ауторе-активные В-лимфоциты 3,0±0,4
005+0027+, кл/мкл 9,0±1,0
Таблица 5. Результаты сравнения изученных показателей местного иммунитета эндометрия в норме и при ХАЭ, осложнившимся нарушением репродуктивной функции
Показатели СЭ56ЬГ'3Ь1 С016Ьг|5М1 СЭ20 СЭ138
Контрольная группа (п=24) 3,4±0,7 4,2±0,8 1,3±0,3 0
Группа с ХАЭ (п=47) 18,1 ±3,6* 56,1 ±11,2* 3,3±2,1 0
*р<0,05.
Таблица 6. Количество лимфоцитов СЭ16+,
СЭ56+ (СЭ3-СЭ19-) в ПК в норме и в группе с ХАЭ
Контроль Группа с ХАЭ
(п=24) (п=47)
0056+0016-(0056»г'9"') 2,52±0,3 5,9±1,5
0056-0016+(0016»г'9"') 4,28±0,5 16,7±2,7*
0056+0016+ 87,5±7,0 77,4±10,3
*р<0,05.
Таблица 7. Определение цитотоксической активности естественных киллерных клеток в норме и при ХАЭ по экспрессии СЭ107а на МК-клетках [СЭ3-СЭ(16+56)+]
Контроль (п=24) Группа с ХАЭ (п=47)
Спонтанная экспрессия 2,06±0,9 5,6±0,5*
Стимулированная экспрессия 17,27±1,4 12,9±1,7
Индекс стимуляции 8,7±1,3 2,6±0,3*
*р<0,05.
Таблица 8. Спонтанная продукция провоспалительных цитокинов МНПК у пациенток с ХАЭ в сравнении с контрольной группой
Спонтанная продукция цитокинов МНПК, пг/мл Контроль (п=24) Группа с ХАЭ (п=47)
ИФН-у 20±5 60±23
ИЛ-6 35±7 100±32
ФНО-а 33±12 125±30
Таблица 9. Результаты иммуногистохимического исследования
Показатели СЭ56 СЭ16 СЭ20 СЭ138
Контрольная группа (п=24) 2,4±0,2 2,5±0,2 2,3±0,1 0
Группа с АИЭ (п=36) 16,1±1,9* 23,1±3,2* 32,3±2,1* 8,5±1,5*
*р<0,05.
Таблица 10. Количество В-лимфоцитов, аутореактивных В-лимфоцитов, В-лимфоцитов памяти, аутореактивных В-лимфоцитов памяти в ПК в норме и при АИЭ
Контрольная группа (п=24) Группа с АИЭ (п=36)
0019+005+, % 2,8±0,3 5,9±0,7*
0019+005+, кл/мкл 79±11 212±25*
005+0027+, % от В-лимфоцитов 3,0±0,4 4,4±0,5
005+0027+, кл/мкл 9,0±1,0 36±4*
*р<0,05.
гинекологических заболеваний количество мононуклеа-ров, инфильтрирующих эндометрий, минимально [3, 9].
При параллельном исследовании в периферической крови (ПК) КК в контрольной группе было обнаружено (табл. 2), что на большей части КК в ПК экспрессированы как С016-, так и С05б-рецепторы, т.е. функционально детерминированные КК составляют не более 7%.
Была также оценена функциональная (киллерная) активность изученных в ПК клеток.
При оценке в контрольной группе функциональной активности естественных КК методом проточной цитометрии было установлено (табл. 3), что при стимуляции количество клеток, экспрессирующих С0107а, возрастает более чем в 8 раз.
Представлялось важным с использованием метода проточной цитометрии оценить все субпопуляции В-лимфо-цитов (общее количество В-клеток В1-, В2-субпопуляции, В1- и В2-клеток памяти) в контрольной группе. Данные изучения представлены в табл. 4.
Результаты, полученные в группе женщин без гинекологических и других хронических заболеваний, укладывают-
ся в референсные значения, приводимые другими авторами [4, 9-11].
Результаты сравнения параметров местного иммунитета эндометрия пациенток контрольной группы и аналогичных параметров у женщин с ХАЭ представлены в табл. 5.
Как видно из данных, представленных в табл. 5, нарушения параметров местного иммунитета в 1-й группе характеризовались достоверным повышением количества клеток, инфильтрирующих эндометрий с маркерами С056Ь"8М, СБ16ЬГ'8Ь1. Учитывая, что СБ5бЬг'8Ь1-лимфоциты ответственны за продукцию провоспалительных цито-кинов, а С01бЬ"8*"-лимфоциты обладают выраженным цитотоксическим (киллерным) потенциалом, можно предположить, что в случае наступления физиологической беременности или при переносе эмбриона в ходе ЭКО эти клетки в связи с различиями генотипов супругов по системе ЫЬЛ и кодоминантным типам наследования определяют эмбрион наполовину «чужим». Эмбрион будет подвергаться иммунологической «атаке» обоих ти-
78
СОШШМ МЕРКиМ 2015 | ТОМ 17 | №6
пов киллеров, которые, используя разные механизмы, будут способствовать прерыванию беременности [12, 13].
При параллельном исследовании параметров системного иммунитета в группе обследованных женщин с нарушением репродуктивной функции было установлено увеличение терминально дифференцированных натуральных киллеров, причем если отмечалась тенденция к увеличению С056Ь"8*"-клеток, то 4-кратное увеличение клеток с фенотипом С016Ь"8*", обладающих выраженным киллерным потенциалом, было достоверным (табл. 6).
Цитотоксическая (киллерная) активность КК-клеток определяется по экспрессии на мембране маркера С0107а [14]. При исследовании методом проточной цитометрии спонтанной и индуцированной экспрессии С0107а (с применением клеток перевиваемой линии К-562) было выявлено достоверное повышение количества клеток, спонтанно экспресси-рующих маркер С0107а в группе с ХАЭ, в связи с чем индекс стимуляции в группе лиц с ХАЭ был достоверно снижен (табл. 7).
При исследовании субпопуляций В-клеток в ПК - общей популяции В-клеток - С019+, В-клеток памяти -С019+С027+, аутореактивных В-лим-фоцитов - С019+С05+, аутореактивных В-клеток памяти - С05+С027+ достоверных отличий показателей в группе с ХАЭ от контрольной группы обнаружено не было.
Наличие системного иммунного воспаления, активации клеток ПК в группе женщин с ХАЭ подтверждалось достоверным повышением спонтанной продукции мононуклеарами ПК (МНПК) провоспалительных ци-токинов (табл. 8).
Учитывая выявленные нарушения параметров местного и системного иммунитета у женщин с ХАЭ, в качестве препарата выбора для терапии этих нарушений назначался Полиоксидоний®. Как известно, Полиоксидоний® наряду с иммуномодулирующим действием обладает антиоксидантной активностью, стабилизирует мембраны клеток, уменьшает токсическое действие других лекарственных препаратов.
Терапия Полиоксидонием в дозе 12 мг в суппозиториях (ректально или вагинально) осуществлялась в течение месяца - 15 введений через день. Результатом проведенной терапии Полиоксидонием стала нормализация показателей системного иммунитета:
1) соотношение субпопуляций КК-клеток приблизилось к группе контроля;
2) цитотоксическая активность КК-клеток снизилась и пришла в норму;
3) уменьшилась спонтанная продукция провоспалительных цитоки-нов (фактора некроза опухоли а - ФНО-а, интерлейкина-6 -ИЛ-6, интерферона-у - ИФН-у).
У 19 из 47 женщин в последующем наступила беременность (40,4%).
Особую группу составили пациентки, у которых сформировался аутоиммунный эндометрит (АИЭ), характерными чертами которого стало повышение количества В-лимфоцитов и плазматических клеток в эндометрии с последующим формированием аутоантител. Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия отличались достоверным повышением не только клеток-киллеров, но и В-лимфоцитов и плазматических клеток (табл. 9).
При исследовании субпопуляций В-лимфоцитов ПК у пациенток этой группы обнаружено достоверное увеличение количества аутореактив-ных В-лимфоцитов с фенотипом С019+С05+ и аутореактивных В-лимфоцитов памяти С05+С027+ (табл. 10).
Учитывая особенности данной группы пациенток и имеющиеся показания для применения Полиокси-дония при аутоиммунных воспалительных заболеваниях, женщинам этой группы была назначена следующая терапия:
• Полиоксидоний® 6 мг внутримышечно через 2 дня на 3-й, всего 15 инъекций.
• Кроме этого, Метипред 4 мг в течение месяца в 1-й половине дня.
В результате проведенной терапии показатели ПК, оценивающие субпо-
пуляции В-лимфоцитов, пришли в норму, как, впрочем, и субпопуляции NK и их цитотоксическая активность. Клиническим результатом было наступление беременности у 12 из 36 женщин (33,3%).
Таким образом, исследование в ПК популяций NK, В-кле-ток, изучение цитотоксической активности NK-клеток позволяет мониторировать результаты проводимой имму-нотропной терапии без использования на данном этапе повторных биопсий эндометрия [13].
Полученные клинические результаты подтверждают эффективность применения препарата Полиоксидоний® в лечении ХЭ не только в качестве иммунотропной терапии для улучшения результатов лечения хронических воспалительных заболеваний половых органов, но и для восстановления репродуктивной функции.
Литература/References
1. Михнина Е.А. Морфофункциональное состояние эндометрия у женщин с бесплодием и невынашиванием беременности. Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. 2009. / Mikhnina E.A. Morfofunktsional'noe sostoianie endometriia u zhenshchin s besplodiem i nevynashivaniem beremennosti. Avtoref. dis. ... d-ra med. nauk. 2009. [in Russian]
2. Clifford K, Flanagan AM, Regan L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Hum Reprod 1999; 14: 2208-13.
3. Park DW, Lee HJ, Park CW et al. Peripheral blood NK cells reflect changes in decidual NK cells in women with recurrent miscarriages. Am J Reprod Immunol 2010; 63: 173-80.
4. Van den HM, Peralta C, Bachar S et al. Trafficking of peripheral blood CD56 (*) cells to the decidualizing uterus - new tricks for old dogmas? J Reprod Immunol 2005; 67: 21-34.
5. Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А. Проточная цитомет-рия в медицине и биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2014. / Zurochka A.V., Khaidukov S.V., Kudriavtsev I.V., Chereshnev VA. Protochnaia tsitometriia v meditsi-ne i biologii. Ekaterinburg: RIO UrO RAN, 2014. [in Russian]
6. Cooper MA, Fehniger TA, Turner SC et al Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood 2001; 97: 3146-51.
7. Fukui A, Funamizu A, Yokota M et al. Uterine and circulating natural killer cells and their roles in women with recurrent pregnancy loss, implantation failure and preeclampsia. J Reprod Immun 2011; 90: 105-10.
8. Horne AW, Stock SJ, King AE. Innate immunity and disorders of the female reproductive tract. Reproduction 2008; 135: 739-49.
9. Manaster I, Mandelboim O. The unique properties of uterine NK cells. Am J Reprod Immunol 2010; 63: 434-44.
10. Lee SK, Kim CJ, Kim D-J, Kang J-H. Immune cells in the female reproductive tract. Immune Network 2015; 1: 16-26.
11. Sentman CL, Wira CR, Eriksson M. NK-cell function in the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol 2007; 57: 108-15.
12. Carp JA, Selmi C, Shoenfeld Y. The autoimmune bases of infertility and pregnancy loss. J Autoimmun 2012; 38: 266-74.
13. Givan AL, White HD, Sterm JE et al. Flow cytometric analysis of leucocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol 1997; 38: 350-9.
14. Бычкова Н.В. Анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии. Возможности применения в клинической практике. Тверь: Триада, 2015. / Bychko-va N.V. Analiz soderzhaniia DNK metodom protochnoi tsitometrii. Vozmozhnosti primeneniia v klinicheskoi praktike. Tver': Triada, 2015. [in Russian]
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ
Калинина Наталия Михайловна - д-р мед. наук, проф., клин. иммунолог, гл. науч. сотр. отд. лабораторной диагностики, проф. каф. терапии и интегративной медицины ИДПО Экстремальная медицина ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М.Никифорова МЧС России, . E-mail: [email protected]
80
CONSILIUM MEDICUM 2015 | ТОМ 17 | №6
