CC BY
50
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616.98:579.841.95+579.841.93
А.Н.Малахаева, О.Ю.Ляшова, О.П.Плотников, А.В.Осин
ХРАНЕНИЕ ШТАММОВ FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ И BRUCELLA ABORTUS 19 ВА В ЖИЗНЕСПОСОБНОМ СОСТОЯНИИ ПУТЕМ ИХ ГЛУБОКОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,
Российская Федерация
В работе дана характеристика методов хранения микроорганизмов в различных условиях в жизнеспособном состоянии в течение двух лет. Проведено сравнение выживаемости тест-штаммов возбудителей туляремии и бруцеллеза (на примере Francisella tularensis 15 НИИЭГ и Brucella abortus 19 ВА) при хранении на питательных средах при температурах от 0 до +8 °С и минус 70 °С в течение одного года наблюдения. Дана оценка жизнеспособности вакцинных штаммов при хранении при температуре минус 70 °С в течение двух лет наблюдения. Установлено, что наиболее оптимальными средами для хранения вышеуказанных микроорганизмов без изменения их морфологических признаков при температуре минус 70 °С являются СЖА и бульон Альбими с 10 % глицерином. Показано, что в рабочих коллекциях более эффективно консервировать микроорганизмы методом низкотемпературного замораживания.
Ключевые слова: патогенные биологические агенты (ПБА), Francisella tularensis, Brucella abortus, лиофилиза-ция, криоконсервация, низкотемпературное замораживание.
A.N.Malakhaeva, O.Yu.Lyashova, O.P.Plotnikov, A.V.Osin
Maintenance of Francisella tularensis 15 RIEH and Brucella abortus 19 BA Strains in a Viable State by Means of Deep Freezing
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Assessed are the methods for storage of microorganisms in a viable state under various technological conditions for a period of two years. Compared is the survivability of the test-strains of tularemia and brucellosis agents (exemplified by Francisella tularensis 15 RIEH and Brucella abortus 19 BA) when stored on the nutrient media at temperatures raging 0 °C up +8 °C and at -70 °C for over a year. Made has been an estimate of survivability of the vaccine strains stored at -70 °C within two years term. It is determined that optimum media for storing the stated above microorganisms with no changes in their morphological characteristics at -70 °C are sucrose-gelatin agar and Albimi broth with 10 % glycerin. Demonstrated is the fact that it is more efficient to conserve microorganisms stored in working collections by way of deep freezing.
Key words: pathogenic biological agents (PBA), Francisella tularensis, Brucella abortus, liophilization, cryo-conservation, low-temperature freezing.
Как известно, туляремия и бруцеллез относятся к зоонозным инфекциям и остаются одной из основных проблем инфекционной патологии человека в России. Это подтверждается постоянным выделением штаммов из природных очагов и регистрацией спорадических или групповых случаев заболевания людей [1, 4]. Основными причинами заражения людей являются нарушения санитарно-гигиенических и ветеринарных правил, несвоевременное выявление больных людей и животных и их изоляция. Частота плановых обследований зависит от эпизоотической ситуации. Результаты обследования объекта доводят до администрации для принятия соответствующих мер.
одним из обязательных этапов лабораторной диагностики туляремии и бруцеллеза является проведение бактериологического анализа. В соответствии с МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для
возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза» качество питательных сред, использующихся для исследования, должно быть проверено с помощью контрольных тест-штаммов [2]. При контроле диагностических питательных сред для возбудителей туляремии и бруцеллеза применяется ряд тест-штаммов, наиболее востребованными из которых являются F. tularensis 15 НИИЭГ и B. abortus 19 ВА, поскольку, в отличие от своих вирулентных аналогов, относятся к III группе патогенности и могут использоваться в бактериологических лабораториях различного уровня, при наличии соответствующего санитарно-эпидемиологического заключения.
Сохранение микроорганизмов в жизнеспособном состоянии в течение длительного времени является одной из важных проблем микробиологии. От умения культивировать и сохранять в жизнеспособном состоянии бактерии в лабораторных условиях в зна-
чительной степени зависят успехи микробиологов в изучении патогенных биологических агентов (ПБА).
В последние годы в большинстве коллекций микроорганизмов используют методы лиофилиза-ции, криоконсервации и низкотемпературного замораживания [5]. Во всех случаях выбор способа консервирования конкретного объекта основывается на сохранении микроорганизмами жизнеспособности, морфологических признаков, физиологических характеристик, биохимической активности и генетической стабильности. При этом учитывается максимально возможное время хранения культуры, а также надежность реализации данного метода консервации и требования по обслуживанию в течение длительного времени. Культуры микроорганизмов, подготавливаемые к консервации, должны выращиваться в оптимальных условиях. Состав среды выращивания, температура, условия аэрации и другие факторы оказывают существенное влияние на устойчивость микроорганизма к стрессам, возникающим при длительном хранении (лиофилизации, криоконсервации или замораживании).
сущность метода лиофилизации заключается в высушивании культур под вакуумом при низких температурах (минус 20 - минус 40 °C). Лиофилизированные культуры, если их хранить без доступа кислорода, влаги и света при пониженных температурах (от 0 до +8 °С), могут храниться в течение длительного времени - 50 лет наблюдения [3].
В настоящее время большое внимание уделяется методу криоконсервации (от греч. крбод - холод и лат. conservo - сохраняю) - низкотемпературному хранению живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания. Время хранения в жидком азоте крио-консервированных микроорганизмов и других биологических объектов в стабильном и жизнеспособном состоянии практически не ограничено [5].
Для криозащиты плохо переносящих замораживание микроорганизмов применяют различные крио-протекторы: низкомолекулярные вещества (глицерин, димексид, сахарозу и др.), высокомолекулярные соединения (декстран, крахмал, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон и др.), компоненты растительного и животного происхождения (сыворотку крови, желатин, обезжиренное молоко и др.).
Метод криоконсервации, как и метод лиофили-зации, требует специального оборудования, но менее трудоемкий. Во время работы с жидким азотом требуется большая осторожность.
Известны способы длительного хранения микроорганизмов при низких температурах от минус 20 до минус 130 °C. Многие микроорганизмы могут храниться в холодильниках при температуре ниже минус 60 °C с сохранением высокого титра жизнеспособных клеток. Однако в коллекциях микроорганизмов, в том числе международных, этот прием используется как один из этапов лиофилизации культур [5]. Метод низкотемпературного замораживания также использу-
ется на носителях, что позволяет увеличить срок хранения микроорганизмов до 5 и более лет.
Целью данной работы является создание оптимальных условий для длительного хранения и определения жизнеспособности штаммов возбудителей туляремии и бруцеллеза в условиях низкотемпературного замораживания на примере тест-штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и B. abortus 19 ВА.
Материалы и методы
В работе использованы: штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ и B. abortus 19 ВА; среды хранения: бульон Альбими с 10 % глицерином (рН 7,2), дистиллированная вода с 10 % глицерином (рн 7,2); сахарозо-желатиновый агар - СЖА - (рН 7,2); FT-агар (рН 7,2) и агар Альбими (рН 7,2).
Штаммы со средами хранения в криопробирках CRYO.S™ помещали в низкотемпературную морозильную камеру с температурой минус 70 °С. На каждый штамм брали по три криопробирки на каждую среду (всего 9 криопробирок на каждый штамм).
Штаммы на скошенном агаре (FT-агар и агар Альбими) в пробирках хранили при температуре от 0 до +8 °С.
Учет жизнеспособности (жизнеспособность -процент выросших колоний микроорганизмов от числа засеянных клеток) микроорганизмов проводили путем высева на соответствующие среды для каждого вида через 3, 6, 9, 12 и 24 месяцев из первых образцов. Другие образцы остались на более длительный срок без их вскрытия и подвержения процедуре замораживания-оттаивания. Контролем служили исходные штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ и B. abortus 19 ВА до их глубокого замораживания.
Процент выживаемости микроорганизмов определяли по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятому за 100 %.
Результаты и обсуждение
В соответствии с нормативными актами в научно-экспериментальной деятельности референтные штаммы Francisella tularensis 15 НИИЭГ и Bru-cella abortus 19 ВА широко востребованы при изучении возбудителей туляремии и бруцеллеза. В начале каждого года экспериментаторы должны получать ампулы с лиофилизированной культурой микроорганизмов или чашки с агаром и пробирки со скошенным агаром первой генерации микроорганизмов.
Чашки агаровой культуры выдаются для того, чтобы экспериментаторы оценивали морфологию данного микроорганизма. На питательных средах при температуре от 0 до +8 °с их жизнеспособность сохраняется в течение 3-4 месяцев (хранение на скошенном агаре I генерации). В течение года при пересевах через 2-3 месяца микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность, но все научно-
МИКРОБИОЛОГИЯ
экспериментальные работы ведутся, как правило, со второй генерацией.
Поскольку в рабочих коллекциях у микробиологов в различных лабораториях, имеющих разрешения на работу с микроорганизмами 1-1У групп пато-генности, штаммы хранятся на питательных средах при температуре от 0 до +8 °С, нас интересовал вопрос сохранения жизнеспособных клеток в процессе низкотемпературного замораживания без изменения их культурально-морфологических свойств.
Поддержание культур микроорганизмов регулярными пересевами имеет ряд существенных недостатков: основной из них - возможная утрата ряда морфологических и филогенетических признаков. Кроме того, частые пересевы нередко снижают биохимическую активность культур, повышают опасность контаминирования ее посторонними микроорганизмами. При частых пересевах, особенно на жидких питательных средах, велика вероятность возникновения спонтанных мутантов и их селекция.
Штамм Е tularensis 15 НИИЭГ через 3 месяца хранения на скошенном Ft-агаре при температуре от 0 до +8 °С при высеве на соответствующие питательные среды имел единичные колонии. через 6 месяцев хранения при таких же условиях штамм не сохранил свою жизнеспособность. Аналогичные результаты получены и у штамма В. аЬо^ш 19 ВА при хранении на скошенном агаре Альбими при температуре от 0 до +8 °С (таблица).
Таким образом, микроорганизмы I генерации при температуре хранения от 0 до +8 °с на твердых питательных средах в течение 3 месяцев сохраняют небольшую жизнеспособность. Хранить штаммы в данных условиях более длительный период нецелесообразно.
Для широкого круга микроорганизмов лиофи-лизация обеспечивает большую стабильность, чем общеизвестные способы высушивания и периодические пересевы. Этот метод удобен для практических целей: во-первых, дает возможность иметь большое число образцов (ампул) каждого микроорганизма; во-вторых, лиофилизированные культуры некоторое время можно хранить при комнатной температуре без
изменений качества «таблетки». Пересылка штаммов микроорганизмов в лиофилизированном состоянии не требует дополнительных затрат и полностью соответствует требованиям СП 1.2.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». При сублимационной сушке влага перемещается в материале в виде пара, в результате чего удается в максимальной степени сохранить первоначальные специфические свойства микроорганизмов. Недостатком данного метода является то, что во время лиофилизации идет медленное удаление влаги из-за низкой температуры, узкого просвета в перешейках ампул, затруднения испарений из глубоких слоев биоматериала (дно и стенки ампул). Большим минусом процесса лиофи-лизации является его трудоемкость, длительность (до 12 ч), большой расход электроэнергии, использование дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала, что влечет за собой большие физические и материальные затраты.
низкотемпературная консервация по сравнению с другими методами (лиофилизация и криоконсерва-ция) для хранения микроорганизмов более универсальна в связи с наличием и доступностью низкотемпературных холодильников, способных надежно поддерживать необходимые температуры в течение длительного времени. Однако время хранения биоматериала при этих температурах также ограничено. По данным L.F.Gibson и J.T.Khoury [6], в холодильнике при температуре минус 70 °C время хранения разных видов бактерий колебалось в пределах 12-40 месяцев.
В процессе хранения при температуре минус 70 °с в течение всего времени наблюдения рост бактерий тестируемых штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и B. abortus 19 ВА на всех средах хранения не отличался от исходного. Однако наблюдалось снижение количества жизнеспособных клеток каждого штамма (таблица).
В результате проведенных исследований при глубоком замораживании жизнеспособность штамма F. tularensis 15 НИИЭГ в течение года хранения составила в среднем: на бульоне Альбими с 10 %
Жизнеспособность F. tularensis 15 нииЭГ и B. abortus 19 ВА в течение 2 лет наблюдения
Время наблюдения, мес. Среда хранения при температуре минус 70 °С Среда хранения при температуре от 0 до +8 °С
Бульон Альбими с 10 % глицерином Дистиллированная вода с 10 % глицерином СЖА Ft-агар Агар Альбими
F. tularensis 15 НИИЭГ, мк/мл B. abortus 19 ВА, мк/мл F. tularensis 15 НИИЭГ, мк/мл B. abortus 19 ВА, мк/мл F. tularensis 15 НИИЭГ, мк/мл B. abortus 19 ВА, мк/мл F. tularensis 15 НИИЭГ, мк/мл B. abortus 19 ВА, мк/мл
0 25-1010 38-1010 12-1010 20-1010 23-1010 56^1010 25^1010 381010
3 23-1010 34-1010 10,51010 12-1010 21-1010 48-1010 2^103 4^102
6 20-1010 32-1010 8,6-1010 101010 20-1010 43^1010 0 0
9 17-1010 27-1010 5,4-1010 5-1010 18-1010 101010 - -
12 12-1010 25-1010 1,5-1010 3-1010 18-1010 2Ы010 - -
24 8-1010 131010 11010 1,81010 16,31010 12^1010 - -
Примечание. «—» - опыт не проводили.
Щ - бульон Альбими с 10 % глицерином
□ - дистиллированная вода с 10 % глицерином
□ -СЖА
Рис. 1. Средний процент живых микробных клеток F. tularensis 15 НИИЭГ за 2 года наблюдения
глицерином - 48; дистиллированной воде с 10 % глицерином - 12,5; СЖА - 77,4 %. В течение двух лет хранения - на бульоне Альбими с 10 % глицерином -32; дистиллированной воде с 10 % глицерином - 8,3; СЖА - 56,5 % (рис. 1.).
Штамм B. abortus 19 ВА через год хранения в условиях низкотемпературного замораживания сохранял свою жизнеспособность в среднем: на бульоне Альбими с 10 % глицерином - 66; дистиллированной воде с 10 % глицерином - 15; СЖА - 64,3 %. В течение двух лет хранения - 34,2, 9 и 35,7 % соответственно (рис. 2).
Возможно, в других образцах концентрация клеток микроорганизмов будет идентична исходной, поскольку это связано с тем, что оставшиеся образцы не подвергались процедуре замораживания-оттаивания, тогда как первые были подвержены такой процедуре 4 раза за год.
Таким образом, в научно-экспериментальных отделах (лабораториях) при изучении возбудителей туляремии и бруцеллеза, выделенных из природных очагов и/или при диагностике заболеваний людей, при традиционных методах хранения на питательных средах жизнеспособность штаммов сохранялась в течение недолгого времени (I генерация - 3 месяца, при пересевах - максимально до 1 года). Нами показано на примере F. tularensis 15 НИИЭГ и B. аbortus 19 ВА, что штаммы необходимо более эффективно консервировать в рабочих коллекциях методом низкотемпературного замораживания. Наиболее оптимальными средами для хранения данных микроорганизмов при температуре минус 70 °С являются СЖА и бульон Альбими с 10 % глицерином.
Предлагаемый метод длительного хранения штаммов (на примере F. tularensis 15 НИИЭГ и B. аbortus 19 ВА) при низкой температуре (минус 70 °С) позволяет практически полностью сохранять их жизнеспособность и неизменность морфологических признаков на протяжении 2 лет с относительно небольшими физическими и материальными затратами в экспериментальных лабораториях, а также в специализированных коллекциях на случай непредвиденных ситуаций и невозможности проведения процесса лиофилизации.
Рис. 2. Средний процент живых микробных клеток B. аЪсг-tus 19 ВА за 2 года наблюдения
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинасовых интересов, связанных с написанием статьи.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Безсмертный В.Е., Попов В.П., Жуков В.И., Иванова С.М. Обзор эпизоотической ситуации по туляремии на территории Российской Федерации во втором полУгодии 2008 г. и прогноз на первое полугодие 2009 г. Пробл. особо опасных инф. 2009; 2(100):11-3.
2. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза. МУ 3.3.2.212406. М.; 2006. 29 с.
3. Куплетская М.Б., Нетрусов А.И. Жизнеспособность лиофилизированных микроорганизмов после 50 лет хранения. Микробиология. 2011; 80(6):842-6.
4. Лямкин Г.И., Тихенко Н.И., Манин Е.А. Русанова Д.В., Головнёва С.И., Вилинская С.В., Куличенко А.Н. Об эпидемической ситуации и заболеваемости бруцеллезом в Российской Федерации в 2011 г. и прогноз на 2012 г. Пробл. особо опасных инф. 2012; 1(111):26—9.
5. Похиленко В.Д., Баранов А.М., Детушев К.В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденция развития. Известия ВУЗов. 2009; 4:99-121.
6. Gibson L.F., Khoury J.T. Storage and survival of bacteria by ultra-freeze. Lett. Appl. Microbiol. 1986; 3(6):127-9.
References
1. Bezsmertny V.E., Popov V.P., Zhukov V.I., Ivanova S.M. [Review of tularemia epizootic situation in the Russian Federation territory in the second half of 2008 and prognosis for the first half of 2009]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2009; 2(100):11-3.
2. [Diagnostic nutrient media control against biological parameters for agents of plague, cholera, anthrax, tularemia, brucellosis, and legionellosis]. MR 3.3.2.2124-06. M.; 2006. 29 p.
3. Kupletskaya M.B., Netrusov A.I. [Viability of lyophilized microorganisms after 50 years of storage].Mikrobiologia. 2011; 80(6):842-6.
4. Lyamkin G.I., Tikhenko N.I., Manin E.A., Rusanova D.V., Golovneva S.I., Vilinskaya S.V., Kulichenko A.N. [Brucellosis epidemiological situation and its morbidity in the Russian Federation in 2011, and prognosis for 2012]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2012; 1(111):26-9.
5. Pokhilenko V.D., Baranov A.M., Detushev K.V. [Methods of long-term storage of microorganisms' collection cultures and development trends]. Izvestiya VUZov. 2009; 4:99-121.
6. Gibson L.F., Khoury J.T. Storage and survival of bacteria by ultra-freeze. Lett. Appl. Microbiol. 1986; 3(6):127-9.
Authors:
Malakhaeva A.N., Lyashova O.Yu., Plotnikov O.P., Osin A.V. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Малахаева А.Н., Ляшова О.Ю., Плотников О.П., Осин А.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 04.02.15.
