CC BY
189
УДК 340.67: 615.212.099: 615.074
ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЕТОРОЛАКА В МОЧЕ
Н. Н. ПетуховаТ. Л. МалковаЛ. В. Терентьева2
'Пермская государственная фармацевтическая академия, 2ГУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Пермь
В наркологической практике для купирования альгических расстройств применяют лекарственные препараты, ингибирующие синтез простогландинов,— нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). В бытовых условиях без соответствующего внимания медицинского персонала, из страха перед предстоящей «ломкой» больные злоупотребляют приемом препаратов группы НПВС, что может стать причиной возникновения острых интоксикаций различной степени тяжести.
Многие острые и хронические заболевания, сопряженные с болевыми синдромами различной этиологии и требующие длительного применения НПВС, также могут вызвать возникновение риска развития побочных эффектов. Какова бы ни была причина интоксикации организма, эксперт должен представить наиболее полную картину отравления [4].
Кеторолак (5-бензоил-2,3-дигидро-1Н-пирролизин-1-карболовая кислота) является мощным анальгетиком периферического действия. По силе анальгетического эффекта он сопоставим с морфином [1]. Пиковые концентрации в плазме достигаются через 30— 40 минут после перорального и через 45— 50 минут после внутримышечного введения. Пища и антациды уменьшают скорость, но не степень его всасывания. Менее 10% кеторола-ка метаболизируется в печени, превращаясь в парагидроксиметаболит, который обладает
лишь частичной активностью по сравнению с исходным веществом. Подвергается глубокому метаболизму в почках с образованием неактивного ацетилглюкуронида. Выводится с мочой на 90% в неизмененном виде и в виде метаболитов.
По физическим свойствам исследуемое вещество представляет собой белый кристаллический порошок, который хорошо растворим в эфире и этилацетате. УФ-спектры кето-ролака в метаноле имеют максимумы абсорбции при 254, 312 нм. Согласно библиотечным данным, в масс-спектре кеторолака наблюдаются характеристические ионы: 105, 210, 255, 77, 51, 78, 132, 91 [6, 7]. В химико-токсикологическом отношении препарат изучен недостаточно.
Цель исследовательской работы — разработка подходов к идентификации кеторо-лака в извлечениях из мочи (модельные смеси) с использованием методов тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), УФ- и хромато-масс-спектрометрии.
Материалы и методы
исследования
В эксперименте была использована фармацевтическая субстанция кеторолака трометамина (фирма-производитель «Чемо Иберика С. А.», Испания), соответствующая требованиям нормативной документации
(НД 42-8805-98) [10]. Исследование кеторо-лака в извлечениях из биологической жидкости (мочи) проводили на модельных смесях. Для их приготовления использовали образцы мочи, полученные от здоровых добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение месяца до отбора проб. Модельные смеси готовили путем добавления раствора кеторолака трометамина в 96%-ном этиловом спирте в концентрации 10 мкг/мл к моче до получения концентраций, соответствующих диапазону терапевтических доз [7]. Приготовленные модельные смеси выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре, а затем осуществляли процесс изолирования. В качестве изолирующего агента использовали органический растворитель — эфир.
Ранее нами были проведены исследования с применением метода ВЭЖХ в обращен-но-фазовом варианте на основе приборного комплекса «Милихром А-02». Было установлено, что кеторолак может экстрагироваться как из кислой, так и из щелочной среды. При этом были использованы различные органические экстрагенты и получены соответствующие им концентрации кеторолака на выходе. Исследования проводились на стандартных растворах с обязательной постановкой холостого опыта. Результаты показали, что наилучшим экстрагентом является эфир (выход 85,87%) при значении рН среды, равном 1,5—2,0.
Исследования методом тонкослойной хроматографии. С целью поиска дополнительных вариантов очистки, обнаружения и предварительной идентификации рассматриваемого соединения были изучены особенности его хроматографического поведения в тонких слоях сорбента и возможность применения пластинок фирмы «Мегк» с привитой фазой С18 [3]. В работе были использованы различные системы растворителей, при этом варьировались соотношения компонентов систем.
Детектирование. УФ-абсорбция при длине волны 254 нм характеризуется появлением темных пятен в исследуемой зоне; пары йода — в исследуемой зоне пятно желтого цвета; 0,5%-ный раствор калия перманганата с кислотой серной концентрированной — исследуемая зона бесцветная, фон на пластинке розовый; 1%-ный раствор нингидрина спиртовый — в исследуемой зоне пятно желтого цвета с сиреневой каймой; кислота серная концентрированная (проявление капель-но) — в исследуемой зоне пятно желтого цвета; реактив Марки (проявление капель-но) — в исследуемой зоне пятно телесного цвета.
Было воспроизведено по 10 повторений в каждой системе с последующей статистической обработкой полученных результатов.
Показатели хроматографической подвижности исследуемого вещества в различных системах растворителей представлены в таблице.
Таблица
Система растворителей Значение Rf (среднее)
Метанол — вода — ледяная уксусная кислота (55 :44:1) 0,34
Бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (3:6:10) 0,55
Дихлорметан — ацетон — ледяная уксусная кислота (95 :5:2) 0,86
1% КОН — ледяная уксусная кислота — четыреххлористый углерод (5:2:10) 0,10
Ацетонитрил— фосфатный буфер (40 : 60) 0,25
Результаты идентификации кеторолака методом тонкослойной хроматографии на пластинках фирмы «Merk» с привитой фазой С18
Как свидетельствуют полученные данные, наиболее оптимальные условия хроматогра-фирования с использованием пластинок фирмы «Merk» (привитая фаза С18) достигаются при применении в качестве подвижной фазы системы растворителей: бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (3:6:10). Величина Rf — 0,55.
Более чувствительными проявителями для кеторолака оказались: УФ-свет при длине волны 254 нм и 1%-ный спиртовый раствор нингидрина. На хроматографических пластинках, помимо зон исследуемого вещества, обнаруживались пятна неидентифицирован-ных соэкстрактивных веществ.
Дополнительную очистку полученных извлечений проводили методом ТСХ в системе бутанол — ледяная уксусная кислота— вода (3:6:10). В дальнейшем использовали их (элюаты) для идентификации кеторолака с помощью инструментальных методов анализа.
Исследование методом УФ-спект-рометрии проводили на спектрофотометре СФ-2000-02. Интервал длин волн 220—350 нм. Толщина кювет 10 мм. Кроме кислых и щелочных растворов, анализировали стандартный спиртовый раствор кеторо-лака. Все анализируемые образцы имели основные максимумы поглощения: образцы кислых растворов — 318 нм, образцы щелочных растворов — 320 нм, стандартный раствор кеторолака — 315 нм.
Подтверждающая идентификация методом ВЭЖХ. Для анализа методом ВЭЖХ использовали жидкостный хроматограф «Милихром А-02» (ЗАО «Институт хроматографии «Эконова», г. Новосибирск). Очищенные извлечения (элюаты) упаривали до получения сухих остатков, которые растворяли в 5 мл системы растворителей ацето-нитрил — фосфатный буфер (40:60). Для решения поставленных задач в обращенно-фазовом варианте нами использовалась стальная колонка длиной 75 мм и диаметром 2 мм, сорбент «Силасорб 100-5С18». В каче-
стве рабочей длины волны для кеторолака выбрана длина волны 322 нм, которая характеризуется наибольшими значениями удельного коэффициента светопоглощения. Время удерживания кеторолака составляет 4,14 мин.
Хромато-масс-спектрометрическое исследование полученных элюатов и стандартного спиртового раствора кеторолака было проведено на хромато-масс-спектро-метре НР 5973/6890. Режим работы масс-се-лективного детектора — сканирование в интервале 40—550 а. м. [2, 5].
Условия разделения: колонка DB-5MS 30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм; температурная программа колонки 150°С (1 мин) — 20°С/мин — 250°С (1 мин) — 10°С/мин — 300°С; температура инжектора — 290°С; давление — 109,7 kPa; газ-носитель — гелий.
На полученных хроматограммах присутствовал один основной пик со временем удерживания 18,57 минуты. В масс-спектре этого пика наблюдались характеристические ионы: 211, 134, 77, 105, 51, 196, 182, 91.
Полученные нами масс-спектры исследуемых растворов отличаются от масс-спектра кеторолака, опубликованного в литературе (библиотека масс-спектров NIST98), прежде всего отсутствием молекулярного иона с массой 255. На наш взгляд, это обусловлено отщеплением карбоксильной группы в инжекторе хроматографа при 290°С. Зная структуру кеторолака и предполагая термическое отщепление карбоксила, можно предположить, что пик на хроматограмме является (.+/-.)-5-бензоил-2,3-дигидро-1Н-пирроли-зином — продуктом термического декарбо-ксилирования кеторолака.
Масс-спектры совпадают с масс-спектром (2-амино-5-метилфенил) фенилметано-на (CAS № 017852-28-7, молекулярная формула C14H13NO, молекулярный вес 211,1) из библиотеки NIST 2005 с вероятностью 94%, что наглядно проиллюстрировано на рисунке.
Рис. Сравнение масс-спектров пика 18,57 и (2-амино-5-метилфенил) фенилметанона
Обсуждение результатов
исследования
Нами подобраны подходящие условия предварительного обнаружения кеторолака методом ТСХ и доказана возможность применения пластинок фирмы «Merk» с привитой фазой С18.
УФ-спектры кеторолака, изолированного из модельных смесей, совпадали со спектром стандартного раствора. Это говорит о достаточно высокой степени очистки методом ТСХ и приемлемости УФ-спектрометрии для идентификации данного соединения в извлечениях из биологических жидкостей.
При анализе методом ВЭЖХ определяемое соединение идентифицировали по характерному значению времени удерживания, что свидетельствует в пользу разработанной нами методики.
Воспроизводимость хроматограмм по наличию основного пика, как при анализе кеторолака, так и при анализе экстрактов из биожидкостей, обусловливает рекомендации по использованию метода хромато-масс-спектрометрии для идентификации кеторолака в различных средах.
Таким образом, разработанные нами методики органично войдут в схему химико-токсикологического анализа кеторолака при направленных исследованиях.
Библиографический список
1. Государственный реестр лекарственных средств (официальное издание).— М., 2006.- Т. 2.- Ч. 1.- С. 876-878.
2. Карасек Ф. Введение в хромато-масс-спек-трометрию. Пер. с англ./Ф. Карасек, Р. Клемент.- М.: Мир, 1993.- 237 с.
3. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматогра-фия/Ю. Кирхнер.- М., 1981.- Т. 2— С. 267.
4. Элленхорн М. Д. Медицинская токсикология — диагностика и лечение отравлений у человека/М. Д. Элленхорн— М.: Медицина, 1994.— Т. 72.— С. 12—15.
5. Хмельницкий Р. А. Хромато-масс-спект-рометрия/Р А. Хмельницкий, Е. С. Бродский— М.: Химия, 1984.— 210 с.
6. Baselt R. C. Disposition of toxic drugs and chemicals in man/R. C. Baselt, R. H. Cravey.— Florida, 1995.— 416 p.
7. Clarke's analysis of drugs and poisons.— London: Pharmaceutical Press. Electronic version, 2004.
8. Chaudhary R. S. Reversed-phase highperformance liquid chromatography of ketorolac and its application to bioequi-valence studies in human serum/ R. S. Chaudhary, S. S. Gangwai, K. C. Jindal.— J. Chrom— 1993.— Vol. 614.— Р. 180.
9. Devarajan P. V. HPTLC determination of ketorolac tromethamin/P. V. Devarajan.— J. Pharm. Biomed. Anal.— 2000.— Vol. 22.— Р. 679—683.
10. НД 42-8805—98.
N. N. Petukhova, T. L. Malkova, L. V. Terentyeva
CHEMICO-TOXICOLOGICAL INVESTIGATION OF URINARY KETOROLAC
The results of urinary ketorolac identification using thin-layer chromatography method in chemico-toxicological investigation are described in the present paper. Several solvent systems and chromogenic reagents were compared. UV-spectrometry, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography combined with mass selective detector (GC/MS) were used for ketorolac identification.
Keywords: identification, ketorolac, determination, methods of chromatography, biological fluid (urine).
Контактная информация: Петухова Наталья Николаевна, ассистент кафедры токсикологической химии Пермской государственной фармацевтической
академии,
614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48, тел. 8 (342) 248-16-73
Материал поступил в редакцию 01.03.2009
