CC BY
218
о
HELICOBACTERSPP И БИЛИАРНАЯ ПАТОЛОГИЯ
Ильченко А. А.
Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии, Москва
РЕЗЮМЕ
В статье представлены последние сведения, касающиеся роли энтерогепатических хеликобактеров в этиологии и патогенезе холецистолитиаза, холецистита и рака желчного пузыря.
Ключевые слова: холецистолитиаз, холецистит, рак желчного пузыря, энтерогепатические хеликобактеры.
SUMMARY
In this article presented the latest information about enterogepatic helicobacter's role in etiology and pathogenesis of cholecystolithiasis, cholecystitis and gallbladder cancer.
Keywords: cholecystolithiasis, cholecystitis, gallbladder cancer, enterogepatic helicobacters.
В настоящее время проблема хеликобактериоза вышла далеко за пределы желудка — основной экологической ниши Helicobacter pylori. В последние 7 -10 лет стали появляться сообщения о возможной связи Helicobacter pylori (Нр) с другими заболеваниями — сердечно-сосудистыми (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, ишемическая цереброваскулярная болезнь, идиопатическая мигрень), аутоиммунными (синдром Шегрена, болезнь Паркинсона, Шенлейна — Геноха, аутоиммунный тиреоидит, тромбоцитопеническая пурпура), кожи (хроническая идиопатическая крапивница, прыщи, облысение) и другой патологией (печеночная энцефалопатия, хроническая идиопатическая си-деропения, железодефицитная анемия, задержка роста и внезапная смерть новорожденного) [7, 23, 24, 56 и др. ].
Действительно, при колонизации слизистой оболочки Нр включаются различные факторы
специфической и неспецифической защиты, происходит иммунный ответ макроорганизма в виде производства огромного количества провоспали-тельных цитокинов, белков острой фазы, проста-гландинов, выработка специфических антител (см. рис.). Несмотря на то что убедительных данных, свидетельствующих о причинно-следственных связях между Нр и развитием внежелудочных эффектов, в настоящее время не получено, нельзя отрицать прямого или косвенного влияния микроба на различные органы и системы макроорганизма. Динамический кумулятивный эффект в результате действия различных факторов вирулентности Нр на чувствительные мишени во взаимодействии с неспецифическими и специфическими факторами естественной резистентности макроорганизма и составляет суть хеликобактериоза [2]. Прямые эффекты возбудителя, например на сосудистую стенку, включают повреждение эндотелия или его
конференция
conference
заболеваний. Примечательно, что наличие аутоантител не было связано с какими-либо клиническими или гуморальными проявлениями заболевания.
Неудивительно, что интерес к роли Нр в развитии внежелудочных поражений постоянно увеличивается. Об этом свидетельствует хотя бы тот факт, что только в конце прошлого века (в 1995, 1997 и 1999 гг.) было проведено три международных симпозиума, посвященных этой проблеме [34].
В настоящее время проблема внежелудочных поражений при хеликобактериозе приобретает междисциплинарное значение и требует скоординированных действий ученых. Несмотря на то что убедительных фактов, указывающих на роль Нр в этиологии и патогенезе внежелудочной патологии, подобных тем, что мы имеем в настоящее время при хеликобактерассоциированных заболеваниях, не получено, отрицать такую связь нельзя.
Потенциальную роль Нр в патогенезе патологических изменений за пределами желудка и двенадцатиперстной кишки можно обосновать следующими положениями:
1. местный воспалительный процесс в слизистой оболочке желудка может оказывать системные эффекты;
2. хроническая колонизация Нр слизистой оболочки желудка стимулирует иммунные ответы, которые сами по себе способны причинять повреждения вдали от очага инфекции;
3. уничтожение Нр-инфекции способствует регрессии вне желудочной патологии.
Общеизвестно широкое распространение Нр-инфекции, что в определенной степени объясняет распространенность хеликобактерассоциированной патологии верхних отделов пищеварительного тракта. Однако внедрение молекулярной диагностики дало возможность подтвердить гипотезу: внежелу-дочные эффекты могут быть обусловлены не только Нр, а, возможно, и другими, неидентифицирован-ными видами Helicobacter.
В 1996 году японские исследователи сообщили об обнаружении у 41-летней женщины в резецированном по поводу холецистолитиаза желчном пузыре бактерий, близко напоминающих Helicobacter pylori, также окрашивающихся по Giemsa в синий и по Wartin — Starry в золотисто-коричневый цвет [31], но отличающихся по ряду признаков.
Эти данные послужили толчком для более пристального изучения рода Helicobacter, который стал постоянно расширяться за счет выявления все новых разновидностей. Так, к 1998 году их насчитывалось по крайней мере 18, из которых 11 колонизировали кишечный тракт млекопитающих и птиц [17]. К 2002 году — уже 31 вид, из них 22 — преимущественно с внежелудочной локализацией [27], а к 2008 году — 38, многие из которых являются патогенными или условно патогенными и были выделены от млекопитающих и птиц [29]. В табл. 1
Ö
О
сч
Цитотоксины
Г* (CagA, VacA)
mp:
Презентация Ag
Стимулированный
NTh
Врожденный иммунный ответ
^-специфический иммунный ответ
Рис. 1.
Врожденный и антиген-стимулированный ответ на Нр-инфекцию
дисфункцию, связанные с циркуляцией в крови эндотоксинов, поражением гладкой мускулатуры и локальным воспалением. Косвенные эффекты связывают с медиаторами, обладающими про-воспалительной, прокоагулянтной и атерогенной активностью, изменениями липидного профиля, факторами свертывания крови, метаболизмом антиоксидантов, продукцией перекрестно-реактивных антител, малабсорбции витаминов и компонентов пищи, а также нарушениями метаболизма, например с избыточной продукцией аммиака [7].
Учитывая тот факт, что инфицирование Нр часто происходит в детском возрасте, длительная антигенная стимуляция может приводить к существенным сдвигам в иммунном ответе и сопровождаться выработкой различных органоспецифических аутоантител. В связи с этим представляют интерес исследования, свидетельствующие о возможности выработки таких антител с последующим повреждением соответствующих органов-мишеней. Так, например, О. Оиапзо и соавт. [26] провели сравнение распространенности органоспецифических аутоантител среди 124 детей с диспепсией, инфицированных и не инфицированных Нр. Пробы сыворотки были тестированы на присутствие микросомальных аутоантител, аутоантител к париетальным клеткам, внутреннему фактору, тиреоглобулину, клеткам островков Лангерганса, декарбоксилазе глутаминовой кислоты, коре надпочечников, стероидпродуциру-ющим клеткам. Также были оценены уровни гаст-рина, пепсиногена А, пепсиногена С и антител к Нр. Частота выявления органоспецифических антител была выше у пациентов с наличием Нр, чем у неин-фицированных детей. На этом основании авторы делают вывод, что Нр-инфекция может быть триггерным фактором в развитии клинически активного аутоиммунного гастрита и/или иных аутоиммунных
Л
представлены некоторые разновидности хелико-бактеров, которые выделены из желчи, желчного пузыря или ткани печени некоторых животных, домашней птицы и человека.
Особое внимание привлекают микроорганизмы, являющиеся нормальными обитателями дистальных отделов тонкой, слепой и толстой кишки, которые при определенных условиях способны попадать в портальный кровоток, а затем и в печень, вызывая развитие патологического процесса. В настоящее время накоплены определенные факты, позволяющие говорить о роли так называемых энтерогепатических хеликобактеров в развитии гепатобилиарной патологии (холецистита, желчнокаменной болезни и рака желчного пузыря). О возможной транслокации микроорганизмов из кишечника свидетельствует тот факт, что в крови человека были обнаружены H. fennelliae, H. cinaedi, H. westmeadii [30, 49, 58, 59].
HELICOBACTER И ХОЛЕЦИСТИТ
Хронический некалькулезный, или бескаменный, холецистит (ХБХ) — одно из самых распространенных заболеваний не только билиарного тракта, но и среди заболеваний органов пищеварения [5]. Этиология ХБХ до настоящего времени не выяснена. Большинство исследователей в развитии ХБХ ведущую роль отводят инфекции. Предполагается, что ХБХ может быть исходом острого холецистита, хотя не всегда в анамнезе у больных удается найти указание на эпизоды этого заболевания. ХБХ иногда развивается после острой гнойной инфекции органов брюшной полости — острого гнойного аппендицита, аднексита, тяжелой пищевой токси-коинфекции [9].
Начало заболевания связывают с нарушением моторной функции желчного пузыря, особенно в сочетании с дисхолией, что способствует развитию асептического воспаления в слизистой оболочке. Инфекция, вероятно, присоединяется на последующих этапах заболевания. Микроорганизмы могут попадать в желчный пузырь гематогенным, лимфогенным или энтерогенным путем (восходящая инфекция). Развивается различной степени выраженности хронический вялотекущий воспалительный процесс, в основном в желчном пузыре, приводящий к нарушению основных его функций — сократительной и концентрационной.
Посев желчи на стандартные питательные среды иногда помогает установить этиологический фактор воспалительного процесса и определить чувствительность микрофлоры к антибиотикам. Однако даже при выраженных деструктивных процессах в стенке желчного пузыря микрофлора в пузырной желчи выявляется не более чем в половине случаев [1, 8 и др. ]. Причина высокого процента отрицательных результатов до настоящего времени остается неясной. В определенной мере этот факт мог быть
объяснен тем, что сама желчь обладает достаточно выраженными бактерицидными свойствами и мощными средствами иммунной защиты. Действительно, в хронизации патологического процесса и обострений ХБХ важная роль принадлежит состоянию иммунной системы. Инициация иммунного ответа в слизистых оболочках зависит в основном от антигенной стимуляции. Анализ состояния общего и местного гуморального иммунитета показывает, что при наличии воспалительного процесса в стенке желчного пузыря в крови отмечается повышение уровня всех классов иммуноглобулинов, в большей степени IgA [6]. Основная роль в реакциях местного гуморального иммунитета принадлежит секреторному иммуноглобулину А (sIgA), который является «первой линией обороны» на пути проникновения чужеродных агентов. SIgA препятствует адгезии микроорганизмов, их токсинов, лекарственных антигенов на эпителий слизистых оболочек, блокируя их проникновение во внутреннюю среду [6].
Известно, что состояние иммунной системы изменяется с возрастом. Хроническому течению холецистита способствует снижение иммунитета, более выраженное у пожилых больных. Исследования показывают, что факторы неспецифической защиты у больных пожилого возраста угнетаются больше, чем у лиц молодого и среднего возраста [10]. Однако причины изменения как клеточного, так и гуморального звена иммунитета оставались непонятны.
В 1996 году американские ученые C. L. Franklin и соавт. [21] выделили из желчного пузыря сирийских хомячков подвижные грамотрицательные бактерии, которые культивировались в микроаэ-рофильных условиях. По своим биологическим свойствам и нуклеотидной последовательности 16S rRNA они были близки к Helicobacter pametensis. Авторы предложили назвать этот микроб Helicobacter cholecystus.
Эти результаты послужили толчком для более углубленных исследований в клинике. C. P. Silva и соавт. в 2003 году [55] с помощью ПЦР и бактериологического исследования изучили образцы желчи и операционный материал 46 холецистэктомий у бразильских пациентов с холецистолитиазом. В качестве контроля были отобраны 18 пациентов без холецистолитиаза (доноры печени и пациенты, которым холецистэктомия была произведена в связи с ожирением). При посеве материала не удалось выделить никакой разновидности Helicobacter, в то время как хеликобактерная ДНК была выявлена в ткани желчного пузыря и желчи соответственно в 31,3 и 42,9%. Статистическая обработка материала показала корреляцию холелитиаза с женским полом,
конференция
conference
(N
(N
Таблица 1
ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ РАЗНОВИДНОСТИ HELICOBACTER, ОБНАРУЖЕННЫЕ В ЖЕЛЧИ, ЖЕЛЧНОМ ПУЗЫРЕ ИЛИ ТКАНИ ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА, НЕКОТОРЫХ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦЫ И ЧЕЛОВЕКА
Helicobacter Резервуар обитания Автор, год
H. pullorum Домашняя птица J. Stanley, 1994 [57]
H. canis Собака J. G. Fox, 1996 [19]
H. cholecystus Сирийские хомяки C. Franklin, 1996 [21]
H. rappini Овцы C. A. Kirkbride, 1985 [32]
H. hepaticus Мыши J. G. Fox, 1995 [20]
H. bilis Мыши J. M. Ward, 1994 [60]
H. pylori Человек T. Lin, 1995 [37]; J. G. Fox, 1998 [18]; H. Nilsson, 2001 [48]
увеличением возраста и присутствием хеликобак-терной ДНК в ткани желчного пузыря. В желчи присутствие хеликобактерной ДНК не коррелировало с холелитиазом. Существенная ассоциация выявлена между присутствием хеликобактерной ДНК в эпителии желчного пузыря и морфологически подтвержденным холециститом. Нуклеотидная последовательность 16S rRNA была > 99%, аналогичной Helicobacter pylori. Эти результаты позволили авторам поддержать гипотезу о том, что Helicobacter участвует в патогенезе холелитиаза и холецистита.
В 2005 году шведские ученые опубликовали результаты обследования 22 украинских пациентов с хроническим холециститом. С помощью молекулярной диагностики и иммуногистохимического исследования были изучены ткани желчного пузыря и материалы пункционной биопсии печени [12]. Хеликобактерная ДНК в образцах желчного пузыря была выявлена у 16 из 22 пациентов (73%) и у 11 из 22 (50%) в ткани печени. Иммуногистохимичес-кий анализ выявил хеликобактерные цитотоксины Cag A и Vag A в эпителиальных клетках желчного пузыря. На этом основании авторы заключают, что Helicobacter может быть причиной развития хронического холецистита.
HELICOBACTER И ХОЛЕЛИТИАЗ
Роль инфекции при желчнокаменной болезни изучалась достаточно длительно, однако не нашла существенного подтверждения. Лишь в образовании коричневых (пигментных) желчных камней, локализующихся преимущественно в желчных протоках, их формирование связывали с инфицированием желчных путей (кишечная палочка, клостридии, бактероиды и др.). Механизм образование таких камней объясняли тем, что под влиянием ß-глю-коронидазы бактерий происходит деконьюгация диглюкоронида билирубина, в результате чего осаждается нерастворимый неконьюгированный билирубин [3].
Немногочисленные публикации, касающиеся роли Helicobacter при гепатохоледохолитиазе, не дают однозначного ответа. Так, R. Boosendaal и со-авт. [52] обследовали 31 пациента с механической желтухой, у 28 из которых причиной желтухи был холедохолитиаз. В желчи, полученной при ЭРХ-ПГ при ПЦР-диагностике, лишь в одном случае был выявлен H. pylori 16S rDNA. В южнокорейском исследовании, насчитывающем 43 наблюдения с различными гепатобилиарными заболеваниями, с помощью ПЦР ни в одном случае не удалось выявить Нр ни в желчи, ни в ткани желчных протоков, ни в камнях внутрипеченочных желчных протоков [46]. Японские исследователи [28] изучили с помощью ПЦР образцы желчи, слизистой оболочки желчного пузыря и желчных протоков 69 пациентов с гепатолитиазом, холедохолитиазом, холецистоли-тиазом и с неизмененными желчными пузырями. Род Helicobacter был выявлен в 13% при гепатико-литиазе и в 10% при холедохолитиазе. Напротив, род Campylobacter был обнаружен в 21% в образцах желчи и в 63% в тканях при гепатолитиазе, а при холецистолитиазе — и в желчи, и в тканях желчного пузыря в 13% случаев. Анализ нуклеотидной последовательности Campylobacter показал, что он был близок к C. rectus или C. showae.
Таким образом, в настоящее время вопрос о возможном участии Helicobacter в патогенезе гепатоли-тиаза остается открытым.
Значительно больше работ посвящено изучению роли Helicobacter при холецистолитиазе. По данным бразильских исследований [55], несмотря на то что Helicobacter не удалось выделить в чистой культуре, хеликобактерная инфекция с помощью ПЦР была выявлена из ткани желчного пузыря и пузырной желчи соответственно в 31,3 и 49,9% случаев. В шведском исследовании [44], с помощью полимеразной цепной реакции изучены 20 холестериновых камней желчного пузыря. У 9 из 20 выявлены разновидности Helicobacter, в том числе у 3 — H. pylori. В итальянском исследовании ДНК H. pylori в желчи больных с холецистоли-
Таблица 2
ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ В ЖЕЛЧИ H. BILIS СРЕДИ ЯПОНСКИХ И ТАЙСКИХ ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЖЕЛЧНОГО ПУЗЫРЯ ИЛИ ЖЕЛЧНЫХ ПРОТОКОВ, %
Пациенты Патология
рак ЖКБ контроль
Японские 87 50 29
Тайские 79 38
тиазом была обнаружена в 51,5% случаев. При этом была отмечена положительная корреляция с присутствием Нр в гомогенате ткани желчного пузыря, наличием антигена Нр в стуле и колонизацией Нр в желудке [47]. Исследователи из Новой Зеландии [16] обследовали образцы желчного пузыря 122 пациентов после холецистэктомии по поводу различных заболеваний билиарного тракта. Хеликобактерная ДНК была обнаружена в 50% случаев. В 48,3% она выявлена у пациентов с симптоматическими желчными камнями, в 60% с бессимптомным течением и в 73% — с другими заболеваниями. Исследование нуклеотидной последовательности ДНК изученных образцов ткани желчного пузыря позволило установить, что из 61 хеликобактерположительных пациентов в 56 образцах был идентифицирован H. pylori и только у остальных 5 — другие разновидности Helicobacter, но не Helicobacter bilis. В турецком исследовании B. Abayli и соавт [11], изучив с помощью выделения чистой культуры, гистологического исследования и ПЦР 77 холестериновых камней и желчных пузырей, в 22 случаях обнаружили различную микрофлору (в большинстве случаев кишечную палочку), в 6 образцах был выявлен H. pylori, а в 7 — Helicobacterspp. Эти результаты позволили авторам высказать предположение о возможном участии в билиарном литогенезе и Helicobacter pylori.
В то же время в других исследованиях, из Германии [53] и Мексики [42], сообщается о неудачных попытках обнаружения хеликобактерной ДНК в желчи или ткани желчного пузыря при заболеваниях билиарного тракта.
Таким образом, анализ литературы показывает противоречивость результатов при исследовании роли Helicobacter в билиарном литогенезе. Этот факт может быть обусловлен несколькими причинами.
Во-первых, исследования проводились на различных группах больных без учета их социального статуса, местности проживания (городские или сельские жители, имеющие различную степень контакта с животными или птицей), характером и частотой применения антибактериальной терапии перед холецистэктомий, часто без группы контроля.
Во-вторых, чувствительностью методов, используемых для обнаружения Helicobacter. Как известно, чувствительность ПЦР по выявлению Нр по 16S
rRNA весьма низка и дает положительные результаты только тогда, когда содержание бактерий превышает 103 колониеобразующих единиц 1 мл [55]. Наоборот, кишечная разновидность Helicobacter была обнаружена с помощью обычной ПЦР, если сопровождалась ДНК-гибридизацией [18, 38]. Эти факты позволяют предполагать, что в билиарном тракте человека присутствуют различные виды Helicobacter, отличающиеся количеством микробов, а их общее число может превышать H. pylori.
В-третьих, кишечная разновидность Helicobacter (такие виды, как H. rappini, H. bilis, H. canis, H. cho-lecystus и H. pullorum) in vitro устойчива к желчи, что позволяет ей лучше приспосабливаться к обитанию в билиарном тракте.
Следует сказать, что даже обнаружение Helicobacter в различных биологических субстратах (желчи, ткани пузыря и желчных протоков, камнях) еще не является доказательством участия этих микроорганизмов в билиарном литогенезе. В связи с этим чрезвычайный интерес представляют экспериментальные данные, полученные K. Maurer и соавт. и опубликованные в журнале Gastroenterology в апреле 2005 года [39]. Мыши линии C57L/J (чувствительные к литогенной диете) были инфицированы различными энтерогепатическими видами Helicobacter и получали пищу, вызывающую образование камней. У мышей, которые были инфицированы H. bilis или H. hepaticus + H. rodentium, на фоне литогенной диеты за 8 недель в 80% случаев образовались желчные камни. При тех же условиях моноинфицирование H. hepaticus, H. cinaedi и H. rodentium привело к образованию камней соответственно в 40, 30 и 20%. На этом основании авторы предполагают, что энтерогепатические хеликобактеры играют важную роль в формировании холестериновых желчных камней у мышей
и, возможно, человека. И предлагают назвать этот вид хеликобактеров «холелитогенным».
В ответ на многочисленные публикации, свидетельствующие о возможной роли Нр в билиарном литогенезе, эти же авторы в 2006 году провели экспериментальное исследование на этой же линии мышей, но с инфицированием их Нр. Инфицирование Нр не вызывало формирования кристаллов моногидрата холестерина. Нр были не в состоянии
конференция
conference
стимулировать накопление муцина в желчном пузыре или изменять его размеры. У зараженных Нр мышей линии C C57L/J на 12-й неделе выявляли лишь характерные изменения в желудке в виде выраженного гастрита. На этом основании авторы делают заключение, что Нр не играют роли в формировании холестериновых желчных конкрементов у мышей [40].
Известно, что Нр колонизируют только желудочный эпителий или очаги желудочной метаплазии, которые могут располагаться и в других органах. В связи с этим особый интерес представляют данные индийских исследователей [43]. Для подтверждения возможной роли Нр в билиарном литогенезе авторы изучили 111 желчных пузырей с очагами желудочной метаплазии в слизистой оболочке желчного пузыря. Нр были выявлены в 45% случаев (у 50 из 111). Вероятно, только через этот путь может происходить инфицирование желчного пузыря, что позволяет вполне обоснованно говорить о возможном участии Нр в билиарном литогенезе.
Остается неясным, на какие звенья билиарного литогенеза влияет хеликобактерная инфекция. Известно, что желчь, перенасыщенная холестерином и особенно кристаллами холестерина, стимулирует продукцию муцина слизистой оболочкой желчного пузыря. Муцин относят к пронуклеирующим факторам, кроме того, муцин является своеобразным «цементирующим» раствором, который, скрепляя кристаллы холестерина вместе, формирует желчные камни. В последние годы было доказано, что в билиарном литогенезе продукция слизи бактериями имеет даже более важное значение, чем их глюкоронидазная активность. В связи с этим нельзя исключить, что присутствие хеликобактер-ной инфекции в желчном пузыре влияет именно на это звено билиарного литогенеза. В эксперименте K. Maurer и соавт. [39] было показано, что у мышей, инфицированных Helicobacter, в слизистой оболочке желчного пузыря развивается воспаление, которое также сопровождается повышенной продукцией муцина. Косвенным подтверждением этой гипотезы является факт быстрого формирования желчных камней (в течение 8 недель). Нельзя исключить и тот факт, что бактерии могут вырабатывать растворимый антиген или антигены, которые способны модулировать ключевые гены, ответственные как за продукцию слизи, так и за формирование литогенной желчи [36, 50].
Недавние исследования показали, что при инфицировании желчного пузыря развивается адаптивный иммунный ответ, сопровождающийся увеличением экспрессии гена, ответственного за продукцию слизи и накопление муцина. Кроме того, установлено, что Т-лимфоциты и кристаллы моногидрата холестерина вызывают провоспа-лительную экспрессию генов в желчном пузыре, способствующую развитию дисфункции желчно-
го пузыря [41]. В связи с этим можно предполагать, что значение приобретенного иммунитета и воспаления в холелитогенезе будет возрастать и, возможно, они станут критическими факторами в патогенезе холестериновых желчных камней.
Учитывая экологическую нишу энтерогепатичес-ких хеликобактеров, вполне логично предположить, что они могут модулировать и энтерогепатичес-кую циркуляцию желчных кислот, влияя прямо или косвенно (через генную регуляцию энтероцита) на процессы абсорбции в кишке.
К другим возможным факторам, влияющим на процессы билиарного литогенеза, можно отнести и различные медиаторы воспаления, сек-ретируемые в ответ на антигенную стимуляцию, которые способны изменять фазовое равновесие желчи и тем самым ускорять образование кристаллов холестерина.
Слабым местом в изложенной концепции является тот факт, что микробы удается обнаружить не у всех больных с холелитиазом, а также они выявляются и у части пациентов без желчных камней. Эти веские аргументы позволяют говорить, что инфекция не является обязательным фактором билиарного литогенеза, а, скорее всего, выступает в качестве кофактора. Вместе с тем по мере накопления фактов уже в ближайшее время можно предполагать появление новой гипотетической биологической модели холелитиаза, демонстрирующей три основных патофизиологических фактора (окружающая среда, наследственность и инфицирование энтерогепати-ческими хеликобактерами), каждый из которых вносит свой вклад в образование холестериновых желчных камней, способствует развитию воспаления, метаплазии, дисплазии и, возможно, потенцирует развитие рака желчного пузыря.
HELICOBACTER И РАК ЖЕЛЧНОГО ПУЗЫРЯ
Длительное камненосительство традиционно считается фактором риска по раку желчного пузыря. Например, среди чилийских женщин, где распространенность желчнокаменной болезни достигает 47%, смертность от рака желчного пузыря стоит на первом месте [20]. В последнее время интерес к этой проблеме особенно возрос. Это связано с двумя причинами.
Во-первых, внедрение в широкую клиническую практику лапароскопической холецистэктомии привело к значительному увеличению числа холецистэктомий. В связи с этим во время операции или после нее все чаще стали выявляться так называемые «непредвиденные» случаи рака желчного пузыря [35, 61, 62].
Во-вторых, в последние годы появились исследования, свидетельствующие о том, что выявляемые в желчном пузыре разновидности хеликобактеров
Л
ю
CN
могут принимать участие в билиарном канцерогенезе.
Этиология злокачественных опухолей билиарного тракта остается неясной. Однако давно отмечено, что рак желчного пузыря значительно чаще встречается на фоне холецистолитиаза. Частота обнаружения желчных камней у больных раком желчного пузыря достигает 80-90%. Особенно высокий риск развития злокачественной опухоли имеется у лиц с длительным камненосительством. В связи с этим рак желчного пузыря наиболее часто встречается в возрасте 65-70 лет.
Считалось, что основная причина развития раковой опухоли в желчном пузыре связана с длительным механическим раздражением стенки желчного пузыря. Однако в последующем было показано, что роль холецистолитиаза в канцерогенезе значительно сложнее. Длительное камненосительство сопровождается нарушением желчеоттока, способствует застою желчи и присоединению инфекции, которая в свою очередь изменяет энтерогепатичес-кую циркуляцию как первичных, так и вторичных желчных кислот, являющихся коканцерогенными факторами и способных запускать процессы канцерогенеза. Так, по данным V. Sharma и соавт. [54], уровни первичных (холевой и хенодеоксихолевой) желчных кислот были статистически достоверно снижены, а вторичных (деоксихолевой и оксихо-лановой (литохолевой) были повышены при раке желчного пузыря (7,268, 9,183, 14,468, 3,312 мг/мл соответственно), чем при холелитиазе (17,50, 13,80, 6,07, 2,05 мг/мл) и в контрольной группе (19,85, 16,53, 2,71, 1,128 мг/мл соответственно).
Однако убедительных признаков этиологической связи между ЖКБ и раком желчного пузыря до настоящего времени не получено. Несмотря на то что действительно у подавляющего большинства больных раком желчного пузыря находят желчные камни, лишь примерно у 1% камненоси-телей в последующем развивается рак. Замечено, что развитию опухоли желчного пузыря может способствовать и другая патология: неспецифический язвенный колит, aномалии слияния вирсунгова протока с общим желчным протоком, патологические рефлюксы панкреатического сока в билиарный тракт. Вероятность развития опухоли (до 20-25%) возрастает у пациентов с кальцифицированным («фарфоровым») желчным пузырем.
Роль микрофлоры в билиарном канцерогенезе изучена относительно мало. Имеются лишь отдельные указания, что, например, при тифо-парати-фозной инфекции желчного пузыря риск развития бластоматозного процесса в нем увеличивается в 167 раз [15]. В связи с этим особый интерес представляют сведения, свидетельствующие об обнаружении различных видов Helicobacter у пациентов со злокачественными заболеваниями билиарного тракта. В настоящее время в качестве нового фак-
тора риска развития рака желчного пузыря рассматривается колонизация гепатобили-арной системы устойчивыми к воздействию желчи разновидностей Helicobacter. Имеются данные, свидетельствующие о том, что эти микробы часто выявляют в странах с высокой распространенностью рака желчного пузыря.
По данным разных авторов, при раке желчного пузыря частота обнаружения хелико-бактерной ДНК в образцах желчи или ткани билиарного тракта составляет 28-86% [22, 33,
45]. Среди немногочисленной литературы по этой проблеме особый интерес представляют результаты японских авторов [38], изучавших частоту обнаружения H. bilis среди японских и тайских больных раком желчного пузыря или желчных протоков (табл. 2), так как известно, что в этих странах распространенность билиарного рака и ЖКБ наибо- Н_ лее высокая. В более поздних исследованиях другими японскими авторами было показано, что частота выявления H. bilis при злокачественных поражениях билиарного тракта составляет 28,6% [45]. Немецкие ученые [14] обследовали на наличие H. pylori 89 пациентов с различной билиарной патологией (63 — с желчными камнями, 15 — раком билиарного тракта и 11 пациентов — без камней и рака) и установили, что H. pylori встречается при желчных камнях в 3,5 раза чаще, а при билиарном раке — в 9,9 раза чаще по сравнению с контролем.
В другом, более позднем немецком исследовании, проведенном в 2007 году и включающем 99 пациентов, перенесших холецистэктомию (57 случаев ЖКБ, 20 случаев рака желчного пузыря и 22 пациента контроля), наличие Helicobacter spp. было изучено с помощью выделения чистой культуры, иммуногистохимии и ПЦР с определением 16S rRNA всех известных в настоящее время хеликобактеров. Хеликобактерная инфекция не была обнаружена с помощью выделения чистой культуры или иммуногистохимии. Только у одного из них она была выявлена с помощью ПЦР, показавшая гомологию к 16S rRNA, наиболее близкую к последовательности, характерную для Helicobacter ganmani. Низкая распространенность хеликобактерной инфекции в исследованных желчных пузырях позволила авторам утверждать об отсутствии преобладающей роли ее в патогенезе ЖКБ и рака желчного пузыря в немецкой популяции. Низкая распространенность хеликобактерной инфекции, возможно, объясняется относительно низкой частотой рака желчного пузыря среди немецкой популяции, несмотря на то что ЖКБ является главным фактором риска для рака желчного пузыря [13].
В других исследованиях, наоборот, представлены данные, указывающие на высокую частоту обнаружения хеликобактерной инфекции при зло-
конференция
conference
ю
(N
качественных поражениях желчного пузыря. Так, по данным S. B. Pradhan и S. Dali [51], Helicobacter hepaticus был найден в 82% удаленных желчных пузырей и в 87,5% случаев злокачественных поражений. Авторы утверждают, что Helicobacter hepaticus может быть одной из причин, способствующих формированию желчных камней, и в итоге приводить к злокачественному поражению желчного пузыря. На этом основании авторы считают H. hepaticus одним из факторов риска по билиарному литогенезу и раку желчного пузыря и предлагают проводить исследование на наличие этой инфекции в клинической практике.
Лишь единичные работы указывают возможные пути реализации канцерогенного эффекта энтеро-гепатических хеликобактеров — через ускорение клеточного обновления, метаплазию и дисплазию эпителия слизистой оболочки желчного пузыря.
Таким образом, в настоящее время нельзя однозначно ответить, какова роль хеликобактерной инфекции в билиарном канцерогенезе, как и нет убедительных доказательств, указывающих, на какие конкретно звенья патологического процесса могла бы оказывать влияние колонизация билиарного тракта энтерогепатическими хеликобактерами. Дальнейшее накопление знаний в этом направлении позволит уточнить роль этих микроорганизмов в развитии злокачественных поражений билиарного тракта.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время проблема пилорического хели-кобактериоза вышла за пределы первоначальной экологической ниши — ведется интенсивное изучение не только внежелудочных его проявлений, но и оценивается роль других видов Helicobacter в развитии различной гастроэнтерологической патологии, и билиарной в частности. Несмотря на то что это новое, стремительно развивающееся научное направление приносит еще много достаточно противоречивых результатов, его нельзя считать бесперспективным.
Если оглянуться на два десятилетия назад, можно вспомнить, с какой долей скепсиса воспринимались первые результаты, оценивавшие роль Helicobacter pylori в этиологии и патогенезе хронического гастрита и язвенной болезни. Развитие этого направления, сделавшего настоящую революцию в гастроэнтерологии, встречало определенное сопротивление в научном мире. По этому поводу была опубликована масса статей под общим названием: «Helicobacter pylori — сапрофит, сателлит или патоген?»
Применительно к билиарной патологии по крайней мере три направления, оценивающие роль Helicobacter spp. в развитии хронического холецистита, холелитиаза и рака желчного пузыря, можно считать весьма перспективными.
ЛИТЕРАТУРА
1. Богомаз, В. М. Микробиологическое исследование желчи при хроническом холецистите. Материалы девятой Российской гастроэнтерологической недели 20-23 октября 2003, Москва/В. М. Бо-гомаз//Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2003; 5 (13. — С. 101.
2. Жуховицкий, В. Г. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori/В. Г. Жу-ховицкий//Язвенная болезнь. Новые аспекты патогенетической терапии/А. С. Логинова, Л. И. Аруина, А. А. Ильченко. — М.: ЦНИИГ, 1993. — 230 с.
3. Ильченко, А. А. Желчнокаменная болезнь / А. А. Ильченко. — М.: Анахарсис, 2004. — 200 с.
4. Ильченко, А. А. Роль Helicobacter pylori в этиологии и патогенезе язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Патогенетическая терапия: дисс.... докт. мед. наук/А. А. Ильченко. — М., 1991. — 297 с.
5. Ильченко, А. А. Заболевания желчного пузыря и желчных путей. Руководство для врачей/А. А. Ильченко. — М.: Анахарсис,
2006. — 500 с.
6. Ильченко, А. А. Состояние местного и общего гуморального иммунитета при холецистолитиазе и билиарном сладже/А. А. Ильченко, Т. В. Вихрова, М. М. Зотина//Рос. гастроэнтерол. журн. —
2001. — № 1. — С. 10-15.
7. Исаков, В. А. Хеликобактериоз / В.А.Исаков, И.В. Домарадс-кий. — М.: Медпрактика-М, 2003. — 411 с.
8. Катанов, Е. С. Современные особенности микрофлоры желчи желчного пузыря при остром и хроническом воспалении. Материалы 6-го Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург — Гастро-2004» / Е.С. Катанов, А.Е. Леонтьев, П.В. Родин и др. // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. — 2004. — № 2-3. — М58.
9. Руководство по гастроэнтерологии. Под ред. Ф. И. Комарова. — М.: Медицина, 1995. — Т. 2.
10. Шапкин, В. Е. Особенности иммунного статуса при хроническом холецистите у больных пожилого возраста. Материалы
восьмой Российской гастроэнтерологической недели 18-21 ноября
2002, Москва/В. Е. Шапкин, Е. В. Власенко, А. А. Заздравнов и др./ /Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. — 2002. — Т. 5, № 12. — С. 110.
11. Abayli, B. Helicobacter pylori in the etiology of cholesterol gallstones/B. Abayli, S. Colakoglu, M. Serin et al.//J. Clin. Gastroenterol. — 2005. — Vol. 39, № 2. — P. 134-137.
12. Apostolov, E. Helicobacter pylori and other Helicobacter species in gallbladder and liver of patients with chronic cholecistitis detected by immunological and molecular methods/E. Apostolov, W. A. Al-Soud, I. Nilsson et al.//Scand. J. Gastroenterol., 2005. — Vol. 40, № 1. — P. 96-102.
13. Bohr, U. R. Low prevalence of Helicobacteriaceae in gall-stone disease and gall-bladder carcinoma in the German population/U. R. Bohr, D. Kuester, F. Meyer et al.//Clin. Microbiol. Infect. 2007. — Vol. 13,
№ 5. — P. 525-531.
14. Bulajic, M. Helicobacter pylori and the risk of benign and malignant biliary tract disease/M. Bulajic, P. Maisonneuve, W. Schneider-Brachert et al.//Cancer. 2002. — Vol. 95, № 9. — P. 1946-1953.
15. Caygill, C.P. J. Cancer mortality in chronic typhoid and paratyphoid carriers/C. P. J. Caygill, M. J. Hill, M. Braddick et al.//Lancet. — 1994. — Vol. 343. — P. 83.
16. Chen, W. Common presence of HelicobacterDNA in the gallbladder of patients with gallstone diseases and controls/W. Chen, D. Li, R. J. Cannan et al.//Dig. Liver. Dis. — 2003. — Vol. 35, № 4. — P. 237-243.
17. Fox, J. Enterohepatic Helicobacters: natural and experimental models/J. Fox//Ital. J. Hepatol. — 1998, Suppl. 3. — S. 264-269.
18. Fox, J. G. Helicobacter bilis sp. nov., a novel Helicobacter isolated from bile, livers, and intestines of aged, inbred mouse strains/J. G. Fox, L. Yan, F. E. Dewhirst et al.//J. Clin. Microbiol. — 1995. — Vol. 33. — P. 445-454.
19. Fox, J. Helicobacter canis isolated from a dog liver and multifocal necrotizing hepatitis/J. Fox, R. Drolet, R. Higgins et al.//J. Clin. Microbiol. — 1996. — Vol. 34. — P. 2479-2482.
20. Fox, J. G. Hepatic helicobacter species identified in bile and gallbladder tissue from Chileans with chronic cholecystitis/J. G. Fox, F. E. Dewhirst, Z. Shen et al.//Gastroenterology. — 1998. — Vol. 114. — P. 755-763.
21. Franklin, C. L. Isolation of a novel Helicobacter species, Helicobacter cholecystus sp. nov., from the gallbladders of Syrian hamsters with cholangiofibrosis and centrilobular pancreatitis/C. L. Franklin, C. S. Beckwith, R. S. Livingston et al.//J. Clin. Microbiol. — 1996. — Vol.
34, № 12. — P. 2952-2958.
Г-v
(N
22. Fukuda, K. Comparative analysis of Helicobacter DNAs and biliary pathology in patients with and without hepatobiliary cancer/K. Fukuda, T. Kuroki, Y. Tajima et al.//Carcinogenesis. — 2002. — Vol. 23, № 11. — P. 1927-1931.
23. Gasbarrini, A. Helicobacter pylori and extragastric diseases — other helicobacters/A. Gasbarrini, E. Carloni, G. Gasbarrini et al.//Helico-bacter. — 2003. — Vol. 8, Suppl. 1. — P. 68-76.
24. Gasbarrini, A. Extradigestive manifestation of Helicobacter pylori gastric infection/A. Gasbarrini, F. Franceschi, A. Armuzzi et al.//Gut. — 1999. — Vol. 45. — P. I9 — I12.
25. Goodwin, C. S. Campylobacter pyloridis, gastritis and peptic ulceration/C. S. Goodwin, J. A. Armstrong, B. J. Marshall//Aus. J. Clin. Pathol. — 1986. — Vol. 39, № 4. — P. 353-365.
26. Guariso, G. Organ-specific autoantibodies in children with Helicobacter pylori infection/G. Guariso, F. Brotto, D. Basso et al.//Helico-bacter. — 2004. — Vol. 9. — P. 622-628.
27. Ha, S.L. Extragastric Helicobacter species/S. L. Ha, S. Hynes, T. Wad-strom//Helicobacter. — 2002. Suppl. 1. — P. 63-67.
28. Harada, K. Frequent molecular identification of Campylobacter but not Helicobacter genus in bile and biliary epithelium in hepatolithiasis/K. Harada, S. Ozaki, N. Kono//J. Pathol. — 2001. — Vol. 193. — P. 218-223.
29. Harbour, S. Immunogenicity and pathogenicity of Helicobacter infections of veterinary animals/S. Harbour, P. Sutton//Vet. Immunol. Immunopathol. — 2008. — Vol. 122, № 3-4. — P. 191-203.
30. Hung, C. C. Bacteremia caused by Helicobacter cinaedi in an AIDS patient/C. C. Hung, P. R. Hsueh, M. Y. Chen et al.//J. Formosan Med. Assoc. — 1997. — Vol. 96. — P. 558-560.
31. Kawaguchi, M. Bacteria chlosely resembling Helicobacter pylori detected immunogistologically and genetically in resected gallbladder mucosa/M. Kawaguchi, T. Saito, H. Ohno et al.//J. Gastroenterol. — 1996. — Vol. 31, № 2. — P. 294-298.
32. Kirkbride, C. A. Ovine abortion associated with an anaerobic bacterium/C. A. Kirkbride, C. E. Gates, J. E. Collins et al.//J. Am. Vet. Med. Assoc. — 1985. — Vol. 186. — P. 789-791.
33. Kobayashi, T. Helicobacter genus DNA fragments are commonly detectable in bile from patients with extrahepatic biliary diseases and associated with their pathogenesis/T. Kobayashi, K. Harada, K. Miwa et al.//Dig Dis Sci. — 2005. — Vol. 50, № 5. — P. 862-867.
34. Konturek, S. I. Role of Helicobacter pylori infection in extragastroduode-nal disorders: introductoru remarks/S. I. Konturek, P. C. Konturek, P. Pien-iazek et al.//J. Physiol. Pharmacol. — 1999. — Vol. 50, № 5. — P. 683-694.
35. Lam, C. M. Gallbladder cancer presenting with acute cholecystitis: a population-based study/C. M. Lam, A. W. Yuen, A. C. Wai et al.//Surg.
Endosc. — 2005. — Vol. 19, № 5. — P. 697-701.
36. Lee, S. P. Role of gallbladder mucus hypersecretion in the evolution of cholesterol gallstones/ S.P. Lee, J.T. LaMont, M.C. Carey //J. Clin. Invest. — 1981. — Vol. 67. — P. 1712-1723.
37. Lin, T. T. Detection and partial sequence analysis of Helicobacter pylori DNA in the bile samples/T. T. Lin, C. T. Yeh, C. S. Wu et al.//Dig. Dis. Sci. — 1995. — Vol. 40. — P. 2214-2219.
38. Matsukura, N. Association between Helicobacter bilis in bile and biliary tract malignancies: H. bilis in bile from Japanese and Thai patients with benign and malignant diseases in the biliary tract/N. Matsukura, S. Yokomuro, S. Yamada et al.//Jpn. J. Cancer Res. — 2002. — Vol. 93, № 7. — P. 842-847.
39. Maurer, K. J. Identification of cholelithogenic enterohepatic Helicobacter species and their role in murine cholesterol gallstone formation / K.J. Maurer, M.M. Ihrig, A.B. Rogers et al. //Gastroenterology. — 2005. — Vol. 128, № 4. — P. 1023-1033.
40. Maurer, K. J. Helicobacter pylori and cholesterol gallstone formation in C57L/J mice: a prospective study/K. J. Maurer, A. B. Rogers, Z. Ge et al.//Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 2006. — Vol. 290, № 1. — G175-182.
41. Maurer, K. J. T-cell function is critical for murine cholesterol gallstone formation / K.J. Maurer, V.P. Rao,Z.Ge et al. //Gastroenterology. —
2007. — Vol. 133, № 4. — P. 1304-1315.
42. Mendez-Sanchez, N. Lack of association between Helicobacter sp. colonization and gallstone disease/N. Mendez-Sanchez, R. Pichardo, J. Gonzalez et al.//J. Clin. Gastroenterol. — 2001. — Vol. 32. — P. 138-141.
43. Misra, V. Helicobacter pylori in areas of gastric metaplasia in the gallbladder and isolation of H. pylori DNA from gallstones/V. Misra,
S. P. Misra, M. Dwivedi et al.//Pathology. — 2007. — Vol. 39,
№ 4. — P. 419-424.
44. Monstein, H. J. Identification of Helicobacter pylori DNA in human cholesterol gallstones/H. J. Monstein, Y. Jonsson,
J. Zdolsek et al.//Scand. J. Gastroenterol. — 2002. — Vol. 37,
№ 1. — P. 112-119.
45. Murata, H. Helicobacter bilis infection in biliary tract cancer/H. Murata, S. Tsuji, M. Tsujii et al.//Aliment Pharmacol Ther. — 2004. — Vol. 20, Suppl. 1. — P. 90-94.
46. Myung, S. J. Detection of Helicobacter pylori DNA in human biliary tree and its association with hepatolithiasis/S. J. Myung,
M. H. Kim, K. N. Shim//Dig. Dis. Sci. — 2000. — Vol. 45, № 7. —
P. 1405 - 1412.
47. Neri, V. DNA sequences and proteic antigens of H. pylori in cholecystic bile and tissue of patients with gallstones/V. Neri,
M. Margiotta, V. De Francesco et al.//Aliment. Pharmacol.
Ther. — 2005. — Vol. 22, № 8. — P. 715-720.
48. Nilsson, H. O. Identification of Helicobacter pylori and other Helicobacter species by PCR, hybridization, and partial DNA sequencing in human liver samples from patients with primary sclerosing cholangitis or primary biliary cirrhosis/H. O. Nilsson,
J. Taneera, M. Caastedal et al.//J. Clin. Microbiol. — 2000. — Vol.
38. — P. 1072-1076.
49. Orlicek, S. L. Septicemia and meningitis caused by Helicobacter cinaedi in a neonate/S. L. Orlicek, D. F. Welch, T. L. Kuhls/
/J. Clin. Microbiol. — 1993. — Vol. 31. — P. 569-571.
50. Paigen, B. Gallstones / B. Paigen, M. C. Carey// R. A. King,
J. l. Rotter, A. G. Motulsky, eds./The genetic basis of common diseases. 2nd ed. — NewYork, NY: Oxford University Press,
2002. — P. 298-335.
51. Pradhan, S. B. Relation between gallbladder neoplasm and Helicobacter hepaticus infection/S. B. Pradhan, S. Dali//Kathmandu Univ. Med J (KUMJ). — 2004. — Vol. 2, № 4. — P. 331-335.
52. Roosendaal, R. Helicobacter species are not detectable by 16S rDNA PCR in bile from Dutch patients with common bile duct stones/R. Roosendaal, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls et al.//Digestion. —
2002. — Vol. 66, № 2. — P. 89-91.
53. Rudi, J. Helicobacter sp. are not detectable in bile from German patients with biliary disease/J. Rudi, A. Rudy, M. Maiwald et al.//Gas-
troenterology. — 1999; 116. — P. 1016-1017.
54. Sharma, V. Role of bile bacteria in gallbladder carcinoma/V. Sharma, V. S. Chauhan, G. Nath et al.//Hepatogastroenterology. — 2007. — Vol.
54. № 78. — P. 1622-1625.
55. Silva, C. P. Association of the Helicobacter in gallbladder tissue with cholelithiasis and cholecystittis/C. P. Silva, J. C. Pereira-Lima, A. G. Oliveira et al.//J. Clin. Microbiol. — 2003. — Vol. 41, № 12. — P. 5615-5618.
56. Solnick, J. V. Extragastric manifestations of Helicobacter pylori infection — other Helicobacter species/J. V. Solnick, F. Franceschi, D. Roccarina et al.//Helicobacter. — 2006. — Vol. 11, Suppl. 1. — P. 46-51.
57. Stanley, J. Helicobacter pullorum sp. nov.-genotype and phenotype of a new species isolated from poultry and from human patients with gastroenteritis / J. Stanley, M.Linton, A.P. Burnens et al. //Microbiology. — 1994. — Vol. 140. — P. 3441-3449.
58. Sullivan, A. K. Recurrent Helicobacter cinaedi cellulites and bacterae-mia in a patient with HIV infection/A. K. Sullivan, M. R. Nelson, J. Walsh et al.//Int. J. STD AIDS. — 1997. — Vol. 8. — P. 69-70.
59. Trivett-Moore, N. L. Helicobacter westmeadii sp. nov., a new species isolated from blood cultures of two AIDS patients/N. L. Trivett-Moore, W. D. Rawlinson, M. Yuen et al.//J. Clin. Microbiol. — 1997. — Vol.
35. — P. 1144-1150.
60. Ward, J. M. Chronic active hepatitis and associated liver tumors in mice caused by a persistent bacterial infection with a novel Helicobacter species/J. M. Ward, J. G. Fox, M. R. Anver et al.//J. Natl. Cancer Inst. — 1994. — Vol. 86. — P. 1222-1227.
61. Weinstein, D. Incidental finding of gallbladder carcinoma/D. Weinstein, M. Herbert, N. Bendet et al.//Isr. Med. Assoc. J. — 2002. — Vol. 4, № 5. — P. 334-336.
62. Zhang, L. Analysis of the treatment of unexpected gallbladder cancer/L. Zhang, F. Han, C. S. Huang et al.//Zhonghua Wai Ke Za Zhi. — 2005. — Vol. 43, № 7. — P. 460-462.
конференция
conference
