CC BY
32
УДК 612.112:612.15:618.3:578.825.11 А.С.Соловьева
ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ И ОПСОНО-ФАГОЦИТАРНАЯ ФУНКЦИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БЕРЕМЕННЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ
ГЕРПЕСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН
РЕЗЮМЕ
В работе представлены результаты по метаболической и фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови у женщин с хронической герпесной инфекцией на разных этапах беременности. Использован хемилюминесцентный анализ, характеризующий метаболическую активность клеток, а также методы по определению фагоцитарной и кил-линговой функций лейкоцитов периферической крови.
Подтверждено, что обострение хронической гер-пес-вирусной инфекции у беременных приводит к повышенной продукции токсических форм кислорода, так называемому «дыхательному взрыву» и сопровождается усилением хемилюминесцентного ответа.
Лечение иммуноглобулином с титром антител к вирусу простого герпеса беременных способствует увеличению опсонической активности нейтрофилов за счет дополнительной экспрессии рецепторов клеток крови, что подтвердилось повышением фагоцитарной активности нейтрофилов.
SUMMARY
A.S.Solovieva
CHEMOLUMINISCENT ANALYSIS AND OPSON -PHAGOCYTIC FUNCTION OF LEUCOCYTES OF PERIPHERAL BLOOD IN PREGNANT PATIENTS
WITH CHRONIC HERPETIC INFECTION
The paper describes metabolic and phagocytic activity of peripheral leukocytes in patients with chronic herpetic infection during different gestation periods. To describe metabolic cell activity we used chemoluminiscent analysis as well as methods which enable to determine phagocytic and killing functions of peripheral leukocytes. We found out that deterioration of chronic herpes virus infection in pregnant women results in increased production of toxic oxygen forms and is accompanied by enhanced chemoluminiscent response.
Immunoglobuline with antibody titre to herpes virus increases opsonic activity of neutrophils, probably due to additional blood cell receptor expression which was confirmed by increased neutrophil phagocytic activity.
Герпес-вирусная инфекция занимает одно из ведущих причин перинатальной смертности. Установлена
возможность проникновения вируса через плаценту и заражение плода [8]. В противоинфекционной защите важная роль принадлежит функциональной активности лейкоцитов. Это связано с тем, что лейкоциты не только осуществляют фагоцитарную функцию, поддерживая иммунологический гомеостаз в организме, выделяют биологически активные вещества, влияющие на состояние других клеток [11], но и имеют определенный набор рецепторов, выполняя первую линию защиты при вирусе простого герпеса [10].
При стимуляции нейтрофилов различными агентами (зимозаном, частицами латекса и др.) происходит быстрое изменение внутриклеточных метаболических процессов, при котором одновременно возрастают потребление и окисление глюкозы в реакциях гексозомо-нофосфатного шунта, поглощение кислорода и продукция ряда биологически высокоактивных форм кислорода: супероксидного анион-радикала, гидроксильного радикала, перекиси водорода и, возможно, синглетного кислорода [12]. Эта серия метаболических реакций объединяется термином «респираторный взрыв». Биохимической основой респираторного взрыва является активация оксидазы - фермента, который при соответствующей стимуляции катализирует одноэлектронную редукцию кислорода. При этом расходуется НАДФН, который оксидаза нейтрофилов при респираторном взрыве использует в качестве физиологического субстрата. В процессе респираторного взрыва глюкоза, окисляясь в реакциях гексозомонофосфатного шунта, вновь восстанавливает НАДФ+ в НАДФН [1]. В течение дыхательного взрыва клетка секретирует протоны [6]. Хемилюминесценция (ХЛ) вследствие выхода протонов, которая сопровождает дыхательный взрыв, может использоваться для регистрации этого типа клеточной реакции [4, 5].
Материалы и методы исследования
Под наблюдением находились 77 женщин в возрасте от 18 до 36 лет, из них 28 женщин обследованы в период латентного течения хронической герпесвирусной инфекции (ХГВИ) в разные триместры беременности. У 27 беременных отмечалось обострение ХГВИ на разных этапах гестации. Диагноз устанавливался клинически на основании жалоб, анамнестических данных и характерных морфологических элементов высыпаний (локальная эритема, сгруппированные везикулы, эрозии, покрытые сероватым налетом с тенденцией к слиянию). Диагноз подтверждался обнаружением специфических к вирусу простого герпеса иммуноглобулинов класса М, регист-
рируемых иммуноферментным анализом.
Контрольную группу составили 22 практически здоровые небеременные женщины, не имеющие никакой гематологической, соматической и аллергической патологии и отягощенной наследственности по аллергическим заболеваниям в анамнезе.
С целью коррекции иммунного и интерферонового статуса применяли курс терапии иммуноглобулином с титром антител к вирусу простого герпеса (во II триместре беременности) и «Виферон» (150000 МЕ), начиная с 28 недели беременности [9].
Материалом исследования явилась периферическая кровь описанных групп женщин. Лейкоконцентрат получали путем отстаивания гепаринизированной венозной крови в термостате при температуре 370С в течение 2030 минут.
В качестве объекта фагоцитоза взята культура Staphylococcus aureus (209 музейный штамм) в концентрации 500 млн. микр. тел в 1 мл. В пробирку с лейкоцитарной взвесью вносили микробную культуру в рабочем разведении (соотношение 1:1) и перемешивали однократно пипеткой. Смесь ставили в термостат при 370С на 30 мин. (с целью определения поглотительной способности). Приготовленные из микробно- лейкоцитарной взвеси, препараты окрашивали по Романовскому-Гимзе и подсчитывали фагоцитарную активность (ФА) и коэффициент завершенности фагоцитоза (КЗФ) [3].
Для проведения ХЛ-анализа 100 мкл приготовленной лейковзвеси (в конечной концентрации 2000/мкл) помещали в кювету для сцинтилляционного счетчика (хемилюминометр CL-3603 АО «Диалог», Россия ) и регистрировали фоновый показатель ХЛ в течение 3-4 циклов. После добавления 40 мкл насыщенного изоос-молярного водного раствора люминола (5,6'Ю"4 М, рН 7,85) и 40 мкл фагоцитирующих частиц (опсонизирован-ный зимозан) определяли, соответственно, базальный показатель интенсивности ХЛ (БПИХЛ) и стимулированный показатель интенсивности ХЛ (СПИХЛ). Индекс активности ХЛ (КА) оценивали соотношением индуцированной зимозаном ХЛ к базальному уровню [2].
Результаты и обсуждение
Анализируя полученные результаты, характеризующие фагоцитарное звено иммунитета у женщин с латентным течением ХГВИ, следует отметить исходно достоверно сниженную фагоцитарную активность в I
триместре по сравнению с контролем (табл. 1). По-видимому, это связано с повышенной продукцией клетками токсических субстанций. К концу госпитализации этот показатель увеличивался, однако, такая положительная динамика коррелировала с переваривающей способностью нейтрофилов, т.е. активация нейтрофи-лов, вызывающая усиление фагоцитарной активности, не сопровождалась повышением их киллинговой функции. Такая закономерность прослеживалась и во II триместре беременности, причем, эти параметры превышали таковые в I триместре.
Исследуя метаболическую активность лейкоцитов, следует обратить внимание на то, что динамика показателей, выраженных базальной и стимулированной ХЛ, носила разнонаправленный характер. Несмотря на то, что во все триместры беременности исходные уровни базальной ХЛ лишь незначительно превышали таковые в контрольной группе, к концу госпитализации они увеличивались почти в 1,5 раза в I и II триместрах. Исходно повышенный показатель зимозаниндуцирован-ной ХЛ лишь в начале беременности имел тенденцию к значительному снижению к концу госпитального периода, что подтверждалось снижением КА. Характерно то, что период подъема и спада кривой был более продолжителен по времени в сравнении с исходным показателем [7].
Во II и III триместрах беременности уровень СПИХЛ увеличивался после курса лечения и статистически достоверно отмечался от аналогичного показателя в контрольной группе (см. табл. 1). Следует отметить, что во II триместре беременности параметр, характеризующий длительность интенсивности плато, после лечения увеличивался в большей степени, чем в I триместре (рис. 1). Это позволяет предположить о более долгом расходовании субстратов, необходимых для образования радикалов во время дыхательного взрыва.
Возможно, лечение иммуноглобулином с титром антител к вирусу простого герпеса вызывает активацию внутриклеточных метаболических процессов в лейкоцитах крови, что подтверждалось повышением базального и стимулированного уровней ХЛ. При этом, снижение киллинговой функции нейтрофилов, по-видимому, можно объяснить хронической антигенной нагрузкой, что отражает состояние функционального перенапряжения фагоцитов у больных в период ремиссии.
Таблица 1
Основные показатели ХЛ и фагоцитарного звена иммунитета у беременных с ХГВИ в стадии ремиссии
Группы БПИХЛ, имп/с СПИХЛ, имп/с Ка ФА, % КЗФ
I триместр, п=12 223,13±65,74 405,38±35,05** 2309,38±538,72** 2169,56±364,27*** 10,39±0,49*** 5,35±0,83 71,40±1,90*** 83,00±2,10 0,78±0,07* 0,68±0,08**
II триместр, п=9 317,41±42,48 492,00±72,48** 3087,09±461,90*** 4153,80±748,45*** 10,68±1,64** 8,44±0,76*** 90,80±1,69 93,88±2,55* 0,83±0,07 0,81±0,06
III триместр, п=7 215,29±39,13 240,43±34,06 2159,17±382,51** 3105,86±460,06*** 10,52±2,35* 12,92±0,99*** 86,67±5,74 79,33±6,83 0,80±0,13 0,70±0,03**
Контроль, п=22 213,00±26,70 688,30±151,20 3,70±1,00 85,32±1,97 0,95±0,05
Примечание: здесь и далее - в числителе значение до лечения, в знаменателе - после лечения. * р<0,5; ** р<0,01; *** р<0,001.
До лечения
После лечения
3500:
2800
2100
1400
СПР :хл — А / Л \» \ 1
/ / \ \
/ \, 1 ' ;
і I і І__ . :
г'"— : БПИХЛ 1
90
0 23 45 62
Рис. 1. Интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови беременной В. с латентным течением ХГВИ (II триместр). Здесь и далее: по оси абсцисс - время (в мин); по оси ординат - интенсивность (в имп.).
Таблица 2
Основные показатели ХЛ и фагоцитарного звена иммунитета у беременных с ХГВИ в стадии обострения
Группы БПИХЛ, имп/с СПИХЛ, имп/с Ка ФА, % КЗФ
I триместр, п=13 372,78+52,43* 302,78+60,83 3924,58+316,39*** 2300,00+325,43*** 10,55+0,88*** 6,04+0,73 92,10+1,70* 94,40+1,40* 0,70+0,06** 0,80+0,07
II триместр, п=9 379,28+51,83* 568,62+56,34*** 3027,00+475,42*** 4086,88+549,74*** 7,98+0,77** 7,18+1,17* 89,44+1,76 90,00+3,27 0,71+0,09* 0,81+0,05
III триместр, п=5 365,00+48,31* 406,40+54,43** 3717,40+327,62*** 4031,68+413,51*** 10,18+0,92*** 9,92+1,07*** 81,00+1,97 97,67+1,86*** 0,73+0,06** 0,87+0,07
Контроль, п=22 213,00+26,70 688,30+151,20 3,70+1,00 85,32+1,97 0,95+0,05
Исследования ХЛ-анализа у женщин с обострением ХГВИ в разные сроки беременности позволили выявить следующие особенности (табл. 2). Во-первых, исходные показатели как базальной, отражающий активность воспалительного процесса, так и зимозаниндуцированной ХЛ лейкоцитов превышали аналогичные данные у женщин с латентным течением ХГВИ и статистически достоверно отличались от контрольных значений. Это свидетельствовало о значительном повышении уровня метаболической активности клеток при обострении ХГВИ. Во-вторых, время достижения максимального значения СПИХЛ было значительно короче, чем при латентном течении герпес-вирусной инфекции (рис. 2). Возможно, это связано с активацией прооксидатных систем, которые отвечают за образование активных форм кислорода. К концу госпитального периода лишь в I
триместре оба показателя метаболической активности снижались. Можно предположить об истощении метаболических резервов в клетках крови, необходимых для адекватного ответа, чего не наблюдалось во II и III триместрах беременности после проведенного курса лечения.
Характеризуя фагоцитарное звено иммунитета у беременных с обострением ХГВИ, следует отметить, что исходно повышенный уровень поглотительной активности нейтрофилов в I и II триместрах к концу госпитализации имел тенденцию к увеличению. В III триместре беременности было достоверное повышение ФА (р<0,001). Такая динамика имела положительную корреляцию с переваривающей способностью нейтрофилов (см. табл. 2).
Таким образом, оценивая значение полученных данных в целом, можно полагать, что обострение ХГВИ
До лечения
После лечения
3500
Рис. 2. Интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови беременной К. в период обострения ХГВИ (II триместр).
приводит к активации метаболической активности лейкоцитов, что сопровождается усилением ХЛ-ответа этих клеток.
Отсутствие выраженной активации внутриклеточных метаболических процессов в I триместре беременности предполагает о низких резервах для функциональной активности гранулоцитарных клеток.
Лечение иммуноглобулином с титром антител к вирусу простого герпеса, вероятно, сопровождается дополнительной экспрессией различных рецепторов полиморфно-ядерных клеток крови, что подтверждается повышением фагоцитарной активности нейтрофилов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бахов Н.И., Александрова Л.З., Титов В.Н. и др. Нейтрофилы, их роль в регуляции метаболизма тканей//Успехи современной биологии.-1987.-Т.104, Вып.2.-С.281-296.
2. Земсков В.М., Барсуков А.А. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток): Методические рекомендации.- М., 1988.-19 с.
3. Козлюк А.С., Анисимова Л.А., Шройт И.Г. Иммунологические методы в клинических исследо-ваниях.-Кишинев, 1987.-118 с.
4. Луценко М.Т., Плюснина И.А. Хемилюминес-ценция и гистохимия лейкоцитов периферической крови больных бронхиальной астмой//Бюл. физиол. и патол. дыхания.- 2000.-Вып. 7.-С.49-54.
5. Хемилюминесцентный анализ функционального состояния клеточного и гуморального звеньев системы нейтрофильного фагоцитоза при рецидивирующей вирусной инфекции Herpes Simplex/А.В.Резайкина, Т.С.Куршакова, Н.М.Коли-ева, С.М.Федоров//Клин.лаб.диагн.-1995.-№1.-С.21-23.
6. Руководство по иммунофармакологии: Пер. с англ./Под. ред. М.М.Дейла, Дж.К.Формена.-М.: Медицина, 1988.-332 с.
7. Соловьева А.С. Опсоно-фагоцитарная характеристика лейкоцитов периферической крови у беременных с хронической герпес-вирусной инфекцией в
I триместре беременности//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2001.-Вып.8.-С.78-81.
8. Сухих Г.Т., Ванько М.В., Кулаков В.И. Иммунитет и генитальный герпес.-Н.Новгород, 1997.-224 с.
9. Тютюнник В.Л. Недостаточность плаценты и ВПГ-инфекция//Акуш. и гин.-2000.-№6.-С.57.
10. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Основные задачи
клинической иммунологии по изучению функциональной активности фагоцитирующих кле-
ток//Иммунология.-1995.-№3.-С.6-10.
11. Befus S.D., Mowat C., Gilchrist M. et al. Neutrophil defenses inaction//J. Immunol.-1999.-Vol.163, №2.-P.947-953.
12. Superoxide generation subjects with
asthma/S.Meltzer, B.Goldberg, P.Lad, J.Easton//J. Allergy Clin. Immunol.-1989.-Vol. 83.-P.960-966.
□ □□
