CC BY
10
Е.А. Мурина, Н.В. Скрипченко, О.В. Голева, З.А. Осипова, М.В. Иванова, Н.Ф. Пульман
Характеристика циркулирующих в Северо-Западном регионе энтеровирусов в период с 1974 по 2015 год
ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней» ФМБА России,
г. Санкт-Петербург
E.A. Murina, N.V. Skripchenko, O.V. Goleva, Z.A. Osipova, M.V. Ivanova, N.F. Pullman
Features of enteroviruses circulating in the North-West region of russia
over the period of 1974-2015
Pediatric Research and Clinical Center for Infectious Diseases, Saint Petersburg
Ключевые слова: энтеровирусы, доминирующие Keywords: enteroviruses, dominating serotypes,
серотипы, эпидемический процесс, виру лент- epidemic process, virulence, diagnostics.
ность, диагностика.
С помощью ускоренного теста модифицированной реакции связывания комплемента (м-РСК) для выявления энтеровирусных антигенов у пациентов, обследуемых в клинике ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России, на базе отдела вирусологических и молекулярно-биологических методов исследования проведено более чем 40-летнее слежение за циркулирующими патогенными штаммами энтеровирусов в СевероЗападном регионе. Благодаря разработанной экспрессной диагностике энтеровирусных инфекций удалось осуществить непрерывный мониторинг за циркуляцией энтеровирусов и выявить сменность доминирующих и не доминирующих энтеровирусных серотипов, а также охарактеризовать свойства, определяющие степень их вирулентности в эпидемическом процессе. Доминирующие вирусы достигали максимальной репродукционной активности при температуре 40°С (К&40>1,0) и имели высокую устойчивость к интерферону, что вело к усугублению клинической картины заболевания, тогда как активизация сопутствующих вирусов происходила при сниженной температуре до 37°С (Я^40<1,0), обусловливая более легкое течение заболевания. Циркуляция доминирующих серотипов во взрослой популяции прекращалась через 2—4 года с возрастанием их этиологической значимости среди детского населения.
At the Department of Virology and Molecular-Biological Studies there has been performed a 40-year observation of enterovirus pathogenic strains circulating in the Northwest Region. Studies were conducted by the Modified Complement Binding Reaction Express Test (m-CBR) to reveal enterovirus antigens in patients followed up in the Medical Center at Scientific Research Institute of Children's Infections. Due to the developed express-diagnostics of enteroviral infections it has become possible to carry out continuous monitoring of enteroviruse circulation in the region and to reveal the interchangeability of dominat and nondominat serotypes of enteroviruses as well as to characterize the features defining the virulence in the epidemic process. The dominat viruses reach their reproductive maximum at 40°C (Rct4(/>1.0) and develop a high interferon resistance what results in aggravation of the clinical presentation of the disease, whereas activation of the accompanying viruses ocure at the lowered temperature - near 37°C (Rct40<1.0) and results in less severe forms of the disease. Circulation of the dominat serotypes in adult population stopped in 2—4 years along with the increase of their etiologic importance among children population.
Заболевания, вызываемые энтеровиру-сами, до настоящего времени по-прежнему занимают лидирующие позиции в инфекционной патологии человека как по числу больных, так и по частоте неблагоприятных последствий [4; 5].
Значительное число серотипов энтеро-вирусов, которые, сменяя друг друга, могут поддерживать высокий уровень эпидемично-сти, создавать возможность длительной циркуляции и персистенции отдельных сероти-пов и быть достаточно устойчивыми как во внешней среде, так и в кислой среде кишечника, могут быть причинами развития тяжелых заболеваний у детского населения.
Филогенетически и онтогенетически энтеровирусы приспособлены вызывать у людей различные клинические формы инфекций при репродукции одного и того же се-ротипа вируса. Это создает предпосылки для «ускользания» вируса от первичной иммунной защиты, давая осложненные формы заболевания по типу locus minoris resistentiae.
Энтеровирусы обладают большой серологической вариабельностью и являются возбудителями энтеровирусных инфекций у населения с избранным поражением практически всех жизненно важных органов и систем [6]. Характерная особенность энтеровиру-сов — развитие манифестных форм заболеваний нервной системы, к которым относятся серозный менингит, менингоэнцефалит, невриты и парезы различной локализации. Эти заболевания чаще встречаются у детей, преимущественно раннего возраста [16]. По данным литературы, от 18 до 31% внутриутробных поражений центральной нервной системы обусловлены энтеровирусами. В настоящее время доказано, что энтеровирусы обладают способностью к персистенции в эндоте-лиальных клетках сосудов, в лимфатической системе, а при передаче трансплацентарным путем вызывают пороки развития [3; 12].
Энтеровирусные инфекции характеризуются значительным полиморфизмом клинической картины. Один и тот же энтерови-рус может обусловливать несколько клинических синдромов, и каждый из свойственных этому заболеванию синдромов может вызываться различными энтеровирусами [13; 14]. Исключения составляют вирусы полиомиели-
та, вызывающие классическую картину данного заболевания, и вирусы Коксаки В, которые значительно чаще, чем другие, являются возбудителями миокардитов и панкреатитов. Исследования, посвященные молекулярно-генетическому типированию энтеровирусов, изучению их свойств, особенностям эпидемической циркуляции, единичны и фрагментарны. Отличительными особенностями энтеровирусов являются выраженная генетическая вариабельность и изменчивость [9; 11]. Для них характерны гетерогенность популяций, возможность образования различных мутантов и генетических рекомбинантов, существование дефектных интерферирующих частиц, а также появление новых патогенных серотипов, таких как энтеровирусы 70-го и 71-го типов [7; 10; 17]. Энтеровирусы, посе-зонно сменяя друг друга, поддерживают у населения высокий уровень эндемичности и могут вызывать не только спорадические случаи заболеваний, но и эпидемии, захватывающие целые континенты [20—23]. Однако причины таких эпидемических особенностей, а также факторы, обусловливающие цикличность инфекции, ее региональный пейзаж, до настоящего времени не изучены. Не уточнены причины вспышек энтеровирусных менингитов, характерных для Северо-Западного и других регионов, как у взрослых, так и у детей. Неясно, чем обусловлены разная степень их тяжести, а также выраженность ин-тратекальных поражений.
Цель данного исследования — изучение эпидемиологических особенностей энтеровирусов, циркулирующих в Северо-Западном регионе.
Материалы и методы
Под вирусологическим наблюдением находились 894 ребенка и 235 взрослых с диагнозами «серозный менингит» и «острый вялый парез». В исследование были включены различные биологические материалы детей (фекалии — 1005 образцов, 925 сывороток крови и 207 образцов цереброспинальной жидкости), поступающих в клинику ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России в отделение нейроинфекций и органической патологии и отделение реанимации и интенсивной терапии. Аналогично обследовался взрослый
контингент, находящийся на лечении в стационаре Городской инфекционной больницы им. С.П. Боткина.
У всех госпитализированные пациентов энтеровирусы выявляли путем разработанного авторского экспресс-теста, основанного на количественной реакции связывания комплемента с конечным ферментным тестированием в жидкой фазе. Этот тест позволяет определять в исследуемых биологических пробах наличие энтеровирусных антигенов и устанавливать серотип возбудителя [2; 15; 18].
Наряду с авторской разработкой применяли классический метод выделения и идентификации энтеровирусов на типоспеци-фической культуре клеток. Типовую принадлежность вирусов определяли в реакциях с иммунными сыворотками против эталонных штаммов энтеровирусов, используя реакцию нейтрализации [8]. Достоверность совпадений наличия антигенов энтеровирусов, выявляемых в обследуемых биологических пробах у больных экспресс-тестом м-РСК и классическими вирусологическими методами с применением культуры ткани, устанавливали с использованием статистических программ в Microsoft Excel Windows 1997.
Оценку Rct-маркеров проводили классическим методом по соотношению титра накопленного в культуре ткани вируса при 40°С или 28°С к его титру при 37°С [15].
Интерфероновый статус больных (определение альфа- и гамма-интерферона в 184 сыворотках крови) изучали по методу N.B. Finter [19] и модифицированному методу О.А. Аксёнова [1].
Эпидемиологический мониторинг предусматривал непрерывное наблюдение за обследуемым контингентом больных в СевероЗападном регионе в течение 40-летнего периода с полной вирусологической диагностикой биологических материалов от этих пациентов.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе вирусологического обследования госпитализированных больных было установлено, что характеристика степени доминирования энтеровирусов зависела от чис-
ла выделенных вирусов и процента выделения каждого из общего пула штаммов. Так, выделение энтеровирусов от 25 до 30% считалось умеренной степенью доминирования, от 30 до 40% — средней, выше 40% — высокой. Дополнительно были определены две группы вирусов: доминирующие и сопутствующие. Доминирующие вирусы получили свое название как наиболее часто встречающиеся в определенный временной период; частота их выявления превышала 25% всех выделенных серотипов, они были этиологически значимыми в возникновении вспышек данных нозологических форм. Сопутствующие энтеровирусы быши так условно названы в связи с тем, что встречаемость их не превышала 8—10%; данные вирусы не вызывали подъема заболеваемости у населения и встречались лишь у отдельных больных. Большинство обнаруженных доминирующих энтеровирусов на протяжении всего времени наблюдения встречались неоднократно с определенной закономерностью.
Благодаря полученным данным в результате использования м-РСК быша прослежена цикличность циркуляции энтеровирусов группы ECHO (рисунок).
В период с 1973 по 1982 г. доминирующими были серотипы вируса ECHO 4, 6, и 14. Встречаясь в виде моно- или микст-инфекции и чередуясь между собой, они определили первый цикл циркуляции со степенью доминирования, варьирующей от 27 до 36%. В период с 1983 по 1989 г. прослеживался второй цикл — период циркуляции серотипа 30 вируса ECHO с показателем доминантности 44,4%. В 1990 г. вновь была установлена циркуляция энтеровируса ECHO серотипа 4, не появлявшегося до этого в течение 10 лет, однако с низкой степенью доминирования. В период с 1990 по 1997 г. отмечалось увеличение обнаруженных серотипов от 18 до 29 без основного доминирующего типа вируса.
Следует отметить, что с 1997 г. начал регистрироваться новый цикл циркуляции энтеровирусов с преобладанием энтеро-вируса 71-го типа, который впервые появился в нашем регионе в 1990-е годы. К 2000 г. он прочно завоевал главенствующее положение с максимальной степенью доминантности (42,1%), что было характерно вплоть до
1973
1975 1977 1979
7
1981 1983
1985
Polietiological
Entero 68-71
/ / У /
Entero Entero
68-71 68-71
ECH0-20 ECH0-30
ECHO-30,11 Entero 69
1987 1989 1991
^-
:но-б,11,зо
Entero-69 Koks В 5,6
/
1993 1995
1997 2000
2002 2005 2006 2007 2009 2011
2013
2014
2015 2016
Пейзажная картина доминирующих энтеровирусов, циркулирующих в Северо-Западном регионе
с 1973 по 2016 г.
2002 г. С 2003 г. чаще отмечалась циркуляция вирусов группы ECHO, преимущественно ECHO 30-го типа с частотой доминантности 37%. Дополнительно в пейзажной картине энтеровирусов Северо-Западного региона появился вирус ECHO 6-го типа, доминировавший в конце 1970-х — начале 1980-х годов и встречавшийся в единичных случаях в полиэтиологичный период 1991 — 1997 гг. В 2005 г. энтеровирус ECHO 6-го типа переместился на третье место, после ECHO-30 и энтеро-71, а к 2009 г. ECHO-6 занял лидирующую позицию. В 2013 г. на положение доминирующих вирусов вышли энте-ро-68,69, а вирусы, циркулировавшие ранее, — в разряд сопутствующих. Данная картина циркуляции сохраняется и на современном этапе (2015—2016 гг.) с доминированием вирусов ECHO 6-го, 11-го типов и энтеровируса 69-го типа.
В ходе проведенного исследования нами дополнительно изучались этапы циркуляции энтеровирусов 70-го и 71-го типов от-
дельно как у детей, так и у взрослых. Было установлено, что к середине 1990-х годов у взрослого населения эти энтеровирусы были доминирующими со степенью доминантности до 27%, но к концу 1990-х годов частота их обнаружения достоверно снизилась до 15% и к 2004 г. составила лишь 1—2% (р<0,05). У детей в этот же период времени, напротив, отмечалась низкая частота доминирования данных вирусов (8—19%), но к началу 2000 г. частота доминирования достигла максимума и колебалась от 20 до 32% среди различных типов энтеровирусов. Аналогичная взаимосвязь была выявлена и в отношении энтеровирусов ECHO серотипов 30 и 6. Не исключено, что энтеровирусы, циркулировавшие в Санкт-Петербурге, первоначально инфицировали взрослую популяцию и только после этого становились этиологически значимыми для детского населения. Такой «переход» энтеровирусов из одной возрастной категории в другую в среднем занимал период от 2 до 4 лет.
Благодаря вирусологическому изучению доминирующих энтеровирусов, выделенных от детей с серозным менингитом (п=300), с исследованием характеристики репродукции на различных пассажах и размножению их при разных температурных режимах инкубации (Rct-маркер) установлено, что все доминирующие вирусы выделялись на тканевых культурах практически уже на первом пассаже, частота их выделения — от 80 до 86%.
При изучении активности размножения некоторых серотипов доминирующих вирусов, относящихся к группам ECHO и энтеро, выделенных в различные годы при различных температурных режимах инкубации, было установлено, что они усиленно репродуцировались при 40°С, но наиболее отчетливо этот эффект проявлялся у вируса ECHO-11/85. Данный вирус репродуцировался при температуре 40°С до титра 5,6 lg ТЦПД50, а при 28°С его титр резко падал и не превышал 1,2 lg ТЦПД50. Показатель Rct40 для него составил 1,3 относительных единиц (о.е.), а Rct28 — только 0,28 о.е. Вирусы группы ECH0-30/83, также взятые в начале эпидемической волны, по своей репродукционной активности так существенно не разнились при снижении температуры инкубации. При 40°С они накапливались до 5,1 lg ТЦПД50, при 37°С - до 3,82, а при 28°С - до 2,9 lg ТЦПД50, таким образом, показатель Rct40 соответственно был равен 1,34 о.е. и Rct28 — 0,76 о.е.
Аналогичные серотипы ECH0-30/89, выделенные на 5 лет позже (по окончании цикла доминантности), характеризовались относительно большей репродукцией при температуре 28°С, чем при температуре 40°С, в сравнении со своими предшественниками. Активность их при всех температурных режимах инкубации была приблизительно с одинаковыми показателями - Rct40 и Rct28 были в пределах единицы. Таким образом, можно предположить, что в самом начале цикла доминантности пик репродуктивной активности имел место при температуре 40°С, а по окончании этого цикла активность вируса падала и репликация происходила уже при пониженной температуре.
При изучении сопутствующих вирусов было показано, что по сравнению с домини-
рующими они выделялись на первом пассаже лишь в 37% случаев, а остальные обнаруживались при проведении последующих пассажей. При изучении активности размножения сопутствующих вирусов других сероти-пов, относящихся к группам ECHO, Коксаки и энтеро, было установлено, что их репродукционная активность при 37°С не превышала 3,2 lg ТЦПД50 и резко снижалась при 40°С. Rct40 у этих штаммов был в пределах 0,5—0,7 о.е. В то же время при температуре инкубации 28°С титр их существенно не отличался от 37°С, и Rct28 был в пределах 0,60-0,90 о.е.
Таким образом, параллельное изучение доминирующих и сопутствующих групп эн-теровирусов дало возможность четко дифференцировать их по способности размножаться при различной температуре, поскольку вирусы, имеющие показатель Rct40>1, могли быть отнесены к доминирующим, тогда как при уменьшении этого показателя — к сопутствующим.
При сопоставлении данных выявления доминирующих энтеровирусов с окончательными диагнозами обследованных пациентов было установлено, что энтеровиру-сы адаптировались к нервной ткани, и вызванные ими заболевания характеризовались тяжелой клинической картиной. Данные позволили предположить, что доминирующие вирусы с годами приобрели нейровирулент-ные и терморезистентные свойства, и их попадание в ЦНС может происходить непосредственно из носовой полости по обонятельным путям в мозг, минуя желудочно-кишечный тракт. Сопутствующие вирусы, вызывающие серозные менингиты у детей, никогда не вызывали эпидемических подъемов заболеваемости, а повышение температуры больного, особенно в первые дни болезни, существенно снижало их репродукционные возможности. Заболевания, вызываемые этими штаммами, протекали достаточно легко и заканчивались достаточно быстро.
Доминирующие вирусы до 86,3% выделялись уже на первом пассаже, имели высокий титр, доходящий до 5,3 lg ТЦПД50, отношение показателя Rct40 к Rct28 было в пределах 1,94. Данные штаммы обладали низкой продукцией интерферона в организме
больного и высокой интерферонорезистент-ностью, что свидетельствовало о высокой вирулентности циркулирующих вирусов.
В отличие от доминирующих, сопутствующие вирусы имели более умеренные показатели, начиная с выделения их при первом пассаже и заканчивая их интерфероно-резистентностью.
Заключение
Проведенное более чем 40-летнее слежение за циркулирующими патогенными штаммами энтеровирусов в Северо-Западном регионе подтверждает имеющиеся сведения об их цикличности. Разработанный в ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России ускоренный тест выявления энтеровирусных антигенов у больных (м-РСК) с последующим подтверждением полученных результатов в классическом тесте позволяет проводить быструю идентификацию энтеровирусных патогенов. Экспресс-диагностика энтеровирусных инфекций дает возможность осуществлять непрерывный мониторинг за циркулирующими энтеровирусами в регионе и выявлять сменность доминирующих и не доминирующих серотипов энтеровирусов, а также характеризовать свойства, определяющие степень их вирулентности в эпидемическом процессе. К вирусологическим характеристикам, определяющим степень вирулентности и доминирования, следует относить и способность репродукции энтеровирусов при различных режимах инкубации. Доминирующие вирусы достигают максимальной репродукционной активности при температуре 40°С (Ие140>1,0), тогда как сопутствующие характеризуются выраженной репродукционной активностью при снижении температуры до 37°С (Иег40<1,0).
Чувствительность к интерферону является значимым фактором в защите организма от энтеровирусной диссеминации. Доминирующие энтеровирусы имеют высокую устойчивость к интерферону, что дает им возможность усиленно репродуцироваться внутри клетки и легко распространяться по организму больного, приводя к усугублению заболевания, в то время как сопутствующие штаммы, вырабатывающие интерферон в высоких концентрациях, обусловливают более
легкое течение болезни. Эпидемиологическая закономерность циркулирующих энтеровиру-сов в Северо-Западном регионе проявляется первоначально в появлении доминирующих серотипов у взрослого населения, затем приобретая этиологическую значимость спустя 2—4 года среди детского населения.
Литература
1. Аксенов O.A., Мурина Е.А. Способ индикации интерферона в биологических пробах: Патент на изобретение № 2093179 от 07.10.97.
2. Аксенов O.A., Осипова З.А., Мурина Е.А. Способ иммунологической экспресс-диагностики энтеровирусных инфекций: Патент на изобретение № 2034025 от 30.04.95.
3. Анджапаридзе О.Г., Богомолова H.H., Борискин Ю.С. Персистенция вирусов. М.: Медицина, 1984.
4. Бадалян Л.О. Детская неврология: Учебник. М.: Медицина, 1984.
5. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К. Этиология хронических вирусных нейроинфек-ций. М.: Медицина, 1984.
6. Болезни нервной системы: Рук-во для врачей / Под ред. H.H. Яхно, Д.Р. Штульма-на, П.В. Мельничука. М.: Медицина, 1995.
7. Вайтович М.А., Рейнгольд И.И., Змейко-ва Т.Г. и др. Анализ многолетних результатов лабораторного контроля в системе эпиднадзора за полиомиелитом и другими энтеровирусными инфекциями в Омске (1986—1997 гг.) // Здоровье населения и среда обитания. 1998. № 3—4. Прил. Ч. 2. С. 12-14.
8. Ворошилова М.К., Жевандрова В. И., Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М.: Медицина, 1964.
9. Жданов В.М. Эволюция вирусов. М.: Медицина, 1990.
10. Иванова В.В., Сорокина М.Н., Скрипчен-ко Н.В. Клиника, диагностика и лечение полиомиелита у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1997. № 1. С. 61-67.
11. Королева Г.А., Грачева Л.А., Ворошилова М.К. Выделение энтеровируса 71 типа
от больных с полиомиелитоподобным заболеванием во время вспышки в Болгарии // Вопросы вирусологии. 1978. № 5. С. 611—618.
12. Лебедев Б. В., Барашнев Ю.И., Якунин Ю.А. Невропатология раннего детского возраста: Руководство для врачей. Л.: Медицина, 1981.
13. Лобзин Ю.В. Современные концепции терапии инфекционных больных: Тезисы докладов. СПБ.: Медико-биологический конгресс, 1997.
14. Марченко В.И., Ильинский Ю.А., Попов В.Н. Диагностика энтеровирусной инфекции // Советская медицина. 1986. № 4. С. 101—103.
15. Мурина Е.А. Характеристика вирулентных серотипов энтеровирусов и их роль в генезе серозных менингитов и острых вялых параличей: Автореф. дисс. ... д-ра биол. наук. СПб., 2002.
16. Наркевич М.И., Онищенко Г.Г. Состояние инфекционной заболеваемости в СССР в 1990 г. // Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1991. № 9. С. 20—25.
17. Резник В.И., Пороскокова М.А., Климко-вич Н.М. и др. Эпиднадзор за энтерови-русными инфекциями / / Вирусные инфекции / Свердловский НИИ вирусных инфекций. Свердловск, 1991. С. 36—40.
18. Сорокина М.Н., Скрипченко Н.В. Вирусные энцефалиты и менингиты у детей: Руководство для врачей / Под ред. М.Н. Сорокиной. М.: Медицина, 2004.
19. Finter N.B. Interferon assays: Sensitivity and other aspects // The interferons / Ed. by G. Rita. New York, 1968. P. 203-212.
20.Kono R., Miyamyra K., Yamazaki S. et al. Seroepidemiologic studies of acute hemora-hagic conjunctivitis virus (enterovirus type 70) in West Africa. II. Studies with human sera collected in West African countries other than Chana // American Journal of Epidemiology. 1981. No. 2. P. 274-283.
21. Matsuura K., Hasegawa S., Nakayama T. et al. Epidemiological studies on Echovirus type 18 infection in Toyama Prefecture // Microbiology and Immunology. 1983. No. 4. P. 359-368.
22.Miyamura K., Yamashita K., Yamadera S. et al. An epidemic of echovirus 18 in 1988 in Japan - high association with clinical manifestation of exanthem. A report of the National Epidemiological Surveillance of Infectious Agents in Japan // Japan Journal of Medical Science and Biology. 1990. Vol. 43. No. 2. P. 51-58.
23. Morens D.M., Zweighaft R.M., Bryan J.M. Non-polio enterovirus disease in United States, 1971-1975 // International Journal of Epidemiology. 1979. Vol. 8. No. 1. P. 49-54.
Контакты:
Мурина Елена Александровна, ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России, заведующая отделом вирусологии и молекулярно-биологических методов исследования; доктор биологических наук. Тел. раб.: 8 (812) 234 07 40. E-mail: [email protected]
