CC BY
81
УДК 541.64.995.12
Хитин-глюкановые комплексы на основе высших грибов
12 3
В.П. Ившин, Л.Ю. Грунин, С.Д. Артамонова, 1Ф.Ф. Шарнина, 1Т.Н. Ившина
1 Марийский государственный университет, Йошкар-Ола 2Марийский государственный техничесий университет, Йошкар-Ола 3Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина рАн, Москва
Изучены структурно-сорбционные свойства хитин-глюкановых и хитин-глюкан-меланиновых комплексов, выделенных из различных видов нативной биомассы высших грибов классов Basidiomycetes и Ascomycetes Республики Марий Эл с использованием модифицированной методики, и проведено сравнение их структуры со структурой крабового хитина. Прослежена эволюция структуры материала на разных стадиях обработки. Установлено, что все полученные материалы характеризуются высоким содержанием хитина и по сорбционным характеристикам превосходят хлопковую целлюлозу и сопоставимы с хитозаном. Структурно-сорбционные свойства зависят как от вида гриба, так и от способа их получения. Показана возможность создания хитинсодержащих материалов с заданными свойствами путем контролирования соотношения основных компонентов в гетерогенной структуре (хитин-глюкан-меланин).
Properties of chitin-glucane and chitin-glucane-melanin complexes allocated from various kinds of native biomass of the mushrooms of classes Basidiomycetes and Ascomycetes in the Republic of Mari El with the use of a new technique are investigated and comparison of their structure with the structure of crab chitin is presented in the article. Evolution of the material's structure is investigated at different stages of processing. It is found that all materials are characterized by high maintenance of chitin and due to characteristics as sorbate they surpass cotton cellulose and are comparable with chitosan. Structurally, properties depend both on the kind of a mushroom and on the way of their reception. The possibility of creation chitin materials with the set properties by monitoring the ratio of basic components in heterogeneous structure (chitin-glucan-melanin) is shown.
Природные полиаминосахариды широко используются в химических, биохимических и биомедицинских областях. Хитин, содержащий поли - [1-4]-2-ацетамидо-2-дезокси-р-Б-глюкозу (поли-Ы-ацетил-Э-глюкозамин), является основным компонентом структуры клеточных стенок грибов и наружных покровов ракообразных и насекомых. В клеточной стенке грибов хитин находится не в свободном состоянии, а связан с полисахаридами, липидами, белками и микроэлементами, что делает эти комплексы ценными не только в медицине (на их основе возникла новая область медицины - микологическая фармакопея), но и в создании новых «нетканных» материалов и сорбирующих средств. Перспективность практического использования полиаминосахаридов грибов в ближайшие годы может оказаться столь же значимой, что и хитина. Однако их использование затруднено недостаточным знанием физико-химических свойств, методов выделения и видовым разнообразием грибного хитина.
В работе изучены структурно-сорбционные свойства хитин-глюкановых комплексов (ХГК) и хи-тин-глюкан-меланиновых комплексов (ХГМК), выделенных из различных видов нативной биомассы
высших грибов классов Basidiomycetes и Ascomycetes Республики Марий Эл в лабораторных условиях с использованием новой методики [1]. Проведено сравнение структур хитинсодержащих материалов на основе грибов со структурой чистого хитина Arthro-poda, выделенного из панциря рака. Исследованы образцы ХГМК, выделенные по трехстадийной схеме (NaOH ® HCl ® NaOH), и образцы ХГК, выделенные по четырех - (NaOH ® HCl ® H2O2 ® NaOH) и пяти-стадийной (NaOH ® HCl ® H2O2 ® NaOH ® HCl) схемам. Прослежена эволюция структуры ХГК на разных стадиях обработки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектом исследования были выбраны образцы ХГМК, выделенных с использованием растворов гид-роксида натрия, соляной кислоты и перекиси водорода по трехстадийной схеме (А), и образцы ХГК, выделенные по четырем (Б) и пятистадийным (В) схемам: депротеинизация (ДП) - деминерализация (ДМ) -деглюканизация (ДГ), ДП - ДМ - депигментация (ДПИГ) - ДГ и ДП - ДМ - ДПИГ - ДГ - ДМ, соответственно. После каждой стадии обработки препараты
промывались водой до нейтральной реакции среды. Условия обработок для каждой стадии были разработаны на кафедре органической и биологической химии Марийского государственного университета [1].
Исходным материалом для выделения ХГК и ХГМК служила воздушно-сухая биомасса восьми видов высших грибов, произрастающих в естественных условиях на территории Республики Марий Эл: Armillariella mellea (опенок настоящий), Cantharellus cibarius (лисичка,), Lactarius rufus (горькушка), Suillus bovines (козляк), Marasmius oreades (опенок луговой), Mor-chella esculenta (сморчок), Paxillus involutus (свинушка), Ramaria eumorpha (рамария).
Количество минеральных веществ и влагосодер-жание образцов определено гравиметрическим методом по ТУ 15-01-472-87. Для определения общего азота использованы два метода: метод фотоэлектро-колориметрии, с применением реактива Несслера [2], и метод Кельдаля [2]. Содержание солянокислого D-глюкозамина в гидролизате определено фотометрическим методом по Эльсону-Моргану [3]. Элементный анализ проведен на автоматическом анализаторе «Perkin Elmer C H N S/O Analyzer 2400». Количество хитина в составе ХГК рассчитано по формуле:
N
X =--100%,
6,89
где Х - количество хитина в ХГК, %;
N - содержание азота в ХГК, %;
6,89% - содержание азота в чистом хитине.
Строение ХГК идентифицировали методами ИК-спектроскопии и дифракции рентгеновских лучей под большими углами в сравнении с хитином ракообразных, выделенного из панциря моллюска гриля (ГОСТ 7631-85). ИК-спектры снимали на инфракрасном Фурье-спектрофотометре «VECTOR 22» фирмы «Bruker» в таблетках c KBr при 200С. Интенсивности полос поглощения оценивали по методу «базисной линии» [4]. Рентгеновская съемка проводилась на установке ДРОН-3М в режиме «на просвет» в диапазоне углов 26 = 5-60о (CuKx-излучение, длина волны l = 0,1542 нм). Образцы исследовали в виде порошков, помещенных в кювету с окошками из тонких пленок аморфного ПЭТФ. Обработку дифрактограмм проводили с учетом рассеяния кюветы, внесения поправки на поглощение и поляризацию излучения [5].
Изотермы адсорбции паров воды на образцах ХГК получены с использованием метода изопиести-ческих серий. Сорбционные характеристики системы ХГК - вода рассчитаны по методу БЭТ [6].
ОБСУЖДЕИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Найдено, что в зависимости от схемы обработки и вида гриба образцы ХГК сильно различаются содержанием общего азота (3,0-6,5%), солянокислого Б-глюкозамина (40-90%) и минеральных веществ (0,1-1,5%).
ИК-спектры исследованных образцов отличаются друг от друга только интенсивностями основных полос, что связано с различным содержанием хитина в образце, и практически идентичны ИК-спектру хитина животного происхождения (рис. 1).
В качестве аналитических полос поглощения выбраны полоса в области 1660 см-1, соответствующая валентным колебаниям связи С = О карбонильной группы в амидах кислот (полоса амид I) и полоса в области 1560 см-1 соответствующая сумме колебаний связей М-И и С-М в амидах (полоса амид II). Основные полосы инфракрасного поглощения для исследуемых образцов находятся в области 3600-600 см-1. В области 1700-1500 см-1 наблюдаются основные полосы поглощения, характерные для хитина [6], обусловленные валентными колебаниями М-И-группы, связанной с ацетильной группой С = О (полоса амид I) и деформационными колебаниями М-И и С-М-связей в амидах (полоса амид II). Наличие в ИК-спектре полосы при 1656 см-1 указывает на то, что хитин в исследуемом ХГК находится в а-форме. В области спектра 3600-3000 см-1 наблюдается широкая полоса, обусловленная характеристическими валентными колебаниями ОН- и МИ-групп вторичных аминов, включенных в межмолекулярные и внутримолекулярные водородные связи. Необходимо отметить, что в этой области спектра наблюдаются также деформационные колебания ОН-групп молекул сорбированной воды. В интервале 1400-1300 см-1 ИК-спектров этих соединений проявляются полосы 1320 и 1380 см-1, соответствующие колебаниям С-Н и С-М связей амид-ных полос; в области 1200-1000 см-1 наблюдается широкая интенсивная полоса с максимумами 1080 и 1160 см-1, относящаяся к валентным колебаниям С-О групп первичных и вторичных спиртов. В спектрах ХГК и хитина ракообразных в области 970-850 см-1 (рис. 1, кривая 1 и 2) наблюдаются два плеча: при 897 см-1 (колебания глюкапиранозного кольца около С(6) и деформационные колебания СН) и при 953 см-1 (валентные колебания С-О и С-С и деформационные маятниковые СН2). Данные ИК-спектра указывают на то, что группа при С(6), которая имеет свободное вращение, может быть связана внутримолекулярной водородной связью с кислородом мостика и атомом азота в соседней глюкозаминной единице (рис. 2), что согласуется с результатами работы [7].
Рис. 1. ИК-спектры хитина ArthropodaАгтй1апе11а те11еа (1), ХтГК высших грибов (2) и хитозана рака (3)
Рис. 2. Структура а-хитина в проекции Ьс (из работы [8])
1 - N80 4
2 - НС1
3 - Н 20 2
4 - N80 Н
1 - N80 Н
2 - НС1
3 - Н202
4 - N80 Н
10
20 30
26, град.
40
50
Рис. 3. Дирактограммы образцов ХГК различных видов и классов грибов, выделенных по четырехстадийной методике
0 10 20 30 40 50
26, град.
Рис. 4. Дифрактограммы образцов ХГК из ЛгтШапеНа те11еа на стадиях депротеинизации (1), деминерализации (2), депигментации (3) и деглюканизации (4)
0
Таблица 1 — Кристаллографические параметры хитин-глюкановых комплексов грибов
Образцы
№ (hkl) Amillariella Cantharellus Lactarius Ramaria Suillus Marasmius Morchella Paxillus хитин
mella cibarius rufus flava bovinus oreades esculenta involutus рака
Межплоскостные расстояния dhk¡ х 10, нм
1. 13,39 17,67
2. 020 9,82 9,40 9,61 9,40 9,61 9,40 9,40 9,61 9,40
3. 021 6,91 6,91 6,97 7,04 6,91 6,91 6,81 6,91 6,70
4. 110 4,53 4,55 4,53 4,55 4,57 4,53 4,57 4,67 4,62
5. 140 3,35 3,34 3,35 3,35 3,34 3,33 3,36 3,35 3,39
6. 060 3,10 3,18 3,04
7. 070 2,75 2,76 2,78 2,75 2,76
8. 160 2,55 2,56 2,56 2,55 2,56 2,56 2,55 2,60
9. 220 2,31 2,28 2,28 2,25 2,28 2,30 2,31 2,31 2,28
10. 090 2,09 2,09
11. 250 1,93 1,93
Степень кристалличности, %
57 67 59 40 46 53 60 51 67
Таблица 2 - Сорбционные характеристики системы ХГК — вода
Образец Схема обработки а m, г/г S уд, м2/г А s, г/г N х, нм
А 0,067 235 0,286 4,3 1,28
Armillariella mellea Б 0,068 238 0,301 4,4 1,33
В 0,074 259 0,254 3,4 1,03
Cantharellus cibarius А Б 0,063 0,053 221 186 0,300 0,253 ОО 00 1,43 1,43
А 0,075 263 0,321 4,3 1,28
Lactarius rufus Б 0,060 210 0,230 3,9 1,17
В 0,049 172 0,234 4,8 1,43
Suillus bovines А 0,066 231 0,252 3,8 1,15
Б 0,071 249 0,284 4,0 1,20
А 0,068 238 0,275 4,0 1,21
Marasmius oreades Б 0,070 245 0,279 4,0 1,20
В 0,062 217 0,263 4,2 1,27
А 0,077 270 0,332 4,3 1,29
Morchella esculenta Б 0,081 284 0,294 3,6 1,09
В 0,067 234 0,277 4,1 1,24
А 0,073 255 0,379 5,2 1,56
Paxillus involutus Б 0,060 210 0,316 5,3 1,58
В 0,057 199 0,278 4,9 1,46
Ramaria eumorpha Б 0,060 210 0,318 5,3 1,59
Хлопковая целлюлоза А 0,024 83 0,135 5,7 1,72
хитозан В 0,077 270
Все дифрактограммы исследованных образцов идентичны и характеризуются рядом кристаллических рефлексов, характерных для структуры чистого хитина. Кристаллографические параметры образцов приведены в табл. 1. На основе сравнения экспериментальных результатов с данными работы [7, 8] выполнено отнесение рефлексов и установлена структура a-хитина. Согласно работе [7], элементарная ячейка хитина имеет пространственную группу Р212121 (а = 4,74 Ä, b = 1,88 Ä и с = 1,03 Ä), и молекулярная конформация звеньев хитина 4С1. Степень кристалличности образцов ХГК и упорядоченность кристаллических областей различны для различной биомассы грибов. Наименьшей степенью кристалличности обладает ХГК из Ramaria flava (40%),
а наибольшей - ХГК из Cantharellus cibarius, Mor-chella esculenta, Armillariella mella и Lactarius rufus (58-67), полная степень кристалличности которых сравнима со степенью кристалличности чистого хитина, выделенного из ракообразных (67%).
На рис. 3 представлены дифрактограммы образцов ХГК Morchella escullenta (класс Ascomycetes) и Armillariella mella и Amanita muscaria (класс Basidio-mycetes), полученных по четырехстадийной методике. Значения межплоскостных расстояний (табл. 1) свидетельствуют о более «рыхлой» упаковке молекул ХГК грибов класса (Basidiomycetes) по сравнению с классом Ascomycetes и со структурой чистого хитина в направлении b кристаллографической ячейки, а именно вдоль плоскостей глюкопиранозных колец.
Кроме того, на дифрактограмме Morchella esculenta имеется дополнительный четкий кристаллический рефлекс в малых углах (в случае Amanita muscaria также наблюдается рефлекс в малых углах, но он очень слабый). Возможно, это связано с изменением ориентации молекул относительно основной цепи. Степень кристалличности образца Morchella esculenta сравнима со степенью кристалличности хитина из подмора пчел (61%) значительно ниже степени кристалличности образцов Armillariella mella и Amanita muscaria (50%).
Таким образом, мы видим, что в зависимости от вида и класса грибов дифрактограммы образцов ХГК отличаются друг от друга как относительной интенсивностью и шириной основных рефлексов, что указывает на различную упорядоченность структуры, так и числом и соотношением интенсивностей в данной структуре, что может быть вызвано различной кон-формацией цепей молекул.
Эволюция структуры ХГК, выделенных из одного вида гриба, в процессе четырехстадийного синтеза. На рис. 4 представлены дифрактограммы ХГК из Ar-millariella mella на разных стадиях синтеза. Стадия деминерализации (рис. 5, кривая 2) приводит к некоторому уменьшению доли аморфных областей и увеличению степени кристалличности (К) материала с 45% для образца на первой стадии обработки (депротеини-зации) до 50%. Стадия депигментации (рис. 5, кривая 3) приводит к дальнейшему росту интенсивности рефлексов на дифрактограмме (К = 55%). После стадии дег-люканизации (рис. 5, кривая 4) на дифрак тограмме исчезает малоугловой рефлекс, происходит рост и перераспределение интенсивностей рефлексов (К = 58%). Причем, наиболее сильное увеличение интенсивности наблюдается для кристаллического рефлекса (020), отвечающего за рассеяние от плоскостей глюко-пиранозных колец. Однако структура становится более дефектной, что может быть связано с частичным разрывом межмолекулярных связей и/или нарушением ориентации макромолекулярных цепей полимера. Из этого можно сделать предположение, что a-глюканы выполняют одновременно структурную роль и заполняют пространство между фибриллами клеточных стенок, а также приводят к изменению наклона макромолекул относительно основной цепи.
Все снятые изотермы сорбции исследуемых образцов имеют характерную S-образную форму, что присуще для стеклообразных, частично кристаллических и сетчатых полимеров, и отнесены к изотермам типа II [9]. Из анализа изотерм сорбции по методу БЭТ были определены сорбционные характеристики образцов: статистическая емкость монослоя (а™), полная эффективная удельная поверхность (Sw), максимальное гигроскопическое влагосодержание (AS),
число мономолекулярных слоев сорбированной воды (N), толщина слоя связанной воды (х) при полном набухании образца. Результаты представлены в табл. 3. Содержание прочносвязанной воды для всех исследованных образцов лежало в пределах 0,05-0,08 г/г.
Найдено, что наименьшей сорбционной способностью обладают выделенные по схеме Б образцы C.cibarius и L.rufus, а наибольшей - M.esculenta. В случае выделения ХГК по схеме В наиболее низкая сорбционная способность выявлена для образца из R.eumorpha. Тенденция снижения сорбционной способности при пятистадийной обработке объясняется частичным разрушением и перераспределением аморфных областей и увеличением степени кристалличности. Наибольшими сорбционными способностями обладают ХГК из Morchella esculenta, выделенные по схемам А и Б. В целом, полученные по сорбционным характеристикам материалы превосходят хлопковую целлюлозу и сопоставимы с хитозаном.
На основании полученных результатов можно сделать заключение, что все образцы ХГК, полученные по новой методике, характеризуются высоким содержанием хитина. Степень кристалличности и соотношение основных компонентов ХГК (хитин-глюкан-меланин) зависят от вида гриба и способа выделения. Молекулы a-глюканов выполняют одновременно структурную роль и заполняют пространство между фибриллами клеточных стенок. По сорбцион-ным характеристикам образцы превосходят целлюлозу и сопоставимы с хитозаном. Изменяя соотношения основных компонентов ХГК путем подбора вида гриба и условий обработки можно получать хитинсодер-жащие материалы материалы с необходимыми селективными свойствами.
Работа выполнена по гранту МарГУ по заданию Федерального агенства по образованию.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеева И.В., Шарнина Ф.Ф., Ившина Т.Н. // Материалы науч.-практ. Конф. студентов по итогам науч.-исслед. работы за 2004 год. - Йошкар-Ола: 2005. - С. 219.
2. Лапшин С.А. Практикум по зоотехническому анализу кормов / Под ред. С.А. Лапшина, В.И.Митяева, Л.И.Чавкиной. - Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 1991. - 147 с.
3. Костина А.М. Хитин мицелиальных грибов рода Pénicillium / А.М.Костина, В.Г.Бабицкая, А.Г.Лобанок // Прикладная биохимия и микробиология. - 1978. - Т. 14. - Вып. 4. - С. 586.
4. Нугманов О.К., Перцен А.И., Забелин А.В., Марченко Г.И. // Успехи химии. - 1987. - Т. 56. - № 8. С. 1339.
5. AlexanderL.E. X-Ray Diffraction Methods in Polymer Science. N. Y.: Wiley-Interscience, 1969.
6. GalatA, PopowiczJ. // Acad. Pol. Sci. Biol. - 1978. - V. 26. -№ 5. - Р. 295.
7. MinkeR., BlackwellJ. // J. Molec. Biol. 1978. V.120. P. 167
8. Paralikar K.M., Balasubramanya R.H. // J. Polym. Sci. Polym. Lett. Ed. 1984. - V. 22. - № 10. - Р. 543.
9. Грег С., Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость. - М.: Мир, 1984. - 306 с.
